DB33/T2269—2020

豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重熒光定量PCR檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重熒光定量PCR的檢測方法。

本標準適用于豬圓環(huán)病毒2型與3型的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3縮略語

下列縮略語適用于本文件。

Ct值：達到閾值的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSolution）

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）

PCV-2：豬圓環(huán)病毒2型（PorcineCircovirus2）

PCV-3：豬圓環(huán)病毒3型（PorcineCircovirus3）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

4試劑和材料

除非另有說明，所用試劑均為分析純；滅菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaOH配制中所使用的

水應(yīng)符合GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法中一級水的要求。

4.1DNAzolReagent：DNA抽提試劑，2℃～8℃保存。

4.2無水乙醇：4℃預冷。

4.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌水配制，-20℃預冷。

4.48mmol/LNaOH溶液：配制方法見附錄A。

4.50.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法見附錄A。

4.62×PremixHSTaq（內(nèi)含PCRbuffer，HSTaq，dNTPs，Mg2+，RNaseH等）。

4.7陽性對照：豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒3型陽性克隆質(zhì)粒。PCV-3目的基因（ORF2）

序列見附錄A。

4.8空白對照：滅菌水。

4.9用于熒光定量PCR的引物濃度為10μmol/L，Taqman探針濃度5μmol/L，其序列分別為：

——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’；

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——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；

——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’；

——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’；

——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’；

——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。

4.10一次性耗材：乳膠手套、1.5mL離心管、15mL離心管、熒光PCR反應(yīng)管和吸頭。

5器材和設(shè)備

5.1電熱干燥箱。

5.2高壓滅菌鍋。

5.3高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃，最大離心速度可達12000r/min以上。

5.4冷藏冰箱，超低溫冰箱（-80℃）。

5.5熒光PCR檢測儀。

5.6組織勻漿器。

5.7移液器。

5.8研缽。

6實驗室分區(qū)

檢測實驗室應(yīng)有相應(yīng)的生物安全設(shè)施和功能分區(qū)，包括樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)、試劑配制區(qū)和擴

增區(qū)。各功能區(qū)有專用的試劑和實驗材料，不可交叉使用。

7樣品的采集與處理

7.1采樣注意事項

采樣及樣品前處理過程中應(yīng)注意無菌操作，防止樣本交叉污染。

7.2采樣工具

藥匙、剪刀、鑷子，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。

7.3采樣方法與處理

7.3.1內(nèi)臟樣品

采取病死或剖殺豬的主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和腎臟）裝入15mL滅菌離心管中，按1：4

倍體積加入滅菌的0.01mol/LPBS。運送至實驗室后，再用研缽或組織勻漿器對組織進行充分研磨混

勻，反復凍融3次。在4℃條件下以3000r/min離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號

備用，待檢。

7.3.2血清樣品

血清樣品無需處理，直接用于核酸提取。

7.4存放與運送

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采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6h～8h之內(nèi)運送到實驗室。采集或處理的

樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；需長期保存時，應(yīng)放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復凍融（凍

融不超過3次）。

8核酸提取

8.1一般要求

應(yīng)在核酸提取區(qū)進行。

8.2DNAzol法抽提核酸

8.2.1取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)、2管陽性對照及2管空白對照之和，對每

個離心管進行編號。

8.2.2每管加入500μLDNAzol，分別加入待檢樣品、陽性對照和空白對照各250μL，顛倒10次混

勻，靜置5min；于4℃，10000r/min離心10min。

8.2.3取900μL上清，置于新的1.5mL滅菌離心管中，每使用1mLDNAzol，加500μL無水乙醇，

顛倒混勻5次～8次，室溫放置1min～3min；于4℃，5000r/min離心5min。

8.2.4棄上清，沿管壁緩緩加入1mL75%乙醇，顛倒混勻3次～6次，靜置0.5min～1min；4℃，

1000r/min離心2min。反復洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干（以無乙醇味為準）。

8.2.5用50μL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

8.3核酸提取等效方法

可采用核酸提取試劑盒或自動化核酸抽提儀及配套核酸抽提試劑進行核酸抽提。

9實時熒光PCR檢測

9.1實時熒光PCR擴增體系的配制

9.1.1在試劑配制區(qū)進行。

9.1.2設(shè)PCR反應(yīng)數(shù)為n，其中n為待檢樣品數(shù)、2管陽性對照及2管空白對照之和，每個樣本測試反

應(yīng)體系配制見表1。配制完畢的反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)加樣。

表1每個樣品反應(yīng)體系配制表

體系組分用量

2×PremixHSTaq10μL

PCV-2-F0.4μL

PCV-2-R0.4μL

PCV-2-P0.8μL

PCV-3-F0.4μL

PCV-3-R0.4μL

PCV-3-P0.8μL

DEPC水4.8μL

總量18μL

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9.2加樣

9.2.1在核酸提取區(qū)進行。

9.2.2在各設(shè)定的熒光PCR管中分別加入本標準8.2.5中制備的2μLDNA溶液，蓋緊管蓋后，3000

r/min離心30s；上機前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。

9.3實時熒光PCR擴增

9.3.1在擴增區(qū)進行。

9.3.2將本標準9.2中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣品擺放順序。

9.3.3循環(huán)條件設(shè)置：

a)95℃條件下預變性30s；

b)95℃條件下變性5s；60℃條件下擴增30s，40個循環(huán)；60℃時設(shè)置采集熒光。

9.4熒光通道設(shè)定

PCV-2ReportDye設(shè)定為FAM，QuencherDye設(shè)定為BHQ；PCV-3ReportDye設(shè)定為HEX，QuencherDye

設(shè)定為BHQ。

10結(jié)果判定

10.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陽性對照品“S”型曲線指數(shù)擴增初

期的熒光值為準。

10.2質(zhì)控標準

陽性對照品FAM和HEX通道的Ct值均應(yīng)≤30.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴增曲線；空白對照品FAM

和HEX通道均無Ct值，且無典型擴增曲線。陽性對照和空白對照同時成立可判定試驗有效，否則試驗

無效。

10.3結(jié)果描述及判定

10.3.1若被檢樣品FAM通道Ct值≤36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴增曲線，判定為PCV-2核酸陽性；若

被檢樣品FAM通道無Ct值，且無典型的擴增曲線，判定為PCV-2核酸陰性；若被檢樣品FAM通道Ct

值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴增曲線，建議對該樣品進行重復試驗，重復試驗結(jié)果Ct值≤38.0且出現(xiàn)

典型擴增曲線者判為PCV-2核酸陽性，否則判為PCV-2核酸陰性。

10.3.2若被檢樣品HEX通道Ct值≤36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴增曲線，判定為PCV-3核酸陽性；若

被檢樣品HEX通道無Ct值，且無典型的擴增曲線，判定為PCV-3核酸陰性；若被檢樣品HEX通道Ct

值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴增曲線，建議對該樣品進行重復試驗，重復試驗結(jié)果Ct值≤38.0且出現(xiàn)

典型擴增曲線者判為PCV-3核酸陽性，否則判為PCV-3核酸陰性。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

配制方法

A.18mmol/LNaOH溶液的配制

稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL二級水中，混勻，分裝，常溫保存。

A.20.01mol/LPBS（pH7.2）的配制

稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，氯化鉀（KCl）0.2g，氯

化鈉（NaCl)8g，加二級水定容至1000mL，完全溶解后用3mol/L的NaOH調(diào)pH為7.2，經(jīng)121℃（±2℃），

高壓滅菌15min，室溫保存。

A.3PCV-3目的基因（ORF2）序列

ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTA