DB51TechnicalspecificationforisolationandidentificationofswinegaetavirusI 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定張睿、謝嘉賓、王英、文豪、徐凱、黃先奇、陳亮1豬蓋塔病毒分離與鑒定技術規(guī)范本文件適用于豬及其產(chǎn)品中蓋塔病毒病原分離和鑒4縮略語BHK-21：乳倉鼠腎源細胞DNAmarker：DNA相對分子質量5.1.3BHK-21、DMEM培養(yǎng)基、FBS、HEPES緩沖液(1mol/L儲存液)、0見附錄A)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR反應混合液（2×)。25.2主要儀器設備微量可調(diào)移液器、二氧化碳恒溫箱、組織破碎儀、高速離心機、PCR儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電液樣品1mL~2mL，組織裝入無菌自封樣品袋或離心管，血液裝入抗凝GETV分離鑒定時，應在高等級生物安全實驗室操作，按照GB19489（所有部分）的規(guī)定執(zhí)行。取0.5g~1g待檢組織樣品，加入1m作3:1（V/W）稀釋。反復凍融3次后，4℃3000r/min離心10min，取上清液，以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，轉入1.5mL離心管中，-70℃按常規(guī)法將BHK-21細胞分裝在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝含8%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細胞濃度應為2×105個/mL~3×105個/mL，培養(yǎng)43積）。每份樣品接種2瓶~4瓶細胞，另設細胞對照2瓶~4瓶。37°C吸附1h，棄上清，加入2ml含2%FBS每天觀察記錄CPE，通常在接種12h~48h內(nèi)可出現(xiàn)CPE，胞形態(tài)基本正常或稍有衰老。若出現(xiàn)CPE，將接毒細胞反復凍融三病毒上清液，置-70℃保存，進行病毒核酸鑒定。若接種細胞第1代72h后未出現(xiàn)CPE，按上述收取，并使用反轉錄試劑盒將提取核酸反轉錄成cDNA，于-20）：下游引物（10μmol/L）：5’-GCACTCRAGGTCAT反應體系見表1，反應體系可根據(jù)表中各組分比513114取適量擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀中觀察結果。9結果判定9.1RT-PCR9.2病毒分離鑒定9.2.1對核酸陽性擴增產(chǎn)物進行測序，其結果與附錄B.1序列比酸檢測，若核酸鑒定結果仍為陽性，且測序比對結果正確，則判定為GE5NaClNa2HPO4?12H2O0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳A.31.0%瓊脂糖凝膠板制備厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電6ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGA