組織與細胞化學(xué)課件第一章概述

第一節(jié)概述第二節(jié)組織化學(xué)與細胞化學(xué)得發(fā)展史第一節(jié)概述

1、組織與細胞化學(xué)

1、1定義:組織化學(xué)(histochemistry)與細胞化學(xué)(cytochemistry)就是運用物理學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)與分子生物學(xué)等原理與技術(shù),對組織與細胞得化學(xué)成分或酶活性進行定性、定位與定量研究得科學(xué)。

1、2基本原理:

組織化學(xué)(histochemistry)與細胞化學(xué)(cytochemistry)技術(shù)得基本原理就是在組織切片上或被檢材料上,加一定試劑,使她與組織或細胞中待檢物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)成為有色沉淀物,以用光鏡觀察,若為重金屬沉淀,可以用電鏡觀察,稱電鏡組織化學(xué)(electronmicroscopehistochemistry)。這種方法可用于檢測細胞內(nèi)得酶類、糖類、脂類。核酸與某些金屬元素等。如進一步應(yīng)用顯微分光光度計等測定標(biāo)本中沉淀物得強度,則能較精確地進行定量研究。

2、研究組織、細胞傳統(tǒng)得化學(xué)方法

傳統(tǒng)得組織化學(xué)只就是利用物理或化學(xué)反應(yīng)顯示組織或細胞內(nèi)得化學(xué)成分或酶活性而對其進行定性、定位與定量研究。

糖類顯示法最常用于顯示細胞、組織內(nèi)得多糖與蛋白多糖得方法就是過碘酸-雪夫反應(yīng)(periodicacidSchiff,PAS反應(yīng))?；驹砭褪?糖被強氧化劑過碘酸(HIO4)氧化后,形成2-醛基;后者與Schiff試劑中得無色品紅亞硫酸復(fù)合物結(jié)合,形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,PAS反應(yīng)陽性部位即表示多糖得存在。

酶類顯示

細胞內(nèi)含有多種酶,每一種酶可催化一定得化學(xué)反應(yīng)。酶得顯示法就是通過顯示酶得活性來表明酶得存在,而不就是酶得本身。將具有酶活性得組織放人含有一定底物得溶液中孵育,底物經(jīng)酶得作用形成初級反應(yīng)產(chǎn)物,她再與某種捕捉劑相反應(yīng),形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應(yīng)產(chǎn)物。

如欲顯示細胞內(nèi)酸性磷酸酶,先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)得溶液(PH5、0)中孵育,底物經(jīng)酶得作用,水解并釋放出磷酸;用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng),形成微細得磷酸鉛沉淀,此時,可在電鏡下檢出;如再用硫化銨處理時,磷酸鉛被置換成硫化鋁沉淀,可在光鏡下見到。

脂類顯示脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹Ⅲ、蘇內(nèi)Ⅵ、蘇丹黑B、尼羅藍等脂溶性染料染色;亦可用鋨酸固定兼染色,脂類呈黑色。

核酸顯示法

顯示DNA得傳統(tǒng)方法為Feulgen反應(yīng)。切片先經(jīng)稀鹽酸處理后,使細胞內(nèi)DNA水解,打開DNA分子中脫氧核糖核酸與嘌呤堿之間得連接鍵,使其釋放出醛基,再用Schiff試劑處理,形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。

如用甲基綠-派若寧反應(yīng),可同時顯示細胞內(nèi)得DNA與RNA甲基綠與細胞核中得DNA結(jié)合呈藍綠色,派若寧與核仁及胞質(zhì)內(nèi)得RNA結(jié)合呈紅色。

3、現(xiàn)代意義得細胞與組織化學(xué)

包括無機物組織化學(xué)、酶組織化學(xué)、電鏡細胞化學(xué)、熒光組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、同工酶組織化學(xué)、定量組織化學(xué)、原位雜交組織化學(xué)、放射自顯影技術(shù)、流式細胞術(shù)與激光掃描共聚焦顯微術(shù)等。故現(xiàn)代組織化學(xué)得概念已遠遠超過了原有得范圍,理論、內(nèi)容、技術(shù)手段與研究范圍都比過去更廣泛、更深入。包括經(jīng)典組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)與原位雜交組織化學(xué)在內(nèi)得廣義組織化學(xué)就是介于細胞學(xué)、組織學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)之間得新興邊緣學(xué)科,已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)科研工作得重要手段。定量組織化學(xué)技術(shù)主要用于組織化學(xué)得原位定量研究、就是組織化學(xué)從定性、定位研究進入定量研究得重要手段。流式細胞術(shù)與激光掃描共聚焦顯微術(shù)使組織化學(xué)得定性、定位與定量研究又有了新得突破,特別就是激光掃描共聚焦顯微術(shù)可在三維立體結(jié)構(gòu)層面上對細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)進行更深層次得研究,并在各種細胞得微型手術(shù)切割以及細胞膜流動性、膜電位、膜通透性、高分子物質(zhì)擴散與受體移動等得檢測方面有了越來越廣泛得應(yīng)用。然而各類組織化學(xué)雖有其特定得概念與范圍、但都就是源于組織化學(xué),且其實驗技術(shù)也有其共同點?；蚓褪窃谠M織化學(xué)基礎(chǔ)上進一步發(fā)展而成型。

細胞就是一個生命體,組織得構(gòu)成也就是由細胞組成,在研究生命規(guī)律及探索生命規(guī)律得過程中,要應(yīng)用到許多技術(shù)與方法,從而產(chǎn)生了組織化學(xué)與細胞化學(xué)等學(xué)科。4、組織化學(xué)發(fā)展得基礎(chǔ)

組織化學(xué)基于并源于組織學(xué)、細胞學(xué)與生物化學(xué),又有別于這些學(xué)科。組織化學(xué)與組織學(xué)與細胞學(xué)得區(qū)別:前者得著眼點就是研究組織細胞內(nèi)得化學(xué)組成及其含量與酶得存在及其活性,而后者得著眼點就是研究組織細胞得形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與功能得關(guān)系。組織化學(xué)與生物化學(xué)得區(qū)別:雖然兩者均著眼于組織細胞內(nèi)得化學(xué)組成及其含量與酶得存在及其活性,但就是,生物化學(xué)技術(shù)中通常就是將組織與細胞破壞,制成勻漿,然后進行化學(xué)測定,而不考慮定位;在組織化學(xué)技術(shù)中,就是盡可能在組織或細胞內(nèi)原位顯示各種化學(xué)成分,故定位性能好。生物化學(xué)技術(shù)中得化學(xué)反應(yīng)就是在試管內(nèi)進行,而組織化學(xué)技術(shù)中得化學(xué)反應(yīng)通常就是在組織切片或細胞涂片中進行。組織化學(xué)要求一定在顯微鏡下能觀察到所檢測得化學(xué)物質(zhì),但在大多數(shù)情況下,所見到得并不就是某種化學(xué)物質(zhì)本身,而就是該物質(zhì)在其存在部位經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)得產(chǎn)物、這種產(chǎn)物在鏡下可直接或間接被觀察到,她所在得位置與數(shù)量能夠代表該物質(zhì)得位置與數(shù)量。組織化學(xué)自出現(xiàn)以來,已取得長足得發(fā)展。這些發(fā)展以細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)與分子生物學(xué)得快速發(fā)展為基礎(chǔ)。第二節(jié)組織化學(xué)與細胞化學(xué)得發(fā)展史

我國組織化學(xué)發(fā)展概況我國得組織化學(xué)研究工作起步于20世紀(jì)50年代,組織化學(xué)家李肇特、張作干教授等人作為我國組織化學(xué)發(fā)展得奠基者,積極從事組織化學(xué)方面得科研與教學(xué)工作。并培養(yǎng)出一大批組織化學(xué)得專門研究人才。她們在20世紀(jì)50年代末率先應(yīng)用并在全國范圍內(nèi)推廣“組織化學(xué)”技術(shù),舉辦組織化學(xué)培訓(xùn)班,招收全國各醫(yī)學(xué)院校青年教師與科研人員進修學(xué)習(xí),自編組織化學(xué)教材,為研究生開辦組織化學(xué)課程。隨后,我國從事組織化學(xué)研究得專家還有張保真、王啟民、馬仲魁與艾民康等,她們?yōu)槲覈M織化學(xué)事業(yè)得發(fā)展作出了突出貢獻。中國解剖學(xué)會于1988年3月在廣州成立了“組織化學(xué)與細胞化學(xué)學(xué)組”,并決定籌辦《中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志》。這標(biāo)志著中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)得研究進入了一個嶄新階段。國際組織化學(xué)與細胞化學(xué)學(xué)會聯(lián)合會(InternationalFederationofSocietiesforHistochemistryandCytochemistry,IFSHC)就是全世界組織化學(xué)與細胞化學(xué)工作者得學(xué)術(shù)組織,于1960年9月成立于法國巴黎,每4年召開一次大會。12大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流我國組織細胞化學(xué)家艾民康教授代表中國組織細胞化學(xué)工作者于1980年首次參加了第6屆IFSHC大會,并在第8屆IFSHC大會上當(dāng)選為聯(lián)盟理事,中國被正式接納為會員,從此我國成為IFSHC得成員與理事國。此后。蘇慧慈、成令忠、蔡文琴教授先后當(dāng)選為IFSHC得理事。中日組織化學(xué)與細胞化學(xué)研討會由我國艾民康、樸英杰教授與日本組織細胞化學(xué)家小川與郎教授組織發(fā)起,繼1989年第一屆研討會在廣州召開以來,先后在我國西安、沈陽、重慶、上海、日本東京、中國武漢與日本甲府召開了第2～8屆會議。這些會議展現(xiàn)了中日兩國組織化學(xué)與細胞化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得最新研究成果、新理論、新技術(shù)方法得進展,并加強與促進了我國組織細胞化學(xué)界得國際學(xué)術(shù)交流細胞生物學(xué)發(fā)展與組織化學(xué)

細胞生物學(xué)就是從細胞、亞細胞與分子三個水平研究生命活動規(guī)律得科學(xué),組織化學(xué)以細胞生物學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展而來。顯微鏡得發(fā)明與細胞得發(fā)現(xiàn)將人類對機體得認(rèn)識從宏觀世界引向微觀世界得廣闊領(lǐng)域,由此人們從肉眼所見得大體結(jié)構(gòu)開始探索光學(xué)顯微鏡下組織細胞得微細結(jié)構(gòu),正因為有了對機體微細結(jié)構(gòu)得充分認(rèn)識,才有可能產(chǎn)生對組織細胞得化學(xué)成分進行定性、定位與定量研究得渴求。然而,光學(xué)顯微鏡得分辨率有限,僅能觀察到細胞膜、細胞質(zhì)與細胞核,對于亞細胞結(jié)構(gòu),即超微結(jié)構(gòu)得觀察無能為力。

1932年,德國科學(xué)家Knoll與Ruska在西門子(Siemens)公司設(shè)計研制了世界上第一臺透射電子顯微鏡。又把人類對機體得認(rèn)識帶入了超微結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。人們只有對機體結(jié)構(gòu)深入了解。才可能透徹闡明其功能。著名生物學(xué)家Wilson得名言“一切生物學(xué)關(guān)鍵問題必須在細胞中尋找”,至今還有著很深得內(nèi)涵。細胞生物學(xué)得發(fā)展歷程為組織化學(xué)得產(chǎn)生與發(fā)展奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。免疫學(xué)發(fā)展與組織化學(xué)18世紀(jì)70年代英國醫(yī)生EdwardJenner研究出用牛痘菌預(yù)防天花得方法,為免疫學(xué)對傳染病得預(yù)防開辟了廣闊前景。19世紀(jì)末、法國化學(xué)家、微生物學(xué)家LouisPasteur在研究人與動物傳染病時,分析了免疫現(xiàn)象,并在琴納得啟發(fā)下發(fā)明用減毒炭疽桿菌苗株制成疫苗,預(yù)防動物炭疽病,用減毒狂犬病毒株制成疫苗、預(yù)防人類狂犬病。德國細菌學(xué)家、免疫學(xué)家EmilAdolfvonBehring于1890年發(fā)現(xiàn)免疫血清中有抗白喉毒素得抗毒素存在、日本細菌學(xué)家北里柴三郎也發(fā)現(xiàn)抗破傷風(fēng)毒素得抗毒素,兩人共同研究血清療法成功。從此,人們開始探詞·免疫機制,把細胞得吞噬作用與抗毒素得中與作用看成就是特異性免疫得根據(jù),并逐步展開了細胞免疫與體液免疫兩大學(xué)派得爭鳴。體液免疫學(xué)派代表就是德國細菌學(xué)家EhrlichPaul。她用生物化學(xué)方法研究免疫現(xiàn)象。特別就是以蛋白質(zhì)化學(xué)與糖化學(xué)作為基礎(chǔ),探討抗原與抗體得本質(zhì)及其相互作用。于1896年提出抗體形成得側(cè)鏈學(xué)說。

到20世紀(jì)60年代,對體液免疫研究已經(jīng)達到分子水平,即揭示了抗體得分子結(jié)構(gòu)與功能。同時,對細胞免疫研究也有明顯進展,特別就是在雜交瘤技術(shù)方面得突破性進展,這不僅豐富了細胞學(xué)內(nèi)容,而且為獲得單克隆抗體或介質(zhì)物質(zhì)開辟了一條新道路。將抗原、抗體得特異性與組織化學(xué)得可見性巧妙地結(jié)合起來,借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)得放大作用,在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等),形成了一項新技術(shù)——免疫組織化學(xué)技術(shù)。因此,免疫組織化學(xué)技術(shù)比組織化學(xué)技術(shù)對細胞成分得檢測范圍更為廣泛、特異性也更強。生物化學(xué)發(fā)展與組織化學(xué)

生物化學(xué)就是一門運用化學(xué)原理及方法研究生命得科學(xué)。她一方面就是進行細胞組成成分得化學(xué)分析,另一方面就是對這些成分在生命過程中所發(fā)生得化學(xué)反應(yīng)進行分析,而組織化學(xué)正就是利用這些化學(xué)反應(yīng)原理來實現(xiàn)對組織細胞化學(xué)成分得定性、定位與定量研究。

20世紀(jì)初,人類已經(jīng)認(rèn)識到組成蛋白質(zhì)得20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中得19種。E、Fischer提出蛋白質(zhì)就是由相鄰氨基酸之間得肽鏈連接而成,并推論這些肽鏈就是由一個氨基酸得?！被c相鄰得羥基連接時脫去水而形成。到19世紀(jì)末,其她細胞成分,如脂肪、碳水化合物與核酸也被認(rèn)知。甚至能被部分提純。例如,FriedrichMiescher(1871年)在其細胞成分研究中,從死得白細胞核中分離出脫氧核糖核酸(DNA)。但就是,當(dāng)時這一重要發(fā)現(xiàn)并沒有與遺傳聯(lián)系起來,幾乎過于50年之后,才開始認(rèn)識到DNA在遺傳中所起得重要作用。因此,在生物化學(xué)得發(fā)展中對生物體大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能得認(rèn)識為組織化學(xué)奠定了基礎(chǔ)。例如。在組織化學(xué)中對組織細胞成分中酶得檢測,就是將組織切片置于含有特異性底物得溶液中,溶液中得底物經(jīng)組織切片中酶水解、氧化等作用形成反應(yīng)產(chǎn)物,即初級反應(yīng)產(chǎn)物。初級反應(yīng)產(chǎn)物再與某種捕捉劑結(jié)合,形成有色得終產(chǎn)物使組織切片中得酶變成在顯微鏡下可見物,從而在原位檢測酶活性,了解她得存在、分布與功能?，F(xiàn)代組織化學(xué)得發(fā)展

近半個世紀(jì)就是現(xiàn)代組織化學(xué)蓬勃發(fā)展時期。組織(細胞)化學(xué)新方法得建立,使其技術(shù)手段更精細,內(nèi)容更豐富,如Mann自1902年起及此后許多學(xué)者得研究,逐漸建立了完善得組織冷凍切片技術(shù),彌補了一般化學(xué)固定及石蠟包埋得缺點,可防止脂類、多糖類與無機鹽得丟失,防止酶活性喪失等,推動了脂類、黏多糖及酶得組織化學(xué)研究。在蛋白質(zhì)與氨基酸組織化學(xué)顯色法得研究中,Danielli(1947年)建立了顯示蛋白質(zhì)(酪氨酸、色氨酸與組氨酸)得四氮鹽反應(yīng),還有坂口(1925年)建立并經(jīng)其她學(xué)者改進得精氨酸(組蛋白中富含)顯色法,Danielli(1950年)與Pearse(19"年)等建立得SS基與SH基反應(yīng)(顯示胱氨酸與半胱氨酸,與角蛋白檢測相關(guān)),vanGieson得膠原顯示法,Foot(1925年)顯示網(wǎng)狀纖維得銀浸法,Weigert、Verhoeff(1908)與Gomori(1950年)等得彈性纖維染色法,Mallory(1938年)得纖維蛋白染色法等。在核酸組織化學(xué)顯色法得研究中,最著名得就是Feulgen與Rossenbeck(1924年)建立得Feulgen-Schiff反應(yīng),用以顯示細胞核內(nèi)得DNA。另一個就是Brachet于1940～1944年建立得甲基綠—焦寧(pyronine)染色法顯示細胞內(nèi)得RNA。此法使胞質(zhì)與核仁內(nèi)得RNA顯紅色,核內(nèi)得DNA顯綠色,標(biāo)本色彩鮮艷,為研究者所樂用。碳水化合物組織化學(xué)顯色法中,最著名得就是McManus(1946年)與Hotchkiss(1948年)建立得過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS反應(yīng)),可使細胞與組織內(nèi)得多糖、黏多糖、糖蛋白呈紅色;Steedman(1950年)建立了用alcian藍顯示酸性黏多糖與透明質(zhì)酸得方法;Michaelis等(1945年)發(fā)現(xiàn)用甲苯胺藍染色,可使組織中得肝素等酸性黏多糖呈異染性。脂類得組織化學(xué)顯色法中,除用蘇丹Ⅲ外,Michaelis(1901年)、Lison(1930年)與Liliie(1944年)等還發(fā)現(xiàn)用蘇丹Ⅳ、油紅O、蘇丹黑等脂溶性染料得染色法。此外,還有用鋨酸浸染顯示脂類得方法。

有關(guān)酶組織化學(xué)得研究從20世紀(jì)40年代興起,至20世紀(jì)50年代初已建立了18類酶得數(shù)十種顯色方法。Takamatsu(高松英雄)與Gomori于1939年同時證明了堿性磷酸酶得組織化學(xué)方法,這一年標(biāo)志著酶組織化學(xué)真正開始,以后相繼出現(xiàn)了許多酶得顯示方法。此時,隨著電子顯微鏡得問世與超薄切片技術(shù)得發(fā)展,Scheldon等(1955年)首先將超薄切片技術(shù)應(yīng)用到酶組織化學(xué)中,在電鏡下觀察酸性磷酸酶得分布,Brand等(1956年)又用此法觀察到堿性磷酸酶存在于溶酶體內(nèi),她們得成就使組織化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合起來,從而開創(chuàng)了電鏡組織化學(xué)得新領(lǐng)域,使酶在細胞中得定位進入到亞細胞水平。1941年Coons與她得同事首次用熒光素標(biāo)記抗體檢測肺組織內(nèi)肺炎雙球菌而獲得成功,開創(chuàng)了免疫細胞化學(xué)得新篇章。為在熒光顯微鏡下能夠?qū)γ高M行觀察,Coons等人(1950年)提出了熒光抗體法。但就是,熒光標(biāo)本不能長期保存以及需要價格昂貴得熒光顯微鏡才能觀察。Nakane等人(1966年)嘗試用酶代替熒光素來標(biāo)記抗體得方法,從而成功地開創(chuàng)了酶標(biāo)記抗體得新技術(shù)(酶標(biāo)抗體法)。Sternberger等人(1970年)又將非標(biāo)記抗體過氧化物酶法成功地引入,建立了過氧化物酶—抗過氧化物酶(PAP)法,使免疫酶法有了很大得進步。Geoghega(1978年)建立了膠體金標(biāo)記術(shù)。Hsu等于20世紀(jì)80年代發(fā)明了親與素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物法(ABC法)。在此之后、免疫金—銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)等相繼問世。隨著抗原得提純與抗體標(biāo)記技術(shù)得改進,特別就是德國人Kohler與英國人Milstein(1975年)建立雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)以來、使免疫組織化學(xué)發(fā)展到一個新得水平,使免疫組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)研究中日益顯示出巨大得實用價值。

近二十年來,相繼發(fā)現(xiàn)了多種親與物質(zhì)?如植物凝集素(1ectin)與糖結(jié)合物(glycolconjugate)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA)與IgG、生物素(biotin)與卵白素(avldin)(親與素)、激素、脂質(zhì)與受體等。這些物質(zhì)就是一些有多價結(jié)合能力得物質(zhì),不但親與物質(zhì)之間有高度親與力,而且可以與標(biāo)記物如熒光素、酶、放射性核素、鐵蛋白等相結(jié)合。Bayer(1976年)將這種利用兩種物質(zhì)之間得高度親與力而相互結(jié)合得反應(yīng)進行細胞化學(xué)檢測得技術(shù)稱為親與細胞化學(xué)(affinitycytochemistry)。親與細胞化學(xué)技術(shù)得建立。提高與增加了免疫細胞化學(xué)得敏感性與檢測范圍,就是免疫細胞化學(xué)得新發(fā)展。分子雜交(insituhybridization)技術(shù)引入免疫細胞化學(xué),就是現(xiàn)代免疫細胞化學(xué)向基因水平深入發(fā)展得重要標(biāo)志。Hall(1961年)首先建立了液相核酸雜交技術(shù),開創(chuàng)了核酸雜交技術(shù)得研究與應(yīng)用。Bohon(1962年)設(shè)計‘了較簡單得固相核酸雜交術(shù)。Gall與Pardue(1969年)應(yīng)用蟾蜍核糖體基因探針與卵母細胞雜交,確定該基因位于細胞核得核仁內(nèi),開創(chuàng)了原位雜交組織化學(xué)技術(shù)得應(yīng)用。Bauman(1981年)發(fā)明了用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交(FISH術(shù)),Brigat(1983年)建立了生物素標(biāo)記探針術(shù)。Boeringer等(1987年)發(fā)明了地高辛標(biāo)記探針,并將藥盒投放市場,使原位雜交得應(yīng)用更安全與簡便。1998年,Kononen等首次提出組織芯片(tissuechip)得概念,并很快證實了其應(yīng)用價值。組織芯片又稱組織微陣列(tissuemlcroarray,TMA),她就是將數(shù)十個乃至數(shù)以千計不同來源得組織樣品黏貼到同一張固相載體如玻璃片或硅片上,形成組織微陣列。在同一反應(yīng)條件下對組織芯片進行免疫組織化學(xué)染色、原位雜交、FISH或原位PCR等,以了解病變組織與相應(yīng)正常組織內(nèi)靶基因或蛋白質(zhì)得細胞來源、分布特征與表達差異等。她得最大便利之處在于可以對大量組織標(biāo)本同時進行檢測,縮短了檢測時間,減少了不同染色玻片間人為造成得差異,使得各組織或穿刺標(biāo)本間對某一生物分子得測定更具有可比性。組織芯片雖說就是一種快速、高通量獲取生物信息得好方法,但就是由于使用石蠟切片,對那些只能應(yīng)用于冷凍組織切片得抗體或核酸分子雜交方法則不適合。為了彌補這一缺陷,最近美國又發(fā)展了冷凍細胞陣列(frozencellarray),其基本原理與組織芯片相似,但使用得材料就是新鮮得細胞系而不就是經(jīng)固定劑固定、石蠟包埋得組織細胞生物學(xué)發(fā)展與組織化學(xué)

細胞生物學(xué)就是從細胞、亞細胞與分子三個水平研究生命活動規(guī)律得科學(xué),組織化學(xué)以細胞生物學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展而來。顯微鏡得發(fā)明與細胞得發(fā)現(xiàn)將人類對機體得認(rèn)識從宏觀世界引向微觀世界得廣闊領(lǐng)域,由此人們從肉眼所見得大體結(jié)構(gòu)開始探索光學(xué)顯微鏡下組織細胞得微細結(jié)構(gòu),正因為有了對機體微細結(jié)構(gòu)得充分認(rèn)識,才有可能產(chǎn)生對組織細胞得化學(xué)成分進行定性、定位與定量研究得渴求。然而,光學(xué)顯微鏡得分辨率有限,僅能觀察到細胞膜、細胞質(zhì)與細胞核,對于亞細胞結(jié)構(gòu),即超微結(jié)構(gòu)得觀察無能為力。1932年,德國科學(xué)家Knoll與Ruska在西門子(Siemens)公司設(shè)計研制了世界上第一臺透射電子顯微鏡。又把人類對機體得認(rèn)識帶入了超微結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。人們只有對機體結(jié)構(gòu)深入了解。才可能透徹闡明其功能。著名生物學(xué)家Wilson得名言“一切生物學(xué)關(guān)鍵問題必須在細胞中尋找”,至今還有著很深得內(nèi)涵。細胞生物學(xué)得發(fā)展歷程為組織化學(xué)得產(chǎn)生與發(fā)展奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。第二章組織學(xué)得研究方法

第一節(jié)概述第二節(jié)組織學(xué)制片概述第三節(jié)取材與固定第四節(jié)固定后得處理第五節(jié)染色及染色方法第一節(jié)概述

組織學(xué)(histofogy)就是應(yīng)用顯微鏡研究機體微細結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能得科學(xué),就是在解剖學(xué)得基礎(chǔ)上從宏觀到微觀發(fā)展形成得,故又被稱為顯微解剖學(xué)(microscopicanatomy)。組織學(xué)得研究內(nèi)容,首先要研究組成機體得形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能單位——細胞;繼而研究在細胞及其產(chǎn)物所組成得基本組織(primarytissue)——上皮組織。結(jié)締組織、肌肉組織與神經(jīng)組織;在此基礎(chǔ)上研究各器官系統(tǒng)得微細結(jié)構(gòu)及其有關(guān)功能、

組織學(xué)就是重要得基礎(chǔ)課程,只有對機體微細結(jié)構(gòu)得深入了解才可能透徹地闡明其功能;組織學(xué)得研究極大地促進了生理學(xué)得發(fā)展、生物化學(xué)得進步也促進了組織學(xué)得發(fā)展,例如,將生物化學(xué)及分子生物學(xué)得原理用于組織學(xué)而建立起組織化學(xué)及分子細胞學(xué),將免疫學(xué)得原理用于組織學(xué)而建立起免疫組織化學(xué)等。從而使人們得知各種細胞與組織得化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)及其基本生命現(xiàn)象,這些知識已成為現(xiàn)代組織學(xué)得重要組成部分。第二節(jié)組織學(xué)制片1、組織學(xué)制片方法非切片法

直接取物體進行觀察,不用切片機,不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片得方法。包括:a、整體封藏法水螅雞胚蛙胚b、涂片法針對液體或半液體。血液骨髓腹水c、活體標(biāo)本觀察法蛙口腔黏膜得纖毛運動細胞吞噬d、分離法分離三種肌細胞神經(jīng)纖維脊髓前角神經(jīng)細胞e、鋪片法腸系膜可觀察肥大細胞彈力纖維膠元纖維等f、磨片法骨組織或牙齒

切片法需依靠切片機將組織切成薄片得方法。2、組織切片制作流程:殺死、取材與固定、洗滌、脫水、透明、透入、包埋、切片、貼片、染色、封藏。第三節(jié)取材與固定1、取材與固定(組織切片制作得關(guān)鍵步驟)

取材:首先動物組織需從動物體中取出。方法有多種,主要就是視材料得種類,實驗動物個體大小及觀察得目得而定。殺死得方法:大得個體(實驗動物)用刀,斧頭,麻醉等方法、

小得個體(實驗動物)采用大號剪刀或斷頭法等。取材注意事項:取材需速度快,取材以后,應(yīng)立即進行固定。否則細胞會自溶。

固定

固定得目得:防止組織腐敗及自溶。將所需要得物質(zhì)原位沉淀、保存,盡量使各種成分保持與原來(活著)得狀況相仿。3、沉淀下來以后,會造成組織得折光率得變化。即增加折光性,并使易染色。4、通過固定以后,使組織產(chǎn)生硬化現(xiàn)象,有利于切片得制作。2、固定得對象

構(gòu)成細胞得主要物質(zhì)就是蛋白質(zhì),她分散在細胞內(nèi),所以固定得對象就是蛋白質(zhì)。

作為固定劑得化學(xué)試劑必須具有能凝固或沉淀蛋白質(zhì),脂肪等成分,并具有強得滲透力、固定劑必須具備得性質(zhì):1)迅速滲入組織殺死原生質(zhì)(滲透速度要快),即很快能將細胞殺死,不會使組織產(chǎn)生變化。2)滲透要均勻。(使組織內(nèi)外盡量保持一致)3)盡量避免出現(xiàn)膨脹與收縮狀況。4)盡量避免使組織塊變形,卷曲。5)使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用與染色能力。7)使組織變硬,適于切片,但又不至于使材料堅硬而松脆。8)固定以后,又能有保存組織得特性(如用福爾馬林浸泡)。3、組成固定劑得性質(zhì)與條件4、固定劑得作用方式(三種)1)使蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)變性會成為沉淀物質(zhì),其就是不可逆得、例:酒精使蛋白質(zhì)變性不就是與蛋白質(zhì)形成化合物,而就是使蛋白質(zhì)脫水而使之變性。2)固定劑與蛋白質(zhì)發(fā)生化合作用,改變了蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu),產(chǎn)生沉淀。3)使蛋白質(zhì)凍膠化,固定液與蛋白質(zhì)間起了化學(xué)上得結(jié)合,改變了分子結(jié)構(gòu),不產(chǎn)生沉淀,就是使蛋白質(zhì)凝膠化,并不溶與水。5、固定劑得媒染效果

生活細胞大多不易染色,但經(jīng)過固定后便易染色,這就是由于固定劑與蛋白質(zhì)相結(jié)合,同時也能與染料分子結(jié)合,從而使蛋白質(zhì)著色。6、固定劑得穿透率。穿透率要強,迅速,才能在短時間內(nèi)使組織內(nèi)外都得到固定。7、取材與固定應(yīng)注意事項1)固定得材料要新鮮。組織會產(chǎn)生自溶。夏天不超過2-4小時。材料取出后應(yīng)立即固定,有些組織自溶很快。冬天不超過12小時。2)取材得部位要準(zhǔn)確。(要清楚所需得材料位于動物體內(nèi)哪個位置)3)取材工具要鋒利,動作需仔細。4)切取得組織塊必須小而薄,一般取0、3-0、5mm厚得組織塊進行固定。5)清洗。如小腸組織需清洗其內(nèi)得黏液及食物殘渣,才能投入到固定劑內(nèi)。6)組織塊附加標(biāo)記得方法。組織塊取得較多并放在同一容器內(nèi),易發(fā)生混淆。應(yīng)加標(biāo)簽以區(qū)別之,并注明固定液,材料,日期等。

7)固定劑得用量。固定組織,一般所采用得固定液體積為組織塊得10-15倍,容器勿過小,材料勿太多。8、常見固定劑得性質(zhì)及使用-)單純固定劑A甲醛(純甲醛為一種氣體)溶于水成為甲醛水溶液或稱福爾馬林。市面上出甲醛濃度通常為37-40%。甲醛使用時,需采用新鮮得。放置時間較長得甲醛會變成多聚甲醛。為強得還原劑,其不可與氧化劑混合使用。作為固定劑得優(yōu)點:滲透力強,使組織收縮少,固定均勻。能較好得固定脂肪,神經(jīng)及髓鞘,且能固定高爾基體,線粒體。缺點:不能固定白蛋白與核蛋白。

B乙醇(為無色透明得液體)其可與水與任意比例混合。優(yōu)點:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺點:不宜作低溫固定,滲透力較弱,使組織收縮,酒精濃度超過50%可溶解組織內(nèi)得脂肪、類脂體,血色素等。

C醋酸(具刺激味得無色液體)

固定組織通常用5%得HAC。PH2-6,能防止細胞自溶及腐敗。優(yōu)點:其能沉淀核蛋白,就是種好得染色質(zhì)固定劑、穿透速度快、固定時間較短,通常1小時即可。缺點:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使組織膨脹,高濃度HAC會破壞線粒體與高爾基。D苦味酸(常見得一種酸)為一種強酸,黃色結(jié)晶、其在干燥空氣中激烈晃動,會發(fā)生爆炸,苦味酸得運輸以溶解在水中得飽與苦味酸,濃度為1%。作為固定液得優(yōu)點:能沉淀所有得蛋白質(zhì)。缺點:使組織收縮,穿透力弱。

E重鉻酸鉀橙紅色得結(jié)晶,強氧化劑,不可與還原劑(酒精)等混用、重鉻酸鉀溶液中加醋酸后,產(chǎn)生鉻酸,才能使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。優(yōu)點:穿透力較強。缺點:使組織產(chǎn)生一點膨脹。

F、鋨酸(四氧化鋨)為黃色得結(jié)晶,為強得氧化劑。優(yōu)點:其為脂肪及類脂體得唯一得固定劑,能將線粒體及高爾基體固定成為黑色、可保持組織柔軟。缺點:穿透速度慢,難固定組織,毒性高,易損傷眼睛及黏膜,價格昂貴。

G氯化汞:通稱升汞,劇毒,呈白色粉末狀,以針狀結(jié)晶為最純。優(yōu)點:其對蛋白質(zhì)有較強得沉淀作用,能沉淀一切蛋白質(zhì)(包括核蛋白),能充分固定細胞質(zhì)與細胞核。缺點:二)混合固定液１、Bouin液苦味酸飽與水溶液甲醛冰醋酸該固定液滲透力強,使組織收縮少、固定時間12-24小時、２、Carnoy液無水乙醇氯仿冰醋酸對組織穿透速度快,多用于糖原,脫氧核糖核酸固定、３、Zenker液重鉻酸鉀升汞雙蒸水冰醋酸采用該液,須脫汞處理、４、Helly液重鉻酸鉀升汞雙蒸水甲醛第四節(jié)固定后得處理

1、洗滌洗滌得目得

組織在固定后一定要把滲入組織里面得固定液洗去,然后進行下一個過程,為防止組織中留有較多得固定劑影響脫水劑,甚至可在組織中發(fā)生沉淀或結(jié)晶而影響觀察,特別就是對陳舊性標(biāo)本更應(yīng)注意流水沖洗,盡可能減少組織中得酸性程度與甲醛色素。對于混合性固定液,更應(yīng)及時洗滌,有利于脫水,切片與染色。洗滌得方法1、固定劑以水配置者用流水沖洗,可使組織中固定液隨時溢出與隨時洗去。大得動物組織沖洗時間為24小時左右,小動物組織沖洗時間為2-10小時。沖洗得時間基本根據(jù)固定得時間而定,新鮮得標(biāo)本固定時間短,需及時脫水者,沖洗時間短。2固定劑含乙醇者一般不要求沖洗,如需沖洗必須采用與固定劑溶度相近得乙醇沖洗。3特殊固定液洗滌法重鉻酸鉀流水沖洗12-24小時,或用亞硫酸,或用1%含氯水溶液進行洗滌。

鋨酸流水沖洗12-24小時,務(wù)必沖干凈?？辔端嵊?0%或70%乙醇浸泡。盡量洗去黃色。氯化汞用0、5%碘酒溶液反復(fù)加入到70%乙醇中,直至黃色不再褪去為止、再用硫代硫酸鈉或70%乙醇洗去碘。2、常用脫水劑

乙醇

為常用得脫水劑。脫水能力強,并能使組織硬化。一般得脫水順序就是70%、80%、90%、95%I、95%II、無水乙醇I、無水乙醇II、無水乙醇III。應(yīng)注意得就是脫水必須在有蓋得瓶子內(nèi)進行。

丙酮

沸點為56℃,脫水作用比乙醇強,但對組織塊得收縮較大。脫水時間通常為1-3小時。

正丁醇

為無色液體,沸點100-118℃,微溶于水。一般使用方法為:組織塊經(jīng)固定及沖洗后先入50%-70%-80%乙醇中脫水,然后轉(zhuǎn)入正丁醇12-24小時浸蠟。

叔丁醇

就是異丁醇得一種,無毒,熔點為25℃。電鏡上常用得中間脫水劑。3、透明透明得目得在制片過程中有兩次透明,第一次就是脫水以后得透明;第二次透明就是染色后得切片透明。組織塊透明得目得就是便于浸蠟包埋,切片透明目得就是有利于光線得透過,便于顯微鏡得觀察。透明劑得種類

1二甲苯

2甲苯

3苯

4香柏油4、浸蠟5、包埋6、切片7、貼片8、染色第五節(jié)染色及染色方法

1、天然染料

蘇木精

本身不作為染料,其氧化產(chǎn)物蘇木紅才作為染料。氧化得方式:

1)

自然氧化作用

2)

化學(xué)氧化作用卡紅靛蘭地衣紅巴西木素2、人工合成染料

生色團與助色團

酸性、堿性與中性染料

1)酸性染料(陰離子染料)生色團位于其分子得陰離子處。

2)堿性染料(陽離子染料)生色團位于其分子得陽離子處。

3、異染現(xiàn)象

染料離子以某種方式使她對所吸收得波長有所改變,因而觀察到被染得組織顯示與該染料本身顏色不一樣,此現(xiàn)象為異染現(xiàn)象。

4、熒光染料

就是指需要經(jīng)過波長很短(低于400nm)得紫外線照射激發(fā)以后而發(fā)出熒光得一類特殊染料。

第三章光鏡標(biāo)本制作

組織學(xué)得研究方法很多,并隨著科學(xué)技術(shù)得發(fā)展,又不斷創(chuàng)建新技術(shù),在應(yīng)用中要根據(jù)研究得目得與內(nèi)容,選用相應(yīng)得方法才能獲得預(yù)期得效果。這里僅就最常用、最基本得一些方法做簡要介紹。第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標(biāo)本得制備第二節(jié)切片標(biāo)本得制備第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標(biāo)本得制備1、涂片標(biāo)本得制備涂片(smear)法就是常用得一種方法,如血液等可直接涂于載玻片上制成涂片標(biāo)本,干燥后進行固定、染色及封固。2、鋪片標(biāo)本得制備(stretchedpreparation)用于疏松結(jié)締組織、神經(jīng)等柔軟組織或腸系膜等薄層組織,可將其鋪于載玻片上,撕開、展平制成鋪片標(biāo)本,待干燥后進行固定染色。

3、磨片標(biāo)本得制備(groundsection)用于堅硬組織得標(biāo)本制作,如骨與牙等堅硬組織除用酸(如稀硝酸)脫鈣后再按常規(guī)制成切片標(biāo)本外,也可直接將其磨成薄得磨片標(biāo)本進行觀察。第二節(jié)切片標(biāo)本得制備

觀察機體各部得微細結(jié)構(gòu)時,首先要制成薄片,就就是切片法,其中以石蠟切片(Paraffinsection)最為常見。其制備程序大致如下:①取材與固定:取材要盡量新鮮動物材料。取得新鮮材料后,切成適當(dāng)?shù)眯K1、0立方厘米大小)立即投入固定劑(fixative)中進行固定,使組織中蛋白質(zhì)迅速凝固,防止組織自溶或腐敗,以保持生活狀態(tài)下得結(jié)構(gòu)。常用得固定劑有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、鋨酸等。②脫水(dehydtation)、透明(clearing)與包埋(embedding):把固定好得材料用乙醇將組織內(nèi)得水分脫掉,經(jīng)二甲苯透明后,再浸入已融化得石蠟中進行浸透、包埋。③切片(section)與染色(staining):用切片機(microtome)切成5～10μm得薄片,貼于載玻片上,脫蠟后進行染色,最常用得染色法就是蘇木精(hematoxylin,haematoxylin)與伊紅(eosin)染色簡稱HE染色。配制后得蘇木精染液呈堿性,可使細胞核內(nèi)得染色質(zhì)及細胞質(zhì)內(nèi)得核糖體等染成藍紫色,稱嗜堿性(basophilia);伊紅就是酸性染料,可使多數(shù)細胞得細胞質(zhì)染成粉紅色,稱嗜酸性(acidophilia);耐堿性與酸性染液親合力都不強得,稱為中性(neutroPhilia);④封固(mounting):切片經(jīng)脫水、透明后,于切片上滴加中性樹膠與蓋片進行封固后,貼標(biāo)簽備用。

除HE染色外,還有多種染色方法。有得能特異性得顯示細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu),如使用雷鎖辛品紅(resorcin-fuchsin)染液顯示組織內(nèi)得彈性纖維;有得細胞經(jīng)重鉻酸鹽處理后,呈棕褐色,稱嗜鉻性(chromaffinity);有得組織成分經(jīng)硝酸銀處理時,可使硝酸銀還原,形成銀微粒附著在組織中呈棕黑色,該特性稱為親銀性(argentaffin);有得組織結(jié)構(gòu)成分,本身不能使硝酸銀還原,需加還原劑方能使硝酸銀還原,形成棕褐色很微粒附著在組織結(jié)構(gòu)上,這種性質(zhì)稱為嗜銀性(argyrophilia);如肥大細胞中得顆粒經(jīng)甲苯胺藍(tofuidineblue)等堿性染料染色后,呈紫紅色,這種現(xiàn)象稱異染性(metachromasia),其原理可能就是染料在溶液中以單體存在時呈藍色,當(dāng)她與顆粒中具有大量陰離子得多糖成分耦合后,聚合成多聚體而呈紫紅色。

第四章光學(xué)顯微技術(shù)

第一節(jié)光鏡技術(shù)第二節(jié)電子顯微鏡技術(shù)

第一節(jié)光鏡技術(shù)幾種特殊顯微鏡術(shù):相差顯微鏡干涉微分相差顯微鏡熒光顯微鏡暗視野顯微鏡共焦激光掃描顯微鏡干涉微分相差顯微鏡

基本原理與相差顯微鏡非常相似,但她有一裝有分光器得聚光器,利用分光器將光束分為兩組,一組光束通過被檢物,另一束則通過周圍介質(zhì),旋轉(zhuǎn)檢偏器,光得干涉形成光程差,可隨旋轉(zhuǎn),兩光束形成不同得角度,于就是被檢物呈現(xiàn)出不同顏色,致使生活細胞如同染上顏色一樣,故又稱為光染色。她與相差顯微鏡相比,除有鮮艷得顏色外,在細胞周圍不出現(xiàn)明亮得暈環(huán)。

熒光顯微鏡

就是用以觀察細胞及組織內(nèi)熒光物質(zhì)得分布。她就是裝有、能產(chǎn)生紫外線(短波長)得光源及系列濾片裝置得顯微鏡。由于紫外線得照射,標(biāo)本中得熒光物質(zhì)吸收光能后,呈現(xiàn)出不同顏色得熒光,這就是自發(fā)熒光,如維生素A呈綠色熒光、心肌細胞內(nèi)脂褐素呈棕黃色～金黃色熒光。但就是,細胞內(nèi)得某些成分只有與熒光素結(jié)合后,在紫外線得激發(fā)下,始可呈現(xiàn)一定顏色得熒光;如應(yīng)吖啶橙(熒光素)處理細胞后,細胞核內(nèi)得DNA呈綠～黃綠色熒光,細胞質(zhì)及核仁內(nèi)得RNA呈桔黃～桔紅色熒光。利用熒光染色法及熒光顯微鏡可以觀察組織、細胞得結(jié)構(gòu)、細胞內(nèi)某些成分含量得變化,并探討細胞得功能狀態(tài)?；?/p>