實時熒光定量PCR儀性能評價通則前言 I 2規(guī)范性引用文件 l3術語和定義 4縮略語 25要求 5.1工作條件 5.2外觀 25.3安全性 5.4環(huán)境適應性 35.5電磁兼容性 5.6性能要求 36評價方法 6.1外觀檢查 46.2安全性試驗 46.3環(huán)境適應性試驗 6.4電磁兼容性試驗 6.5性能試驗 47評價報告 附錄A(資料性)儀器升降溫循環(huán)程序和樣本測試孔位排布 A.1升降溫循環(huán)程序 A.2溫度控制性能試驗的孔位排布 A.3熒光檢測性能試驗的孔位排布 A.4整機性能試驗的孔位排布 附錄B(資料性)熒光參比溶液的制備方法 附錄C(資料性)兩組數(shù)據(jù)顯著差異的判斷方法 C.1兩組數(shù)據(jù)顯著差異的判斷方法 C.2F分布分位數(shù)表 C.3t分布分位數(shù)表 附錄D(資料性)報告格式示例 參考文獻 IGB/T42753—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國機械工業(yè)聯(lián)合會提出。本文件由全國工業(yè)過程測量控制和自動化標準化技術委員會(SAC/TC124)歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院、北京市科學技術研究院分析測試研究所(北京市理化分析測試中心)、蘇州百源基因技術有限公司、中國計量科學研究院、上海市計量測試技術研究院、西安天隆科技有限公司、蘇州雅睿生物技術股份有限公司、上海宏石醫(yī)療科技有限公司、杭州博日科技股份有限公司、鯤鵬基因(北京)科技有限責任公司、杭州晶格科學儀器有限公司、圣湘生物科技股份有限公司、安圖實驗儀器(鄭州)有限公司、深圳華大智造科技股份有限公司、上海科源電子科技有限公司、安徽皖儀科技股份有限公司、黑龍江省計量檢定測試研究院、麥成長(北京)生物技術有限公司、中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所、譜尼測試集團股份有限公司、甘肅國研檢驗檢測有限公司。本文件主要起草人：鄒明強、杜美紅、薛強、車團結、李靜雯、齊小花、高運華、梁文、王升、龔大江、1實時熒光定量PCR儀性能評價通則本文件規(guī)定了實時熒光定量PCR儀的要求、評價方法和評價報告。本文件適用于實時熒光定量PCR儀的性能評價，包括醫(yī)用臨床診斷用熒光定量PCR儀和一般分析用熒光定量PCR儀。其他基于聚合酶鏈式反應原理定量或定性分析靶核酸片段的裝置參考本文件執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T11606分析儀器環(huán)境試驗方法GB/T14710醫(yī)用電器環(huán)境要求及試驗方法GB/T18268.1測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第1部分：通用要求GB/T18268.26測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第26部分：特殊要求體外診斷(IVD)醫(yī)療設備GB/T34065—2017分析儀器的安全要求GB/T34797核酸引物探針質(zhì)量技術要求GB/T35542TaqDNA聚合酶YY0648測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第2-101部分：體外診斷(IVD)醫(yī)用設備的專用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。實時熒光定量PCR儀quantitativereal-timepolymerasechainreactionanalyzer基于聚合酶鏈式反應原理，通過溫度變化循環(huán)程序進行靶核酸片段的體外擴增，同時對循環(huán)過程中熒光信號進行實時采集和處理，定量或定性分析靶核酸片段的儀器。每個PCR反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。儀器孔位平均溫度達到設定值(偏差±0.5℃以內(nèi))且保持該溫度的一段時間。2溫度波動度temperaturefluctuation儀器恒溫階段中，孔位的溫度變化幅度。溫度均勻度temperatureuniformity儀器恒溫階段中，各孔位之間的溫度一致性。熒光強度重復性fluorescentrepeatability在相同溫度和熒光條件下，儀器孔位的熒光強度重復檢測值的一致性。熒光強度均勻度fluorescentuniformity在相同溫度和熒光條件下，儀器各孔位之間的熒光強度檢測值的一致性。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)5要求5.1工作條件實時熒光定量PCR儀(以下簡稱儀器)在下列條件下應能正常工作。a)環(huán)境溫度：15℃~30℃。b)相對濕度：不大于80%。c)供電電源：符合儀器額定供電電壓和頻率；電源電壓波動不超出±22V,交流頻率的變化在±1Hz范圍內(nèi)。d)工作環(huán)境無影響儀器性能的機械振動和沖擊。e)工作環(huán)境無影響儀器性能的電磁場干擾。儀器外觀應滿足如下要求：b)所有銘牌及標志耐久清晰，內(nèi)容符合相關法規(guī)、標準的要求；c)所有固件無松動，各種調(diào)節(jié)件靈活，功能正常；d)零件表面無銹蝕；e)儀器可拆部分能無障礙地拆裝。5.3安全性一般分析用熒光定量PCR儀(以下簡稱分析儀器)分析儀器應滿足GB/T34065—2017的要求，醫(yī)用臨床診斷用熒光定量PCR儀(以下簡稱醫(yī)用儀器)醫(yī)用儀器還應滿足YY0648的要求。35.4環(huán)境適應性分析儀器應滿足GB/T11606的要求，醫(yī)用儀器還應滿足GB/T14710的要求。5.5電磁兼容性分析儀器應滿足GB/T18268.1的要求，醫(yī)用儀器還應滿足GB/T18268.26的要求。5.6性能要求5.6.1溫度控制性能在50℃~90℃范圍內(nèi)，平均升溫速率應不小于1.5℃/s。在50℃~90℃范圍內(nèi)，平均降溫速率應不小于1.5℃/s。在恒溫階段，溫度的波動應不超過±0.2℃。實際溫度與設置溫度之差應不超過±0.5℃。在恒溫階段，加熱模塊不同孔位同一時刻最大值與最小值之差應不大于1℃。溫度的實際持續(xù)時間與設置時間的誤差應不超過士5s。5.6.2熒光檢測性能每個熒光通道的單孔熒光強度重復檢測，相對標準偏差應不大于2%。每個熒光通道的孔間熒光強度，相對標準偏差應不大于5%。熒光參比物質(zhì)各濃度的熒光強度值與稀釋比例的線性回歸相關系數(shù)(r)應不低于0.990。5.6.3.1不同通道熒光干擾儀器應判定相應目標通道結果為陽性或給出Ct值，其他通道結果為陰性或未檢出。4各濃度梯度的DNA標準物質(zhì)測得的Ct值與濃度對數(shù)值的線性回歸相關系數(shù)(r)的絕對值應不低于0.990。置信水平99.9%時能有效分辨不同濃度DNA樣本(濃度相差不大于2倍)的差異。相同DNA樣本在不同孔位測得的濃度對數(shù)值的相對標準偏差應不大于2%。測得的DNA標準物質(zhì)濃度對數(shù)值與標稱濃度的對數(shù)值的相對誤差應不超過±15%。相同DNA樣本在同一儀器上多次測得的Ct值的相對偏差應不大于5%。6評價方法6.1外觀檢查以目視和手感進行檢查。6.2安全性試驗分析儀器標識檢查、接觸電流試驗、介電強度試驗、保護接地電阻的試驗方法按GB/T34065—2017第5章、6.2、6.3、6.4執(zhí)行；醫(yī)療儀器按YY0648相應試驗方法執(zhí)行。6.3環(huán)境適應性試驗分析儀器按GB/T11606相應試驗方法執(zhí)行，醫(yī)療儀器按GB/T14710相應試驗方法執(zhí)行。6.4電磁兼容性試驗分析儀器按GB/T18268.1相應試驗方法執(zhí)行，醫(yī)療儀器按GB/T18268.26相應試驗方法執(zhí)行。6.5性能試驗6.5.1溫度控制性能至少包括下列儀器和材料?？蓽y量溫度范圍0℃~120℃,分辨力0.01℃,示值誤差在±0.1℃范圍內(nèi)，采集頻率不小于每秒一次。b)礦物油等導熱介質(zhì)。5GB/T42753—2023按儀器說明書預熱，將計量標準專用測溫儀的溫控探頭表面涂抹適量的導熱介質(zhì)，放入待測樣本反應孔中。測試孔位在儀器中均勻分布(包含各方向邊緣和中間的孔位，孔位排布參照圖A.1);當儀器少于8個孔時，應全部檢測；當儀器具有8個孔至48個孔時，應檢測不少于8個；當儀器具有48個孔以上時，應檢測不少于12個。開啟測溫儀，確認運行正常。參照儀器說明書設置并運行45℃(1min)、95℃(1min)的循環(huán)程序，3次循環(huán)；再運行45℃(1min)、72℃(1min)、95℃(1min)的循環(huán)程序，5次循環(huán)。用計量標準專用測溫儀記錄循環(huán)程序運行時相應的溫度和時間。當儀器溫控模塊為分區(qū)設置，各獨立控溫區(qū)域單獨測試，孔位分布均按上述要求執(zhí)行。6.5.1.3升溫速率的計算在45℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序的第3次循環(huán)升溫過程中，計算各測試孔位每秒的溫度平均值。取最接近50℃的溫度點，記為T。,取最接近90℃的溫度點，記為T,,得出T.、T,以及T。到達T,的時間t?,按照公式(1)計算平均升溫速率?！?1)式中：V?——平均升溫速率，單位為攝氏度每秒(℃/s);T?——各孔位溫度平均值中最接近90℃的溫度點，單位為攝氏度(℃);T?——各孔位溫度平均值中最接近50℃的溫度點，單位為攝氏度(℃);t?——T。到達T,的時間，單位為秒(s)。6.5.1.4降溫速率的計算在45℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序的第3次循環(huán)降溫過程中，計算各測試孔位每秒的溫度平均值。取最接近90℃的溫度點，記為T。,取最接近50℃的溫度點，記為Ta,得出T。、Ta以及T。到達Ta的時間t?,按照公式(2)計算平均降溫速率(V?)。式中：V?——平均降溫速率，單位為攝氏度每秒(℃/s);Tc——各孔位溫度平均值中最接近90℃的溫度點，單位為攝氏度(℃);Ta——各孔位溫度平均值中最接近50℃的溫度點，單位為攝氏度(℃);t?——T.到達Ta的時間，單位為秒(s)?！?.5.1.5溫度波動度的計算在45℃(1min)、72℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序中，分別在3個溫度點進入恒溫階段15s后開始計時，統(tǒng)計30s內(nèi)同一孔位的最高溫度和最低溫度，其差值的一半為該測試孔位的溫度波動度，按照公式(3)計算?！?GB/T42753—2023式中：△T——第k個測試孔位的溫度波動度，單位為攝氏度(℃);Tmx——第k個測試孔位的恒溫30s內(nèi)溫度的最大值，單位為攝氏度(℃);Tmin——第k個測試孔位的恒溫30s內(nèi)溫度的最小值，單位為攝氏度(℃)。計算全部測試孔位△T的平均值，取5次循環(huán)的最大值，并在數(shù)值前面冠以“±”符號，作為溫度波動度。6.5.1.6溫度示值誤差的計算在45℃(1min)、72℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序中，分別在3個溫度點進入恒溫階段15s時采集1次溫度，之后每隔10s采集溫度，按照公式(4)計算測試孔位溫度平均值與設置溫度的差值。式中：△T?！骋粫r刻溫度示值誤差，單位為攝氏度(℃);T,——第k個孔位測得的溫度，單位為攝氏度(℃);n——測試孔位數(shù)，單位為個；T、——設置溫度(45℃、72℃或95℃),單位為攝氏度(℃)。單次循環(huán)共采集5次溫度，計算△T。的平均值，取5次循環(huán)△T。平均值的絕對值最大值，作為溫度示值誤差。6.5.1.7溫度均勻度的計算在45℃(1min)、72℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序中，分別在3個溫度點進入恒溫階段15s時采集1次溫度，之后每隔10s采集溫度，按照公式(5)計算不同孔位最高溫度與最低溫度的差值。△T;=T;max—T;mm…式中：△T;——某一時刻不同孔位最高溫度與最低溫度的差值，單位為攝氏度(℃);T;max——某一時刻n個測試孔位測得溫度的最大值，單位為攝氏度(℃);T;min——某一時刻n個測試孔位測得溫度的最小值，單位為攝氏度(℃)。單次循環(huán)共采集5次溫度，統(tǒng)計5次循環(huán)，共計算25次△T;,取最大值作為溫度均勻度。6.5.1.8溫度持續(xù)時間誤差的計算在45℃(1min)、72℃(1min)、95℃(1min)循環(huán)程序中，以94.5℃為計時參考點，統(tǒng)計測試孔位的平均溫度，自溫度首次達到計時參考點以上開始計時，至溫度降至計時參考點以下結束計時，記錄時間為t?,共記錄5次循環(huán)的持續(xù)時間，按公式(6)計算持續(xù)時間誤差。式中：△t——溫度持續(xù)時間誤差，單位為秒(s);t,——第h次循環(huán)的記錄時間，單位為秒(s)。7GB/T42753—20236.5.2熒光檢測性能除分子生物學實驗室常規(guī)設備材料外，其他需要的設備和材料如下。a)熒光參比物質(zhì)：6-羧基熒光素(6-FAM)、6-羧基六氯熒光素(6-HEX)、6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)、花青素5(Cy5)等，熒光參比溶液的配制方法見附錄B。根據(jù)儀器的熒光檢測通道，每個目標檢測通道選擇相應的熒光參比溶液進行檢測。分別配制不少于5個濃度(C?,C?,C?,C?,C?)的熒光參比溶液。其中，重復性試驗取中濃度(C?)熒光參比溶液放置于1個邊角的孔位，在合適的恒定溫度下(如37℃),連續(xù)采集該孔位在相應通道下的熒光強度值，從第3次檢測開始連續(xù)記錄7次的熒光強度值。均勻度試驗，使用C?溶液置于待測孔位，采集一次相應通道的熒光數(shù)據(jù)，或?qū)?溶液依次放置于待測孔位，每次都采集相應通道的熒光數(shù)據(jù)，檢測孔位要求與6.5.1.2一致，孔位排布參照表A.2。熒光強度線性試驗，在各種熒光參比溶液中每個濃度選擇3個孔位，采集一次相應通道的熒光數(shù)據(jù)，孔位排布參照表A.3。當儀器少于16個孔時，每種濃度熒光參比溶液應檢測1個或2個孔位。6.5.2.3熒光強度重復性的計算采集每種熒光參比物質(zhì)的同一孔位重復檢測的熒光強度值，計算7次重復檢測的熒光強度值的平均值，按照公式(7)分別計算每種熒光參比物質(zhì)重復檢測的相對標準偏差。R?——每種熒光參比物質(zhì)重復檢測的相對標準偏差；F——第i次測得的熒光強度值；F——同一孔位重復檢測7次的熒光強度值的平均值。)6.5.2.4熒光強度均勻度的計算采集每種熒光參比物質(zhì)各測試孔位的熒光強度值，分別計算各測試孔位熒光強度值的平均值，根據(jù)公式(8)分別計算每種熒光參比物質(zhì)的各測試孔位的熒光強度值相對標準偏差?！?8)R,——每種熒光參比物質(zhì)m個測試孔位熒光強度值的相對標準偏差；m——每種熒光參比物質(zhì)的測試孔位數(shù)；8GB/T42753—2023F?——第k個檢測孔位測得的熒光強度值；Fp——每種熒光參比物質(zhì)m個測試孔位熒光強度值的平均值。6.5.2.5熒光強度線性的計算分別計算每種熒光參比物質(zhì)不少于5個濃度熒光強度的平均值，與稀釋比例計算線性相關系數(shù)6.5.3整機性能6.5.3.1儀器和材料除分子生物學實驗室常規(guī)設備材料外，其他設備和材料如下。a)DNA標準物質(zhì)：國家有證標準物質(zhì)，包括線性標物和樣本標物，線性標物為10倍濃度梯度的DNA標準物質(zhì)系列溶液，不少于6個濃度，最低濃度為101copies/μL;樣本標物為2個中濃度(103copies/μL～101copies/μL)的DNA標準物質(zhì)溶液，二者濃度相差不大于2倍，宜采用重量法稀釋。b)熒光定量PCR檢測試劑：TaqDNA聚合酶符合GB/T35542的要求，引物探針符合GB/T34797的要求，探針的熒光基團根據(jù)儀器的熒光檢測通道確定。d)微量移液器：量程為10μL、20μL和100μL,最小刻度為0.1μl.根據(jù)儀器的熒光檢測通道，每個目標檢測通道選擇相應的探針進行儀器線性的檢測；根據(jù)儀器的檢測范圍，選取不少于6個濃度的線性標物，其他熒光定量PCR檢測試劑均保持一致，每個濃度重復檢測3個孔；另選取2個濃度的樣本標物，采用常用熒光通道的探針，每個濃度重復檢測不少于7個孔；孔位排布參照表A.4。當儀器具有8個孔至16個孔時，每種濃度的線性標物應檢測1個或2個孔位，每種濃度的樣本標物應重復不少于4個孔位；當儀器少于8個孔時，應進行重復性試驗，不宜進行區(qū)分度和線性試驗。根據(jù)DNA標準物質(zhì)和熒光定量PCR檢測試劑的說明書設置溫度循環(huán)程序，使用儀器所有通道采集熒光信號，記錄每個測試孔位的Ct值。從重復性試驗測試孔位中選擇3個孔位，采用相同濃度的樣本標物和試劑，再重復2次即為該儀器的穩(wěn)定性試驗。6.5.3.3不同通道熒光干擾采集線性標物的最高濃度和最低濃度測試孔位在所有熒光通道下的檢測結果。6.5.3.4儀器線性的計算計算各濃度線性標物在相應通道下Ct值的平均值，用標物標稱濃度的對數(shù)值與該Ct值均值擬合標準曲線，計算線性相關系數(shù)r。6.5.3.5DNA濃度區(qū)分度的計算采集2個濃度樣本標物在相應通道下Ct值，分別計算平均值，再按照公式(9)分別計算方差。9式中：S2—-樣本標物x個測試孔位Ct值的方差；x——每個樣本標物的測試孔位數(shù)；X?！赾個測試孔位的Ct值；驗證兩組Ct值在置信水平99.9%時是否有顯著差異，具體方法見附錄C。6.5.3.6定量重復性的計算通過6.5.3.4得到的標準曲線，分別計算樣本標物每個孔位的Ct值對應的DNA濃度對數(shù)值，計算樣本標物DNA濃度對數(shù)值的平均值，按公式(10)計算相對標準偏差。式中：R.——樣本標物x個測試孔位DNA濃度對數(shù)值的相對標準偏差；x——樣本標物的測試孔位數(shù)，單位為個；M——第c個孔位測得的DNA濃度對數(shù)值；M樣本標物x個測試孔位DNA濃度對數(shù)值的平均值。………(10)6.5.3.7定量示值誤差的計算通過6.5.3.6得到的樣本標物DNA濃度對數(shù)值的平均值(M),按公式(11)計算定量示值誤差。式中：δ——定量示值誤差；M濃度對數(shù)值的平均值；D——標準物質(zhì)標稱值。6.5.3.8穩(wěn)定性的計算3次重復試驗中，計算每次試驗3個測試孔位的Ct值平均值(X),然后按公式(12)計算相對偏差。式中：B——3次試驗各孔位Ct值平均值的相對偏差；Xmx—3次試驗各孔位Ct值平均值中的最大值；Xma——3次試驗各孔位Ct值平均值中的中間值；x——3次試驗各孔位Ct值平均值中的最小值?！?評價報告價機構、地點、時間等信息，并附評價試驗的原始記錄，評價統(tǒng)計匯總表和記錄表的格式自行制定，但要包含以上內(nèi)容。格式參見表D.1。(資料性)儀器升降溫循環(huán)程序和樣本測試孔位排布A.1升降溫循環(huán)程序儀器的溫度控制性能試驗中升降溫循環(huán)程序按表A.1進行。表A.1升降溫循環(huán)程序步驟設定溫度/℃持續(xù)時間/s循環(huán)次數(shù)13次循環(huán)2A.2溫度控制性能試驗的孔位排布B以整體控溫96孔儀器為例，在圖A.1)所示孔位中進行溫度控制性能的檢測。8989a)96孔儀器b)48孔儀器圖A.1溫度控制性能試驗的孔位分布圖A.3熒光檢測性能試驗的孔位排布以96孔4通道儀器為例，在圖A.2所示孔位中進行熒光強度均勻度檢測。l23456789AFAMHEXROXCy5FAMROXBHEXROXCy5FAMHEXCy5CROXCy5FAMHEXROXFAMDCy5FAMHEXROXCy5HEXEFAMROXCy5FAMHEXROXFHEXCy5FAMHEXROXCy5GROXFAMHEXROXCy5FAMHCy5HEXROXCy5FAMHEX注：FAM代表熒光參比物質(zhì)6-FAM,HEX代表熒光參比物質(zhì)6-HEX,ROX代表熒光參比物質(zhì)6-ROX。圖A.2熒光強度均勻度檢測的孔位分布圖以96孔4通道儀器為例，在圖A.3所示孔位中進行熒光強度線性檢測。123456789AFAM-1FAM-1FAM-1FAM-2FAM-2FAM-2FAM-3FAM-3FAM-3一—BFAM-4FAM-4FAM-4FAM-5FAM-5FAM-5FAM-6FAM-6FAM-6CHEX-1HEX-1HEX-1HEX-2HEX-2HEX-2HEX-3HEX-3HEX-3一一 DHEX-4HEX-4HEX-4HEX-5HEX-5HEX-5HEX-6HEX-6HEX-6—一—EROX-1ROX-1ROX-1ROX-2ROX-2ROX-2ROX-3ROX-3ROX-3FROX-4ROX-4ROX-4ROX-5ROX-5ROX-5ROX-6ROX-6ROX-6—GCy5-1Cy5-1Cy5-1Cy5-2Cy5-2Cy5-2Cy5-3Cy5-3Cy5-3一HCy5-4Cy5-4Cy5-4Cy5-5Cy5-5Cy5-5Cy5-6Cy5-6Cy5-6一注：熒光物質(zhì)之后的數(shù)字1～6表示熒光參比物質(zhì)濃度從低到高的溶液。圖A.3熒光強度線性檢測的孔位分布圖A.4整機性能試驗的孔位排布以96孔4通道儀器為例，在圖A.4所示孔位中進行整機性能qPCR反應檢測。123456789AFAM-1FAM-1FAM-1U-1FAM-2FAM-2FAM-2U-2FAM-3FAM-3FAM-3U-1BFAM-6FAM-6FAM-6U-1FAM-5FAM-5FAM-5U-2FAM-4FAM-4FAM-4U-1CHEX-1HEX-1HEX-1U-1HEX-2HEX-2HEX-2U-2HEX-3HEX-3HEX-3U-2DHEX-6HEX-6HEX-6U-1HEX-5HEX-5HEX-5U-2HEX-4HEX-4HEX-4U-2EROX-1ROX-1ROX-1U-1ROX-2ROX-2ROX-2U-2ROX-3ROX-3ROX-3NTCFROX-6ROX-6ROX-6U-1ROX-5ROX-5ROX-5U-2ROX-4ROX-4ROX-4NTCGCy5-1Cy5-1Cy5-1U-1Cy5-2Cy5-2Cy5-2U-2Cy5-3Cy5-3Cy5-3—HCy5-6Cy5-6Cy5-6U-1Cy5-5Cy5-5Cy5-5U-2Cy5-4Cy5-4Cy5-4注：FAM、HEX、ROX和Cy5表示探針上的熒光基團，其后的數(shù)字1～6表示線性標物的濃度從低到高的溶液，U-1和U-2分別表示2個濃度的樣本標物，用FAM熒光探針檢測。(資料性)熒光參比溶液的制備方法稱取1.0mg熒光參比物質(zhì)，溶于1.0mL水(如果在水中難以溶解，可加入二甲基亞砜等增加溶解度),并稀釋至0.001mg/mL。再連續(xù)10倍稀釋3～5個濃度，進行熒光檢測的預實驗，根據(jù)測得的熒光強度值，估計該儀器的熒光檢測線性范圍，選擇合適的稀釋度作為熒光參比物質(zhì)溶液的最高濃度。以最高濃度的100%、80%、60%、40%、20%和10%的比例進行稀釋，配制系列熒光參比溶液。宜采用重量法稀釋，減少微量移液器進行體積稀釋造成的誤差。常見熒光參比物質(zhì)見表B.1。表B.1熒光參比物質(zhì)舉例序號熒光參比物質(zhì)CAS登錄號(包括衍生物)16-羧基熒光素(6-FAM)3301-79-9/92557-81-826-羧基六氯熒光素(6-HEX)155911-16-3/2129651-79-036-羧基-X-羅丹明(6-ROX)194785-18-7/216699-36-44花青素5(Cy5)146368-15-2/146368-11-8/1032678-42-45花青素5.5(Cy5.5)210892-23-2/442912-55-2/1144107-80-1(資料性)兩組數(shù)據(jù)顯著差異的判斷方法C.1兩組數(shù)據(jù)顯著差異的判斷方法C.1.1方差齊性檢驗C.1.1.1計算法按公式(C.1)計算F:式中：S?2,S?2—-分別為2個樣本標物的方差，且S?2不小于S22。置信水平為95%時，進行雙側檢驗，查表C.1,自由度為x-1(x為樣本含量，即測試孔數(shù))。若F<F?g?s(x—1),則兩方差齊；若F≥F?,g?5(x-1),則兩方差不齊。C.1.1.2軟件法設置顯著性水平α=0.05進行雙側檢驗(只支持單側檢驗時設置α=0.025),若分析結果中概率P>0.05,則兩方差齊；若P≤0.05,則兩方差不齊。C.1.2均值比較C.1.2.1計算法按公式(C.2)計算t:式中：X?,X?——分別為2個