高效液相色譜法()第1節(jié)高效液相色譜儀2HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作；還會影響檢測器的正常響應(yīng)。一、輸液系統(tǒng)（一）溶劑脫氣與過濾①抽真空脫氣②超聲波振蕩脫氣③吹氦脫氣溶劑應(yīng)經(jīng)過0.45μm濾膜過濾，以除去溶劑中的固體雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱、管路系統(tǒng)，保護(hù)高壓泵3（二）高壓輸液泵對輸液泵的基本要求：

①流量準(zhǔn)確可調(diào)。流動相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常要求小于±0.5%。②耐高壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa的高壓。③液流穩(wěn)定。輸出的液流應(yīng)無脈動④泵的死體積小。泵的死體積通常要求小于0.5mL。⑤密封性能好，耐腐蝕4輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。5（三）梯度洗脫裝置等度洗脫：用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫，方法簡便、色譜柱易再生等是其優(yōu)點(diǎn)。

梯度洗脫：在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的配比，逐步提高洗脫強(qiáng)度。梯度洗脫可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分，都能在各自適宜的分離條件下分離。

梯度洗脫的特點(diǎn)：①縮短分析周期；②提高分離效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加檢測靈敏度。⑤基線漂移及重復(fù)性不佳6等度洗脫與梯度洗脫（弱）（強(qiáng)）A→B（弱→強(qiáng)）7高壓梯度（外梯度）:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱低壓梯度（內(nèi)梯度）:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。8二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好。流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，結(jié)構(gòu)如圖所示：9三、分離系統(tǒng)使用色譜柱注意事項(xiàng)：1溶劑和樣品應(yīng)過濾，防止堵塞。2加前置柱。3用完后要清洗色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，10四、檢測系統(tǒng)要求檢測器靈敏度高、噪聲低、死體積小、線性范圍寬、重復(fù)性好、適用范圍廣等。（一）紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。11紫外檢測器包括固定波長、可變波長和光電二極管陣列檢測器121024個(gè)二極管陣列10ms完成一次檢測，1s采集100000個(gè)含吸光度、波長、時(shí)間的數(shù)據(jù)，得到一張吸光度、波長、保留時(shí)間的三維色譜圖。13靈敏度高；線性范圍寬；流通池可做得很小(1mm×10mm，容積8μL)；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。特點(diǎn)：（二）熒光檢測器高靈敏度，高選擇性。對多環(huán)芳烴，維生素B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。1415（三）示差折光檢測器通用型檢測器，但靈敏度低，對溫度敏感，不能用于梯度洗脫可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。16（四）蒸發(fā)光散射檢測器這種檢測器可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分的檢測，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度較低，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸及甾體等幾十類化合物。在一定的條件下，光散射強(qiáng)度正比于溶質(zhì)粒子的大小和數(shù)量。散射光強(qiáng)度與樣品微粒質(zhì)量的關(guān)系為I=kmb式中，m為微粒質(zhì)量，k、b為實(shí)驗(yàn)條件（如溫度、流動相性質(zhì)）決定的常數(shù)。因此可根據(jù)散射光強(qiáng)度對樣品進(jìn)行定量分析。1718五、數(shù)據(jù)記錄處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱色譜工作站：它可對分析全過程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進(jìn)行在線顯示，自動采集、處理和儲存分析數(shù)據(jù)。19第2節(jié)基本理論高效液相色譜法的塔板理論與氣相色譜法完全相同，速率理論略有差異。一、柱內(nèi)展寬1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng)與氣相色譜法相同，A＝2λdp

高效液相色譜多使用3～10um球形固定相顆粒,以均漿高壓裝填，A較小。202.分子擴(kuò)散項(xiàng)3.流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)流動相傳質(zhì)阻力，實(shí)際包括兩方面，一是移動流動相傳質(zhì)阻力Hm，二是滯流（靜態(tài)）流動相傳質(zhì)阻力Hsm。組分在液體中的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中,B/u很小，可忽略不計(jì)。2122a.移動流動相傳質(zhì)阻力（Cmu）當(dāng)流動相在色譜柱內(nèi)流動時(shí)，離固定相較遠(yuǎn)的組分流動較快，處于固定相顆粒表面的組分流動較慢，由于這種差別，會使組分的色譜峰擴(kuò)展.展寬大小與固定相顆粒直徑平方成正比，與流動相線速度成正比，與組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比：b.滯流流動相傳質(zhì)阻力（Csmu）2324流動相在色譜柱中流動時(shí)，有部分流動相進(jìn)入到多孔的固定相深孔中，滯留后難以流動。組分分子進(jìn)入滯留區(qū)造成色譜峰擴(kuò)展，使柱效降低，4.固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Csu）組分分子在固定液中傳質(zhì)時(shí)，因所受到的阻力不同而引起色譜峰擴(kuò)展在鍵合相色譜法中，df很?。▎畏肿訉樱?，固定相傳質(zhì)阻力可以忽略。25在高效液相色譜中，范第姆特方程可寫成：H＝A+Cu＝A+Cmu+Csmu隨著u的增大，H增大，柱效降低，故其最佳流速就在u很小的地方。26為了減小柱內(nèi)展寬，提高柱效，可采取以下措施：(1)用小而均勻的球形固定相，填充均勻，以減少渦流擴(kuò)散。（2）使用低粘度的小分子溶劑作流動相，減小流動相傳質(zhì)阻力；(3)流動相的流速低，一般控制在1mL/min左右二、柱外展寬（4）柱溫25℃左右為宜。柱溫太高，雖Dm增大，傳質(zhì)阻力減小，但易產(chǎn)生氣泡，太低不僅減小Dm，使傳質(zhì)阻力增大，而且流動相的粘度增大，柱阻加大。27采用小體積檢測器，管道對接宜呈流線形，減少柱外死體積，從而減小柱外展寬，提高柱效。從進(jìn)樣器到檢測器之間，除色譜柱以外，其它因素導(dǎo)致的譜峰展寬。28HPLC高效液相LSC液固LLC液液IEC離子交換SEC空間排阻AC親和色譜IC離子色譜BPC化學(xué)鍵合相NPBPC正相—RPBPC反相—PIC離子對ISC離子抑制第3節(jié)各類高效液相色譜法29一、吸附色譜法固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑.有時(shí)也用高分子多孔小球（吸附+分配并兼有小孔凝膠作用）以固體吸附劑為固定相，基于其對不同組分吸附能力的差異進(jìn)行混合物的分離。流動相：常用混合溶劑，主體溶劑為正己烷或環(huán)己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作為調(diào)節(jié)劑，用于調(diào)整流動相的極性。30a.表面多孔型b.無定形全多孔c.球形全多孔d.堆積全多孔應(yīng)用：主要用于分離能溶于有機(jī)溶劑的極性與弱極性混合物及異構(gòu)體的分離。二、化學(xué)鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法。強(qiáng)極性組分后出峰，弱極性組分先出峰31（一）化學(xué)鍵合固定相用化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合固定相，簡稱鍵合相?；瘜W(xué)鍵合相已廣泛用于正相與反相色譜法、離子對色譜法等諸多色譜法中。1、鍵合反應(yīng)化學(xué)鍵合相的載體是硅膠，表面有≡Si—OH，能與合適的有機(jī)化合物反應(yīng)，使具有不同極性功能團(tuán)的有機(jī)分子鍵合在表面而獲得不同性能的化學(xué)鍵合相，它的制備方法主要是用有機(jī)氯硅烷與硅醇基發(fā)生反應(yīng)（硅烷化），生成Si-O-Si-C鍵合相。

32由于空間位阻效應(yīng)，不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反應(yīng)。殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質(zhì)產(chǎn)生次級化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性，使組分的峰形拖尾。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用小分子三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，稱封尾。33342.鍵合相的分類（1）非極性鍵合相這類鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基與苯基等。十八烷基鍵合相（ODS）是最常用的非極性鍵合相。351-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯固定相：C1固定相：C8固定相：C18非極性鍵合相常用于反相色譜。鍵合烷基的鏈長增加，極性降低，載樣量增大、k值增大，C18分離效果優(yōu)于C8,C136（2）中等極性鍵合相中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相（如YWG-ROR′）。這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。（3）極性鍵合相常用氨基、氰基鍵合相。分別將氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]及氰乙硅烷基[—Si(CH2)2CN]鍵合在硅膠上而制成。它們可用作正相色譜的固定相。（4）離子交換鍵合相離子交換基團(tuán)如-SO3－，-NR3＋鍵合在擔(dān)體表面。373.鍵合相的性質(zhì)（1）穩(wěn)定性鍵合相在pH2-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。（2）鍵合量鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，按含碳量的不同，可分為高碳、中碳及低碳型鍵合相。38高碳ODS鍵合相：若R1、R2是二個(gè)甲基，構(gòu)成高碳ODS鍵合相［Si-O-Si(CH3)2-C18H37］。中碳ODS鍵合相：若R1是氫，R2是氯，氯與硅膠的另一個(gè)硅醇基脫HCl，則生成中碳ODS鍵合相［（Si-O-)2Si(H)-C18H37］；低碳ODS鍵合相：若R1、R2都是氯，與硅膠的另二個(gè)硅醇基再脫二分子HCl，生成低碳ODS鍵合相［(Si-O-)3Si-C18H37］。39（3）表面覆蓋度覆蓋度的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。Partisil5-ODS的表面覆蓋度為98％，即殘存2％的硅醇基，分配占主導(dǎo)。Partisil10-ODS的表面覆蓋度為50％，既有分配又有殘余硅醇基的吸附作用。含碳量大，則載樣量大，保留能力強(qiáng)40（二）正相鍵合相色譜法最常用的有氰基（-CN）氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）極性鍵合相。流動相一般用非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如正己烷溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離能溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。4.鍵合相的特點(diǎn)①固定相不易流失，壽命長②選擇性好③穩(wěn)定性好④傳質(zhì)快，柱效高⑤適于作梯度洗脫。41分離選擇性：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。分離機(jī)制分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用42（二）反相鍵合相色譜法

典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）鍵合相；流動相常用甲醇-水或乙腈-水。反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，有分配與吸附之爭，還有疏溶劑理論等。鍵合基團(tuán)的覆蓋率高，分配為主；覆蓋率低，吸附為主。如果覆蓋率高，對殘余硅醇基封尾，則吸附作用大為降低。43疏溶劑理論把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從極性流動相中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動的親合作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。44保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；2、固定相硅膠表面鍵合烷基越大，覆蓋度越大，則溶質(zhì)的k越大。3、流動相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇、已腈為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大45稠環(huán)芳烴的分析固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱溫：30oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器46反相鍵合相色譜法是應(yīng)用最廣的色譜法，主要用于分離非極性至中等極性的各類分子型化合物.派生的離子抑制法、離子對法還可用于酸、堿、鹽的分析。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。（三）反相離子對色譜法

把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counterion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。47原理

樣品離子反離子

中性締合物（只溶于有機(jī)相）

有機(jī)堿

A固定相

+

?離子對試劑水相48影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時(shí)（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。

離子對試劑的選擇分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等49分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽等離子型和非離子型化合物的混合物。反相離子對色譜很易實(shí)現(xiàn)，用ODS柱，在流動相甲醇-水或乙腈-水中加入0.03～0.01mol/L的離子對試劑即可。反相離子對色譜法分析奶粉中三聚氰胺流動相：含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液(pH3.0):甲醇=7:350（四）離子抑制色譜法用反相色譜法，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。1．抑制劑通過向流動相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽）為抑制劑，調(diào)節(jié)pH值，抑制組分的解離，增加中性分子存在的幾率。如分離十二烷酸時(shí)，可在流動相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的離解512．容量因子及其影響因素除與反相色譜法有相同的影響因素外，主要受流動相的pH值的影響。對于弱酸，即流動相的pH值小于它的pka值時(shí)，主要以分子形式HB存在，k值增大，tR增大；反之，pH＞pka，組分以離子形式B為主，k值變小，tR減小，對于弱堿，情況相反。523．適用范圍適用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸；6.0≤pKb≤7.0的弱堿。對于pKa＜3.0的酸及pKb<6.0的堿，應(yīng)采用離子對色譜法或離子交換色譜法。在進(jìn)行離子抑制色譜法時(shí)，流動相的pH需在2～8之間流動相的pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至比組分的pK值大（對堿）或?。▽λ幔?~2個(gè)單位以上，使分子形式的的分布系數(shù)較大，有較大的k值。53（四）分離類型的選擇54第4節(jié)改善分離度的方法在高效液相色譜分析中，實(shí)際上固定相種類的選擇十分有限，當(dāng)色譜柱選定后，主要通過調(diào)節(jié)流動相的組成改善分離.雖然n也受流動相的影響，但主要由色譜柱的性能所決定，溶劑系統(tǒng)主要影響容量因子k和分配系數(shù)比α。選擇不同種類的溶劑或改變多元溶劑系統(tǒng)的配比，都會改變k和α值，影響分離度。55一、對流動相的要求①與固定相不互溶②純度高不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”③粘度低若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.

56④與檢測器匹配⑤對樣品有適宜的溶解度⑥毒性小1.加入調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)k二、改善分離度的方法使用UV檢測器時(shí)，溶劑截止波長要小于測量波長；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物有較大差異。57通常希望組分的容量因子k保持在2~10范圍內(nèi)，若組分的k值大于10或小于2時(shí)，可通過調(diào)節(jié)流動相的極性，來獲取適用的k值。在正相色譜中常采用飽和烷烴如正己烷作主體溶劑，加入具有不同選擇性的溶劑如乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，來調(diào)節(jié)溶劑的洗脫強(qiáng)度。極性增加，溶劑的洗脫能力增強(qiáng)，保留時(shí)間縮短。若組分的保留時(shí)間短，表明溶劑的極性太大,改用極性小的溶劑。若組分的保留時(shí)間太長，可改用極性較大的溶劑。58在反相色譜中則常采用水為主體溶劑，加入甲醇、乙腈、四氫呋喃等來調(diào)節(jié)溶劑的洗脫強(qiáng)度，溶劑溶劑極性參數(shù)P'k減少倍數(shù)*