項(xiàng)目三人干擾素α2b的生產(chǎn)任務(wù)三人干擾素α2b包涵體的處理配制溶液，抽提包涵體，復(fù)性人干擾素α2b，超濾復(fù)性溶液，制得有活性的人干擾素α2b料液。規(guī)范填寫生產(chǎn)記錄。任務(wù)學(xué)習(xí)路徑見思維導(dǎo)圖。任務(wù)描述人干擾素α2b包涵體的處理2任務(wù)支撐（一）處理包涵體的目的與作用包涵體是外源基因在大腸埃希菌等原核細(xì)胞中高效表達(dá)，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒。包涵體是非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體，以非折疊狀態(tài)存在，不具有生物學(xué)活性。本任務(wù)以可逆性變性劑鹽酸胍和還原劑二硫蘇糖醇抽提包涵體，使人干擾素α2b溶解。再加入帶有氧化性谷胱甘肽的復(fù)性緩沖液，稀釋變性劑和還原劑后，人干擾素α2b從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)。超濾去除變性劑和還原劑，得有活性的人干擾素α2b。包涵體（主要位于細(xì)胞質(zhì)）人干擾素α2b包涵體的處理3（二）包涵體的處理41.分離可采用離心法將包涵體從細(xì)胞破碎后的料液中分離，條件為5000～20000r/min離心15min，也可以采用過濾法分離。2.洗滌膜蛋白或膜碎片與包涵體粘連，需要洗滌去除。通常用含低濃度變性劑（如2mol/L尿素）和10mmol/LEDTA的50mmol/LTrispH7.0～8.5洗滌，也可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除。離心收集的包涵體（二）包涵體的處理53.溶解可逆性變性劑：尿素和鹽酸胍等

通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白質(zhì)間的氫鍵而增加溶其溶解度。

尿素用量為8mol/L、鹽酸胍用量為6～8mol/L。去垢劑：陰離子去垢劑SDS等

破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，增溶幾乎所有的蛋白，但是由于SDS難以徹底去除而不可在藥品生產(chǎn)中使用。還原劑：β-巰基乙醇（BME）和二硫蘇糖醇（DTT）等

含有二硫鍵蛋白質(zhì)的包涵體時(shí)，用于破壞二硫鍵。β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇一般使用濃度為20～100mmol/L（二）包涵體的處理64.復(fù)性緩慢去除變性劑和還原劑等，使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，去除還原劑使二硫鍵正常形成。尿素濃度4mol/L左右時(shí)復(fù)性開始，到2mol/L左右時(shí)結(jié)束。鹽酸胍濃度為4mol/L時(shí)開始復(fù)性，到1.5mol/L時(shí)結(jié)束。復(fù)性效率的影響因素：復(fù)性的方法，蛋白質(zhì)的濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度，以及是否存在共溶劑（如PEG6000-20000）和其他添加劑等因素影響。包涵體復(fù)性的歷程變性的蛋白質(zhì)復(fù)性中的蛋白質(zhì)復(fù)性后有活性的蛋白質(zhì)（二）包涵體的處理7（二）包涵體的處理84.復(fù)性

復(fù)性常用的方法如下：（1）超濾復(fù)性。適用于大規(guī)模生產(chǎn)并易于控制稀釋的速度，但超濾中可能發(fā)生不可逆的變性。（2）層析法復(fù)性凝膠層析：大小不同物質(zhì)間分離，變性蛋白質(zhì)所處環(huán)境中變性劑濃度逐漸降低，會(huì)自發(fā)地向熱力學(xué)穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)復(fù)性。疏水層析：利用蛋白疏水性氨基酸殘基與固定相表面疏水配基之間的疏水相互作用，蛋白質(zhì)疏水區(qū)被瞬間結(jié)合，降低蛋白質(zhì)聚集，有利于從疏水核心開始的折疊并在柱上完成復(fù)性。由于正確折疊與未折疊、錯(cuò)誤折疊結(jié)構(gòu)的疏水性不同，疏水層析復(fù)性可以得到高純度的正確結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，規(guī)模放大仍可得到較高得率和純度。（3）稀釋復(fù)性。直接加入水或緩沖液，放置過夜。體積增加較大。（4）透析復(fù)性?？赡苄纬沙恋恚⑶也贿m合放大應(yīng)用于生產(chǎn)。（三）膜分離技術(shù)9膜分離技術(shù)以選擇性透過膜（半透膜）為分離介質(zhì)。當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動(dòng)力（如壓力差、濃度差、電位差等）時(shí)，料液組分選擇性地透過膜，以達(dá)到分離、提純目的。1.膜分離技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）無相變發(fā)生，能耗低；（2）無外加物質(zhì)，節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境；（3）分離與濃縮同時(shí)進(jìn)行，大大提高效率；（4）條件溫和，適于熱敏性物質(zhì)的分離、濃縮；（5）設(shè)備簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，易控制、易放大；（6）適用微粒范圍廣泛，不僅適用于從細(xì)菌、病毒到有機(jī)物或無機(jī)物的分離，而且還適用于特殊溶液體系的分離，如共沸物的分離。

膜強(qiáng)度較差，使用壽命不長(zhǎng)，易于污染

用于培養(yǎng)基除菌過濾和發(fā)酵無菌通氣、細(xì)胞菌體收集、細(xì)胞菌體裂解液澄清、包涵體中空纖維收集/洗滌、蛋白質(zhì)超濾復(fù)性、超濾濃縮/緩沖液置換、終產(chǎn)品超濾濃縮制劑和終產(chǎn)品除菌過濾等（三）膜分離技術(shù)102.膜分離技術(shù)分離機(jī)理膜分離過程的實(shí)質(zhì)是大小不同的物質(zhì)透過膜的能力和傳遞速度不同。有的物質(zhì)能透過膜而有的不能透過；有的透過得快而有的透過得慢，使得膜兩側(cè)溶液組成不同，物質(zhì)間實(shí)現(xiàn)分離。主要原理：篩分理論溶解-擴(kuò)散理論唐南平衡模型優(yōu)先吸附-毛細(xì)孔流動(dòng)理論（三）膜分離技術(shù)113.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)分離類型推動(dòng)力透過物質(zhì)截留物質(zhì)應(yīng)

用微濾壓力差溶劑、溶解物等微粒、細(xì)菌料液澄清、除菌超濾壓力差溶劑、離子、抗生物、有機(jī)小分子破碎細(xì)胞、微粒，蛋白質(zhì)、膠體等大分子大分子物質(zhì)的濃縮或去除、分離納濾壓力差溶劑、可溶性無機(jī)鹽等單糖、氨基酸等可溶性有機(jī)小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)濃縮、分離，料液脫鹽，純水制備反滲透壓力差溶劑等各類溶解性物質(zhì)超純水制備透析濃度差低分子量物、鹽離子大分子物醫(yī)療透析電滲析電位電解質(zhì)（有機(jī)、無機(jī)）離子非離子化合物，大分子物質(zhì)純水制備123.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)

以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力差為推動(dòng)力，依據(jù)分子大小的差異將不溶性粒子（0.1-10um）分離的操作。操作壓力0.05-0.5MPa。（1）微濾133.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（1）微濾微濾技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域（1）微粒和細(xì)菌的過濾。水的高度凈化、食品和飲料的除菌、藥液的過濾、發(fā)酵工業(yè)的空氣凈化和除菌等。（2）微粒和細(xì)菌的檢測(cè)。微孔膜可作為微粒和細(xì)菌的富集器，從而進(jìn)行微粒和細(xì)菌含量的測(cè)定。（3）氣體、溶液和水的凈化。大氣中懸浮的塵埃、纖維、花粉、細(xì)菌等；溶液和水中存在的微小顆粒和微生物。（4）食糖與酒類的精制。微孔膜對(duì)食糖溶液和酒類過濾，除菌除雜，提高食糖的純度和酒類的清澈度，延長(zhǎng)存放期。（5）藥物的除菌和除微粒。一些液態(tài)藥物，如注射液、眼藥水等，必須采用微濾技術(shù)。143.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（2）超濾

以壓力差為推動(dòng)力，利用超濾膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)液體中溶質(zhì)進(jìn)行選擇性分離的物理篩分過程。截留分子0.01~0.1μm，操作壓0.2-0.6MPa。15蛋白質(zhì)溶液超濾過程示意圖恒流泵平板式超濾膜△P出背壓閥△P進(jìn)透出液截留液3.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（2）超濾超濾的應(yīng)用蛋白、酶、DNA的濃縮脫鹽/純化清洗細(xì)胞、純化病毒除病毒、熱源163.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（3）納濾通過納濾膜的選擇透過作用，以壓力差為推動(dòng)力實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離(0.1-1nm)分離納米級(jí)粒徑，分離范圍介于反滲透和超濾之間，能截留透過超濾膜的那部分有機(jī)小分子，透過無機(jī)鹽和水。小分子量的有機(jī)物質(zhì)的分離；有機(jī)物與小分子無機(jī)物的分離；溶液中一價(jià)鹽類與二價(jià)或多價(jià)鹽類的分離；抗生素和維生素的濃縮和純化超純水的制備納濾的應(yīng)用173.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（4）反滲透

利用反滲透膜選擇透過性，以膜兩側(cè)壓力差（靜壓差）為推動(dòng)力，對(duì)液體混合物進(jìn)行分離的過程。操作壓差一般1.5～10.5MPa，截留組分為小分子物質(zhì)。183.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（4）反滲透+壓力193.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（4）反滲透

反滲透工業(yè)應(yīng)用海水和苦咸水脫鹽制飲用水制備醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)的超純水用于處理重金屬廢水用于濃縮過程海水凈化方案203.膜分離技術(shù)分類（三）膜分離技術(shù)（5）透析利用親水膜，以濃度差為推動(dòng)力，使高分子溶液中的小分子溶質(zhì)（如無機(jī)鹽）透過膜向水滲透的過程。無機(jī)鹽緩沖液蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽脫鹽、去除變性劑、還原劑之類的小分子雜質(zhì)；置換樣品緩沖液；在臨床上常用于腎衰竭患者的血液透析。注意：透析袋中需保留足夠脹大空間透析的應(yīng)用214.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（1）膜的分類

根據(jù)相態(tài)：固態(tài)膜和液態(tài)膜根據(jù)斷面形態(tài)結(jié)構(gòu)：對(duì)稱膜、非對(duì)稱膜和復(fù)合膜以膜的材料種類：有機(jī)膜和無機(jī)膜（2）膜的性能膜傳質(zhì)需具備較好的選擇透過性，可以使流體相中的一種或幾種物質(zhì)透過，而不允許其他物質(zhì)透過，從而充分截留一些組分，又能最大限度地使另一組分快速透過。膜材料需要具有以下特性：具化學(xué)相容性生物相容性成本低耐壓耐高溫耐酸堿224.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（3）表征膜性能的參數(shù)

主要有描述孔道特征的膜孔性能參數(shù)（孔徑、孔徑分布和孔隙度等）、截留率和截留相對(duì)分子質(zhì)量（MWCO）、滲透通量（J）等。①描述孔道特征的膜孔性能參數(shù)孔徑大小主要有最大孔徑和平均孔徑兩個(gè)參數(shù)。孔徑分布是指膜中一定大小的孔占整個(gè)孔的體積分?jǐn)?shù)。孔徑分布的數(shù)值越大，說明孔徑分布較窄，膜的分離選擇性好?？紫堵适侵溉磕た姿寄さ捏w積分?jǐn)?shù)?？紫堵实臄?shù)值越大，流動(dòng)阻力越小，但膜的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)降低。234.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（3）表征膜性能的參數(shù)

②截留率（σ）和截留相對(duì)分子質(zhì)量σ：指對(duì)一定相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)，膜能截流的程度。影響膜截留性能的因素：分子大小、分子的結(jié)構(gòu)形態(tài)、剛?cè)嵝?、吸附作用等也?huì)。膜截留率的測(cè)定：以已知分子質(zhì)量的球形分子物質(zhì)作為基準(zhǔn)物（如葡萄糖MW=180，菊粉MW=5000，卵清蛋白MW=45000）進(jìn)行試驗(yàn)。截留相對(duì)分子量（MWCO）：表示相當(dāng)于一定截留率（通常為90％或95％）的分子量，作為膜的重要參數(shù)，標(biāo)注于膜產(chǎn)品。③滲透通量

反映膜的處理能力，是指在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)透過單位膜面積的溶劑體積，單位為m3·m-2·h-1。膜分離中，由于膜本身性質(zhì)、操作因素和污染等原因，膜通量會(huì)大大降低。它是膜使用中重要控制參數(shù)。

244.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（4）膜組件

膜分離裝置的核心，它是由膜、支撐材料、間隔器及外殼等合理組裝構(gòu)成的。膜組件的結(jié)構(gòu)及型式取決于膜的形狀,工業(yè)上應(yīng)用的膜組件主要有板框式、管式、螺旋卷式、中空纖維式等四種型式。

25結(jié)構(gòu)類似于常規(guī)的板框過濾裝置,膜被放置在可墊有濾紙的多孔的支撐板上,兩塊多孔的支撐板疊壓在一起形成的料液流道空間,組成一個(gè)膜單元,單元與單元之間可并聯(lián)或串聯(lián)連接。板框式(Plate-and-Frame)膜組件4.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（4）膜組件優(yōu)點(diǎn)：組裝方便，膜的清洗更換容易，料液流通截面較大，不易堵塞，同一設(shè)備可視生產(chǎn)需要組裝不同數(shù)量的膜。缺點(diǎn)：需密封的邊界線長(zhǎng)。26內(nèi)壓式膜組件：膜被直接澆鑄在多孔的不銹鋼管內(nèi)或用玻璃纖維增強(qiáng)的塑料管內(nèi)。加壓的料液流從管內(nèi)流過，透過膜的滲透溶液在管外側(cè)被收集。外壓式膜組件：膜則被澆鑄在多孔支撐管外側(cè)面。加壓的料液流從管外側(cè)流過，滲透溶液則由管外側(cè)滲透通過膜進(jìn)入多孔支撐管內(nèi)。管式(Tubular)膜組件4.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（4）膜組件27

膜、間隔器、以及多孔的膜支撐體等通過適當(dāng)?shù)姆绞奖唤M合在一起,然后將其卷繞裝入能承受壓力的外殼中制成膜組件。料液在膜表面通過間隔材料沿軸向流動(dòng)，透過液沿螺旋形流向中心管。螺旋卷式(SpiralWound)膜組件4.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（4）膜組件優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用廣泛、與板框式相比，卷式組件的設(shè)備比較緊湊、單位體積內(nèi)的膜面積大。缺點(diǎn)：清洗不方便，易堵塞。常用于反滲透操作28

有數(shù)百上萬根中空纖維膜固定在圓形容器內(nèi)構(gòu)成。優(yōu)點(diǎn):設(shè)備緊湊，單位設(shè)備體積內(nèi)的膜面積大(高達(dá)16000～30000)。缺點(diǎn):中空纖維內(nèi)徑小，阻力大，易堵塞，膜污染難除去，故對(duì)料液處理要求高。中空纖維(HollowFiber)膜組件4.膜及膜組件（三）膜分離技術(shù)（4）膜組件295.膜分離操作技術(shù)（三）膜分離技術(shù)

膜表面附近濃度升高，增大了膜兩側(cè)的滲透壓差，使有效壓差減小，當(dāng)操作壓差一定時(shí)，過程的有效推動(dòng)力將下降，使?jié)B透通量降低。當(dāng)膜表面附近的濃度超過溶質(zhì)的溶解度時(shí)，溶質(zhì)會(huì)析出，緊密排列形成凝膠層，流體透過膜的阻力增大，滲透通量進(jìn)一步降低。當(dāng)分離含有菌體、細(xì)胞或其他固形成分的料液時(shí)，也會(huì)在膜表面形成凝膠層。（1）濃差極化濃度極化（或濃差極化）：膜分離操作中，大分子溶質(zhì)被截留而在膜表面處聚積，使得膜表面上被截留的大分子溶質(zhì)濃度增大。這種大分子溶質(zhì)在膜表面附近濃度高于主體中大分子溶質(zhì)濃度的現(xiàn)象。30濃差極化對(duì)膜分離的不利影響：膜面上結(jié)垢，使膜孔阻塞，逐漸喪失透過能力滲透壓升高，在一定壓差下使溶劑的透過速率下降，滲透通量降低溶質(zhì)濃度的增加使溶質(zhì)的透過速率提高，使截留率下降。5.膜分離操作技術(shù)（三）膜分離技術(shù)（1）濃差極化應(yīng)對(duì)濃差極化的策略：錯(cuò)流操作，料液與膜面平行流動(dòng)，料液的流動(dòng)可有效防止和減少被截留物質(zhì)在膜面上的沉積。增大流速，靠近膜的濃度邊界厚度減小，會(huì)減少濃差極化的影響，有利于維持較高的滲透通量。但流速加大，膜分離能量消耗增大。315.膜分離操作技術(shù)（三）膜分離技術(shù)（2）過濾方式①死端過濾死端過濾又稱正向流過濾。料液流動(dòng)方向和濾膜表面垂直，根據(jù)濾膜的孔徑將直徑較大的顆粒物質(zhì)截留，而直徑較小的分子透過濾膜到濾過端。膜表面大顆粒物質(zhì)不斷累積易形成濾餅層，并產(chǎn)生濃差極化而增加過濾阻力，造成過濾壓力升高、過濾速度降低。325.膜分離操作技術(shù)（三）膜分離技術(shù)（2）過濾方式②錯(cuò)流過濾錯(cuò)流過濾又稱切向流過濾。過濾過程中平行于膜的切向流不斷清洗沖刷膜表面，流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力能有效緩解膜表面濾餅層和濃差極化層的形成。避免過濾阻力快速增加，有利于維持較高的滲透通量，保持穩(wěn)定的過濾流速和壓力，實(shí)現(xiàn)更高的膜過濾處理量，延長(zhǎng)膜壽命。336.影響膜分離的因素（三）膜分離技術(shù)（1）壓力的影響膜分離的推動(dòng)力：壓力差△pA、當(dāng)

p小,無濃度極化層,J與

p成正比;B、當(dāng)

p大,有濃差極化,J的增長(zhǎng)速率減慢;C、當(dāng)

p繼續(xù)增加時(shí)，形成凝膠層，且厚度隨壓力的增大而增大，所以J不再隨

p增加。此時(shí)達(dá)到臨界滲透通量

34滲透通量增加6.影響膜分離的因素（三）膜分離技術(shù)（2）溫度的影響

溫度料液黏度膜分離阻力溫度的選擇原則：在不影響料液和膜穩(wěn)定性的范圍內(nèi)，盡量選擇較高的溫度。（3）其他的因素料液濃度、流速、操作時(shí)間、溶液pH、料液成分等。35膜污染：由于膜表面形成了附著層或膜孔堵塞等外部因素導(dǎo)致膜性能下降的現(xiàn)象。膜污染的標(biāo)志：滲透通量下降膜污染的主要原因：微濾--膜孔被顆粒堵塞;超濾膜—濃差極化反滲透—膜對(duì)溶質(zhì)的吸附和沉積作用7.膜的處理（三）膜分離技術(shù)（1）膜污染

膜污染造成膜孔堵塞，膜的滲透通量大幅度下降，膜的使用壽命縮短和影響目標(biāo)產(chǎn)物的回收率。36膜的清洗是恢復(fù)膜分離性能、延長(zhǎng)膜使用壽命的重要操作。清洗方法（1）物理清洗（2）化學(xué)清洗（3）物理+化學(xué)清洗7.膜的處理（三）膜分離技術(shù)（2）膜的清洗借助液體流動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械力，將膜表面上的污染物沖刷掉。（1）正向清洗，采用清洗液，加大流速循環(huán)洗滌（2）反向清洗，采用空氣、透過液或清洗劑反向沖洗。（3）超聲波等有效地清楚因顆粒沉積造成的膜孔堵塞不能徹底洗凈物理清洗37化學(xué)清洗化學(xué)試劑，對(duì)膜組件進(jìn)行浸泡，并應(yīng)用物理清洗的方法循環(huán)清洗，達(dá)到清除膜上污染物的目的?；瘜W(xué)清洗劑有鹽溶液、稀酸、稀堿、表面活性劑、絡(luò)合劑、氧化劑和酶溶液等。eg.（1）膜表面被油污污染用熱的表面活性劑溶液進(jìn)行浸泡清洗。

eg.（2）蛋白質(zhì)的嚴(yán)重吸附所引起的膜污染用蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶等）溶液浸泡后循環(huán)清洗。7.膜的處理（三）膜分離技術(shù)（2）膜的清洗38無機(jī)膜和部分有機(jī)膜--高溫滅菌多數(shù)有機(jī)高分子膜--化學(xué)消毒法（乙醇、甲醛、環(huán)氧乙烷等）7.膜的處理（三）膜分離技術(shù)（3）膜的消毒與保存無菌生產(chǎn)時(shí)，需要對(duì)膜分離系統(tǒng)無菌處理一般采用浸泡膜組件的方式消毒，膜在使用前需清洗干凈。如果膜分離操作停止時(shí)間超過24h或長(zhǎng)期不用，則應(yīng)將膜組件清洗干凈后，選用能長(zhǎng)期儲(chǔ)存的消毒劑浸泡保存。一般可根據(jù)膜供應(yīng)商提供的條件，科學(xué)地使用和維護(hù)膜組件，防止膜受損，延長(zhǎng)膜的使用壽命。39任務(wù)實(shí)施人干擾素α2b包涵體的處理1234567生產(chǎn)前準(zhǔn)備抽

提復(fù)

性超

濾膜系統(tǒng)的沖洗酸

化清

場(chǎng)401.確認(rèn)與填寫檢查記錄確認(rèn)是否有前批清場(chǎng)合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具是否符合要求。填寫發(fā)酵液中菌體的處理產(chǎn)前檢查記錄。2.領(lǐng)料與溶液配制（1）抽提液（1L）：母液A（pH8.2，2mol/LTris-HCl溶液）10mL、DTT3.08g、鹽酸胍580g、EDTA-Na23.36g。容器標(biāo)明溶液名稱、濃度、配制量。4℃保存，1周內(nèi)使用。（2）復(fù)性緩沖液（1L）：母液A（2mol/LTris-HCl母液）10mL、氧化性谷胱甘肽（GSSG）0.16g、尿素120g。容器上標(biāo)明溶液名稱、濃度、配制量。（3）稀釋緩沖液（20mmol/L、pH8.2Tris-HCl緩沖液，1L）：母液A（2mol/LTris-HCl母液）10mL。容器標(biāo)明溶液名稱、濃度、配制量。（一）生產(chǎn)前準(zhǔn)備4120℃、20min條件下，18000rpm離心抽提液。收集上清，去沉淀。測(cè)量其OD280和OD260，以及體積。計(jì)算OD280/OD260值（應(yīng)大于0.8），計(jì)算OD280總量。觀察抽提后上清液狀態(tài)。（二）抽提2.回收包涵體稱重。按抽提液體積與包涵體質(zhì)量比為100mL∶5g將懸浮好的包涵體加入抽提液中。室溫?cái)嚢?h以上。1.抽提42超濾復(fù)性液，速度100～200mL/min，進(jìn)液壓力15～30psi

。濃縮至約5L時(shí)，停止，緩慢加入等體積稀釋液后，繼續(xù)超濾，反復(fù)稀釋三次。濃縮至約5L時(shí)停止。3.收集包涵體將抽提后上清液緩慢倒入復(fù)性緩沖液中，同時(shí)緩慢攪拌，使之混合均勻，并在容器標(biāo)明復(fù)性時(shí)間?？刂茝?fù)性液蛋白濃度：OD280為0.2～0.4，于4℃放置不少于12h。（三）復(fù)性用20L預(yù)冷的注射用水沖洗超濾膜包和硅膠管外壁用稀釋液沖洗超濾膜包。1.清洗膜包2.超濾（四）超濾任務(wù)實(shí)施人干擾素α2b包涵體的處理43（五）膜系統(tǒng)的沖洗打開回液閥，同時(shí)關(guān)閉濾出閥，用緩沖液沖洗進(jìn)料/回液通路側(cè)膜上粘有的大量顆粒。沖洗5L。010204打開濾出閥，用緩沖液（或?yàn)V出液）沖洗濾出端，沖洗液直接棄去，沖洗體積為5L。用注射用水沖掉進(jìn)料/回液通路中循環(huán)注射用水。03打開回液閥，同時(shí)關(guān)閉濾出閥，用注射用水循環(huán)沖洗膜的表面。沖洗時(shí)間為10min。膜系統(tǒng)的沖洗44（六）酸化取酸化液離心，離心條件：4℃，10000rpm，25min。離心結(jié)束后，收集上清液，測(cè)定上清液OD280、OD260并計(jì)算比值（應(yīng)大于1.0）。上清液可直接進(jìn)行SP離子交換層析或保存于4℃不超過24h。2.收集上清液緩慢攪拌，將冰醋酸緩慢加入超濾濃縮液中，調(diào)其pH為4.3～4.6。4℃環(huán)境中放置至少30min。1.酸化45（七）清場(chǎng)

檢查、整理各項(xiàng)記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺(tái)和潔凈室。最后，填寫清場(chǎng)合格證。注意：請(qǐng)?jiān)谌蝿?wù)實(shí)施過程中規(guī)范填寫《人干擾素α2b包涵體抽提操作記錄》，不可補(bǔ)填和篡改！46知識(shí)學(xué)習(xí)反思與反饋學(xué)習(xí)成果實(shí)踐操作任務(wù)實(shí)施人干擾素α2b包涵體的處理47拓展任務(wù)微孔濾膜過濾除微生物48查閱資料，了解微濾法應(yīng)用于濾除微生物生產(chǎn)的實(shí)例。查閱設(shè)計(jì)《微孔濾膜