第三章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具（課前+課中+課后，三案一體）課前案【預(yù)習(xí)新知】一、基因工程的概念二、基因工程操作的基本工具1.限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”2.DNA連接酶——“分子縫合針”3.載體——“分子運(yùn)輸車”三、DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)原理（1）不溶于酒精，但某些溶于酒精。利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于的NaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)，因此二苯胺試劑可作為鑒定DNA的試劑。2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL，充分研磨。（2）在漏斗上墊上紗布，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。（3）在上清液中加入體積相等的、溶液，靜置23min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或在1000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物晾干。（4）DNA的鑒定：取兩支20mL的試管，各加入的NaCl溶液5mL。將溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化?！绢A(yù)習(xí)自測(cè)】1.限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。（）2.限制酶只能用于切割目的基因。（）3.限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。（）4.將制備的含有DNA的濾液加入預(yù)冷的95%酒精溶液，靜置23min，可以將DNA析出。（）5.在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，將絲狀物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色。（）第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具課中案【導(dǎo)】番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲，當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？科學(xué)家用到了限制酶、DNA連接酶、載體等“分子工具”。限制酶能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并將DNA雙鏈切斷，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的形成，即催化一個(gè)DNA片段3'端的羥基與另ー個(gè)DNA片段5'端的磷酸基團(tuán)上的羥基連接起來(lái)形成酯鍵。載體上可以插入外源基因，它能攜帶該基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或者整合到受體DNA上，隨著受體DNA同步復(fù)制。載體一般還帶有標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組DNA分子的篩選?！舅肌?.重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是什么？它們的作用分別是什么？2.基因工程載體需要具備什么條件？【議】1.你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？2.DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？3.閱讀課本73頁(yè)思考討論“重組DNA分子”的資料，，剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？4.質(zhì)粒作為載體應(yīng)該具備的條件有哪些？具備這些條件有什么意義？5.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？【展】學(xué)生展示討論結(jié)果【評(píng)】與DNA分子相關(guān)的酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二脂鍵DNA形成帶黏性末端或平末端的DNA片段DNA連接酶磷酸二脂鍵DNA片段形成重組DNA分子DNA聚合酶磷酸二脂鍵脫氧核苷酸以單鏈DNA為模板，將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端，形成子代DNADNA水解酶磷酸二脂鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈RNA聚合酶核糖核苷酸核糖核苷酸以單鏈DNA為模板，將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈末端，形成單鏈RNA【檢】引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)本節(jié)課內(nèi)容【練】完成課后案第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具課后案1．下列關(guān)于DNA的粗提取和PCR的敘述，錯(cuò)誤的是（

）A．魚(yú)的精巢中DNA含量較高，可作為DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料B．DNA粗提取實(shí)驗(yàn)的研磨液中含有抑制DNA酶的物質(zhì)C．可用二苯胺鑒定PCR獲得的DNA分子的特定核苷酸序列D．PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2+2．Holliday模型是同源染色體間基因重組的模型，揭示了交叉互換的分子機(jī)制。其過(guò)程是：①在四分體的兩個(gè)非姐妹DNA的相應(yīng)位點(diǎn)上，分別切割每個(gè)DNA的一條鏈，形成四個(gè)斷裂點(diǎn)，②不同的斷裂點(diǎn)間交互連接，形成被稱為Holliday連接體的交聯(lián)體，③Holliday連接體左右移動(dòng)、交聯(lián)體旋轉(zhuǎn)、隨機(jī)切割、缺口連接等。下列分析錯(cuò)誤的是（

）A．Holliday連接體的觀察，應(yīng)選減數(shù)第一次分裂前期的細(xì)胞B．Holliday模型揭示的分子交叉互換的結(jié)果，可以借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察C．同源染色體間交叉互換的完成，離不開(kāi)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用D．同源染色體非姐妹DNA間的交叉互換，為有性生殖生物的進(jìn)化提供了豐富的原材料3．CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA（SgRNA）和Cas9蛋白兩部分組成，SgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白到特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，其機(jī)制如圖所示。下列說(shuō)法正確的是（）A．Cas9蛋白相當(dāng)于限制酶，切割特定基因位點(diǎn)的脫氧核糖和堿基之間的化學(xué)鍵B．向?qū)NA可以在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸C．CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有時(shí)會(huì)因SgRNA錯(cuò)誤結(jié)合而出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，一般SgRNA序列越長(zhǎng)，脫靶率越低D．對(duì)不同目