應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立MMP-9基因沉默胃癌細(xì)胞克隆的綜述報(bào)告RNA干擾技術(shù)是一種高效的基因沉默技術(shù)，其通過(guò)特異性地降解目標(biāo)mRNA分子，從而抑制該基因的表達(dá)。在胃癌研究領(lǐng)域中，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其中MMP-9基因沉默是研究胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。本文旨在介紹RNA干擾技術(shù)在建立MMP-9基因沉默胃癌細(xì)胞克隆中的應(yīng)用現(xiàn)狀、方法流程與關(guān)鍵技術(shù)等。一、RNA干擾技術(shù)概述RNA干擾技術(shù)是通過(guò)體內(nèi)或體外遞送特定的RNA分子，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。本質(zhì)上，RNA干擾技術(shù)將外源RNA分子沿用了天然RNA的降解途徑，將外源RNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，利用RNA蛋白酶III在體內(nèi)將RNA分子轉(zhuǎn)化為雙鏈RNA（dsRNA），dsRNA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)之后，被核酸酶Dicer切割成21-23nt的小RNA，稱為小干擾RNA（siRNA）。采用RNA干擾技術(shù)能夠快速、便捷、有效地抑制靶點(diǎn)基因的表達(dá)，是分子生物學(xué)研究中常用的工具之一。二、MMP-9基因介紹MMP-9全稱為MatrixMetalloproteinase-9，是一類具有結(jié)構(gòu)特殊性和酶活性的蛋白酶。它的基因在人類基因組中位于20號(hào)染色體q11.2-q13.1，由14個(gè)外顯子組成，編碼一種分子量為78kDa的蛋白質(zhì)。MMP-9是一種Zn2+依賴性的膠原酶蛋白酶，具有明顯的基質(zhì)降解作用，能夠水解膠原、凝血蛋白、纖維蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。三、RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)MMP-9基因沉默MMP-9基因在胃癌轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，而RNA干擾技術(shù)可通過(guò)特異性地沉默MMP-9基因表達(dá)，來(lái)研究其生物學(xué)功能及其參與的轉(zhuǎn)移和侵襲機(jī)制。1.設(shè)計(jì)和合成siRNAsiRNA是RNA干擾技術(shù)生效的關(guān)鍵內(nèi)容。通過(guò)合成一段siRNA序列，使其與要靶向沉默的基因的mRNA特異性雜交，從而導(dǎo)致目標(biāo)mRNA降解，siRNA的引物設(shè)計(jì)包括雜交靶點(diǎn)、雜交位點(diǎn)、間隔序列和密碼子。RNAi設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是確定一條最合適的siRNA序列，通常根據(jù)目標(biāo)gene的序列選擇能夠在接近5'端的區(qū)域內(nèi)識(shí)別其mRNA的siRNA序列。對(duì)于MMP-9基因而言，我們通?？梢愿鶕?jù)GenBank公布的序列，使用開(kāi)放式在線工具進(jìn)行siRNA提取。2.構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒目前的siRNA轉(zhuǎn)染途徑主要有兩種:一種是將siRNA通過(guò)合成物的形式直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞,另一種方法是將siRNA構(gòu)建在RNA干擾質(zhì)粒上。RNA干擾質(zhì)粒一般是由一段酶切啟動(dòng)序列、RNA干擾序列和酶切終止序列等元素組成的。在制備RNA干擾質(zhì)粒時(shí)，需要考慮siRNA序列的定向、長(zhǎng)度以及GC含量等，并對(duì)其進(jìn)行序列改編、克隆、擴(kuò)增等一系列工作。3.siRNA的轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)中，采用純化的siRNA直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，有時(shí)轉(zhuǎn)染效率較低，只能實(shí)現(xiàn)臨時(shí)性基因沉默，并不能持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，因此，siRNA轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是選擇高轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染試劑。經(jīng)過(guò)一定的優(yōu)化和篩選，可以選用某些經(jīng)典的轉(zhuǎn)染試劑，如LipofectamineTM、RNAiMAX、HiPerFect等。四、RNA干擾技術(shù)在MMP-9基因沉默中的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究不同類型的腫瘤，而MMP-9的表達(dá)和腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。Turchi等人使用RNA干擾技術(shù)探究MMP-9發(fā)揮胃癌發(fā)展及形成新的腫瘤微環(huán)境中的作用、以及細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制，通過(guò)RNAi技術(shù)沉默MMP-9表達(dá)，使得細(xì)胞減少了在特異性基質(zhì)中遷移和侵襲的能力,從而證實(shí)了MMP-9在細(xì)胞侵襲和遷移中發(fā)揮了重要的作用。此外，還有一些相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默MMP-9基因，并在體內(nèi)體外驗(yàn)證了沉默的作用，發(fā)現(xiàn)MMP-9基因的沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等都具有顯著的影響。綜上所述，雖然RNA干擾技術(shù)在MMP-9基因沉默的研究中也面臨一些不可避免的問(wèn)題，比如待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染的藥劑等需要針對(duì)不同