DB34DB34/T2404—2015豬丹毒桿菌檢驗(yàn)規(guī)程Protocolofexaminationforswineerysipelas安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽省豬病監(jiān)測(cè)工1GB/T14926.43-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NY/T566豬丹毒診斷技術(shù)3.4冰箱：2℃~5℃。2檢樣顯微鏡檢查顯微鏡檢查直接涂片馬丁肉湯血液或血清瓊脂平板革蘭氏染色選取可疑菌純培養(yǎng)鏡檢豬丹毒桿菌直接涂片馬丁肉湯血液或血清瓊脂平板革蘭氏染色選取可疑菌純培養(yǎng)鏡檢豬丹毒桿菌病理變化染色鏡檢分離培養(yǎng)血清型鑒定6.1.1急性敗血型豬丹毒可采取腎、脾、肝、心血、淋巴結(jié)；亞急性疹30.4×0.8～2.5μm，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，常單獨(dú)或經(jīng)馬丁肉湯37℃培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)新霉素（400μg/mL）或萬(wàn)古霉素（70μg/mL抑制其他6.3.3在血清瓊脂上菌落特征細(xì)小、圓形、透明、凸起、灰白色、有6.3.4在血液瓊脂上菌落特征同6.3.3，并形成綠色的狹窄溶血環(huán)(α溶血）。6.3.5在馬丁肉湯中生長(zhǎng)特征輕度混濁，振動(dòng)試管呈現(xiàn)出云霧狀，有6.5.2將腎、脾、肝、淋巴結(jié)和疹塊部皮膚磨碎，用滅菌生理鹽水制成1:5～1:10小鼠出現(xiàn)精神萎頓、拱背、毛亂、停食，3～7天死亡；死亡的小若需鑒定血清型時(shí)可按照NY/T566的4型觸酶VP及甲基鴿α------+-β++++++-+8.1綜合以上形態(tài)、結(jié)構(gòu)與染色，培養(yǎng)特性，生化反應(yīng)8.4符合8.1、8.2，且根據(jù)6.5培養(yǎng)基的配制A.1.1成分A.230％甘油緩沖鹽水溶液A.2.1成分A.3.1成分A.4.1成分6將蛋白胨液與肉浸液混合，加熱至80℃,加冰乙酸1mL，搖勻，再煮沸5min。加15％氫氧化A.5硫酸亞鐵瓊脂A.5.1成分硫代硫酸鈉加熱溶解，校正pH，分裝試管，115A.6胰蛋白胨水A.6.1成分7PCR擴(kuò)增儀、1.5mL離心管、0.2mLPCR反應(yīng)管、水浴鍋、高速冷凍離心P1：5′-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3′P2：5′-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGAC檢測(cè)過(guò)程應(yīng)同時(shí)做陽(yáng)性和陰性空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照模板為豬丹毒桿菌（G4T10），陰性空白對(duì)照為PCR反應(yīng)體系：總體積為25μL，其中含有12.5μL的PCRMast8測(cè)結(jié)果電