ICS13.020DB36Determinationofthreetetracyclineantibioticsinsoilbyhighperformanceliquidchromatography-triplequadrupolemassspe江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB36/T1841—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14方法原理 15試劑和材料 16儀器和設(shè)備 27樣品 28分析步驟 29結(jié)果計(jì)算與表示 310精密度和正確度 511質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 512廢物處理 6附錄A（規(guī)范性）方法的檢出限和測定下限 7附錄B（資料性）五家實(shí)驗(yàn)室的精密度和正確度匯總 8附錄C（資料性）質(zhì)譜參考條件 10參考文獻(xiàn) DB36/T1841—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由江西省生態(tài)環(huán)境廳提出并歸口。本文件主要起草單位：江西省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，江西省新余生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心。本文件主要起草人：趙佳文、喬支衛(wèi)、彭剛?cè)A、張振欣、歐陽濤、高明、劉燕紅、曾芳發(fā)、敖磊、陳美芬、彭惠琛、肖滿成、李曉燕、歐麗。1DB36/T1841—2023土壤3種四環(huán)素類抗生素的測定高校液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法本文件規(guī)定了測定土壤中3種四環(huán)素類抗生素的測定高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法原理、試劑材料、儀器設(shè)備、樣品采集和制備、分析測試和質(zhì)量控制等技術(shù)內(nèi)容。本文件適用土壤中金霉素、土霉素和四環(huán)素的測定，方法檢出限和測定下限詳見附錄A。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ613土壤干物質(zhì)和水分的測定重量法HJ/T166土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4方法原理使用乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液，經(jīng)水平振蕩提取土壤樣品中四環(huán)素類抗生素，提取液經(jīng)冷凍離心后通過固相萃取柱凈化，經(jīng)濃縮后待測，使用高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，電離方式為ESI(+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1實(shí)驗(yàn)用水：電阻率≥18MΩ·cm，其余指標(biāo)應(yīng)符合GB/T6682中表1的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。5.2鹽酸：優(yōu)級(jí)純。5.3鹽酸溶液：ρ（HCl）=0.5mol/L。準(zhǔn)確量取4.17ml鹽酸（5.1）用實(shí)驗(yàn)室去離子水定容至100ml。5.4乙腈：優(yōu)級(jí)純。5.5甲醇：優(yōu)級(jí)純。5.6甲酸：優(yōu)級(jí)純。5.70.1%甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取1.0mL甲酸加入1000mL水中，混勻。5.80.1%甲酸乙腈溶液：移取1.0mL甲酸加入1000mL乙腈中，混勻。5.9金霉素、土霉素、四環(huán)素：有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量（99%以上）。5.10金霉素、土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100mg/L稱取0.0100g金霉素、土霉素、四環(huán)素（5.9用甲醇（5.5）溶解并定容至100mL；于4℃冷藏、避光保存，或市售有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。2DB36/T1841—20235.11金霉素、土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液（100μg/L）：移取100.0μL金霉素、土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.10），用甲醇（5.5）定容至100mL。5.12樣品提取液（Mclvaine緩沖溶液：乙腈=7:3）：稱取磷酸氫二鈉27.6g，檸檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二鈉鹽37.2g，調(diào)節(jié)pH約等于2，用水溶解后稀釋并定容至1000mL；移取Mclvaine緩沖溶液350mL，用乙腈稀釋定容至500mL。5.13固相萃取柱：規(guī)格為6mL/500mgHLB柱。5.14氮?dú)猓杭兌取?9.999%。5.15石英砂。6儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子化源（ESI）或其他等效離子源。6.2分析天平：精度為0.0001g。6.3濃縮裝置：氮吹濃縮儀或其他類型的等性能相當(dāng)?shù)脑O(shè)備。6.4固相萃取裝置：自動(dòng)或手動(dòng)，流速可調(diào)節(jié)。6.5色譜柱：C18高效液相色譜柱（規(guī)格2.1mm×100mm，1.7μm）或其他性能相近的色譜柱。6.6HY-2A調(diào)速多用振蕩器。6.7高速冷凍離心機(jī)。6.8移液槍：5μL、10μL、20μL、50μL、100μL。6.9冷凍干燥儀。6.10渦旋振蕩器。7樣品7.1樣品的采集和保存樣品采集參照HJ/T166的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，采集具有代表性的土壤樣品，立即置于棕色磨口玻璃瓶中，用錫箔紙封口于4℃條件下冷藏。7d內(nèi)完成提取，提取液在30d內(nèi)完成分析工作。7.2樣品的制備7.2.1土壤的凍干：將采集的樣品挑除石塊樹枝，挖出裝入培養(yǎng)皿中并用保鮮膜密封置于凍干機(jī)上凍干48h以上，凍干量一般為分析用量的3倍以上為宜。7.2.2干物質(zhì)含量的測定：按照HJ613測定土壤樣品干物質(zhì)含量。7.2.3土壤中抗生素提?。悍Q取2.0g冷凍干燥土壤樣品于50mL離心管中，加入樣品提取液（5.12）10mL，置于調(diào)速多用振蕩器（6.6）中振蕩45min，在4500r/min條件下冷凍離心10min后收集上清液，重復(fù)提取2次，然后加去離子水稀釋至200mL，待凈化。7.2.4凈化：依次用3mL甲醇（5.5）、3mL0.5mol/LHCl（5.3）溶液、3mL水活化HLB固相萃取小柱（5.13），以5mL/min速度將提取液或待凈化液通過固相萃取柱，然后依次用5mL5%甲醇溶液、5mL水淋洗固相萃取柱。真空泵抽干萃取柱，保持30min，最后用5mL甲醇洗脫，洗脫液在氮吹儀濃縮至小于1mL后，用1mL甲醇定容，渦旋溶解5min，過0.22μm濾膜后測定。8分析步驟3DB36/T1841—20238.1儀器參考條件8.1.1高效液相色譜儀參考條件見表1和表2。表1高效液相色譜儀分析條件表2梯度洗脫程序0156588.1.2離子源條件見表3。表3離子源條件），8.1.3多離子反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）具體條件參見附錄C，對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立準(zhǔn)確移取一定體積的金霉素、土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.11），用甲醇（5.5）稀釋，分別配置7種不同濃度的溶液，1.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列，待測。由低濃度到高濃度依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)組分的響應(yīng)值為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。8.3樣品的測定取按（7.2）制備好的待測試樣，按照與繪制校準(zhǔn)曲線相同的儀器分析條件進(jìn)行測定。當(dāng)待測試樣濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍時(shí)，樣品使用甲醇稀釋后再測定。8.4空白試驗(yàn)使用石英砂，按照(7.2)進(jìn)行樣品制備，與試樣相同的測定條件（8.1）進(jìn)行空白試樣的測定。9結(jié)果計(jì)算與表示4DB36/T1841—20239.1定性分析按照附表C.1確定的母離子與子離子進(jìn)行監(jiān)測，試樣中目標(biāo)組分的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品中該組分的保留時(shí)間的相對(duì)偏差的絕對(duì)值應(yīng)小于2.5%；且對(duì)待測樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度（Ksam，見式1）與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性子離子相對(duì)豐度（Kstd，見式2）進(jìn)行比較，所得偏差標(biāo)準(zhǔn)在表4規(guī)定的最大允許偏差范圍內(nèi)，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測物。四環(huán)素的總離子色譜圖見圖1?！街校簁sam----樣品中某組分定性子離子的相對(duì)豐度，%；A2----樣品中某組分二級(jí)質(zhì)譜定性子離子的峰面積；A1----樣品中某組分二級(jí)質(zhì)譜定量子離子的峰面積?！街校簁sna----標(biāo)準(zhǔn)樣品中某組分定性子離子的相對(duì)豐度，%；Astaz----標(biāo)準(zhǔn)樣品中某組分二級(jí)質(zhì)譜定性子離子的峰面積；Asrar----標(biāo)準(zhǔn)樣品中某組分二級(jí)質(zhì)譜定量子離子的峰面積。表4定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差Kstd%Kstd>5020<Kstd≤50Kstd≤10圖1金霉素、土霉素、四環(huán)素總離子流色譜圖9.2定量分析9.2.1土壤樣品的計(jì)算結(jié)果土壤樣品中的目標(biāo)物含量，按照公式（3）計(jì)算：5DB36/T1841—2023……式中：w——樣品中目標(biāo)化合物含量，μg/kg；p——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得試樣中目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，μg/L；V試樣定容體積，ml；f——稀釋倍數(shù)；m——樣品稱樣量，g；wam——樣品干物質(zhì)含量，%。9.3結(jié)果表示當(dāng)測定結(jié)果大于等于1μg/kg時(shí)，數(shù)據(jù)保留三位有效數(shù)字；當(dāng)結(jié)果小于1μg/kg時(shí)，保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。10精密度和正確度10.1精密度用5.00μg/kg；50.0μg/kg；200μg/kg低、中、高三個(gè)含量金霉素、土霉素、四環(huán)素對(duì)三個(gè)空白樣品四環(huán)素：6.6%，3.2%，3.3%。精密度數(shù)據(jù)匯總表見附錄B中表B.1。10.2正確度五家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)空白樣品加標(biāo)，加標(biāo)濃度為5.00μg/kg、50.0μg/kg、200μg/kg進(jìn)行分析測定。加標(biāo)回收率范圍分別為：金霉素：86.6%～118%，82.0%～112%，80.5%～103%；土霉素:92.8%~100%，87.9%～113%，93.8%～102%；四環(huán)素95.4%～116%，86.9%～111%，79.6%~118%。正確度數(shù)據(jù)匯總表見附錄B中表B.2。11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制11.1空白分析每次分析至少做一個(gè)空白試驗(yàn)，空白試驗(yàn)中檢出目標(biāo)化合物的濃度不得超過方法的檢出限。11.2校準(zhǔn)11.2.1每批樣品應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r≥0.995，否則重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。11.2.2每20個(gè)樣品或每批次樣品（少于20個(gè)樣品）應(yīng)測定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，其測定結(jié)果與該點(diǎn)濃度的相對(duì)偏差應(yīng)≤25%，否則，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。11.3平行樣的測定每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品）需做1個(gè)平行雙樣，平行雙樣測定結(jié)果的相對(duì)偏差應(yīng)≤20%。11.4樣品加標(biāo)回收率測定6DB36/T1841—2023每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品）需做1個(gè)基體加標(biāo)樣，加標(biāo)樣與原樣品在完全相同的測試條件下進(jìn)行分析。加標(biāo)回收率應(yīng)在70%～120%之間。12廢物處理實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢液和廢物應(yīng)分類收集和保管，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。7DB36/T1841—2023（規(guī)范性）方法的檢出限和測定下限表A.1方法檢出限和測定下限（單位：μg/kg）1238DB36/T1841—2023（資料性）五家實(shí)驗(yàn)室的精密度和正確度匯總表B.1方法精密度匯總表2.8～9.62.2～5.12.3～8.24.4～262.4～122.6～5.44.0～272.0～102.1～5.89DB36/T1841—2023表B.2方法正確度匯總表993938939575DB36/T1841—2023質(zhì)譜參考條件表B.3目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件DB36/T1841—2023參考文獻(xiàn)[1]左艷麗．毛細(xì)管電泳法應(yīng)用于頭孢菌素類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素藥物的檢測［D］．石家莊:河北大學(xué),2012.[2]SPElTINIA,STURINIM,MARASCHIF,etal．Microwave-assistedex-tractionanddeterminationofenrofloxacinanddanofloxacinphoto-trans-formationproductsinsoil[J]．Analyticalandbioanalyticalchemistry,2012,404(5)．1565－1569.[3]劉瀟雅,徐源洲,賀南南,等．土壤磺胺類抗生素固相萃?。咝б合嗌V法的構(gòu)建與優(yōu)化[J]．土壤,2019,51(6):1129－1136.[4]SAlVIAMV,FIEUM,VUllIETE．Determinationoftetracyclineandflu-oroquinoloneantibioticsattracelevelsinsludgeandsoil[J]．Appliedandenvironmentalsoilscience,2015,2015(11):1－10.[5]UKASZEWICZP,BIAK-BIElINSKAA,DOZ·ONEKJ，etal．Anewapproachfortheextractionoftetracyclinesfromsoilmatrices:Applicationofthemicrowave-extractiontechnique[J]．Analytical＆bioanalyticalchemistry,2018,410:1697－1707.[6]孟明輝,賀澤英,徐亞平,等．QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定土壤中20種抗生素[J]．農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(8):1672－1679.[7]PANlX,FENGXX,CAOM,etal．DeterminationanddistributionofpesticidesandantibioticsinagriculturalsoilsfromnorthernChina[J]．RSCAdv,2019,9(5):15686－15693.[8]陳磊,吳赟琦,趙志勇,等．QuEChERS/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定土壤中19種氟喹諾酮類抗生素殘留[J]．分析測試學(xué)報(bào),2019,38(2):194－200.[9]郎朗,狄靜波,王戈,等．哈爾濱市蔬菜基地四環(huán)素