章特殊染色

2021/6/271

一、特殊染色的概念及意義

特殊染色為常規(guī)染色（即蘇木素、伊紅）的必要補充，又稱選擇性染色，只有相對的特異性，如PAS陰性反應(yīng)它有糖元。

2021/6/272意義：

（1）特染能顯示在常規(guī)染色切片中不明顯的部分，如革蘭氏染色、細(xì)菌染色。

（2）區(qū)別HE染色中不能鑒別的組織病變，如VG染色區(qū)別膠元纖維和平滑肌。

（3）顯示某些常規(guī)染色中不能著色的物質(zhì)，如網(wǎng)染才能顯示網(wǎng)狀纖維，常規(guī)HE染色是染不出來的。

因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的組成部分，它在病理診斷常著輔助作用，也為科研提供依據(jù)。

2021/6/273二、學(xué)習(xí)特染技術(shù)應(yīng)掌握的重點

（注意事項）

（1）染色方法的成敗，應(yīng)該在溫度、濃度、時間和PH值等方面找原因。

（2）注意特染的應(yīng)用范圍，如某種病變應(yīng)用什么方法染色才能達(dá)到目的，一般先在HE切片所見的要求去選擇適當(dāng)?shù)奶厝痉椒?，一種或多種。

2021/6/274（3）必須掌握各種特殊染色的結(jié)果，避免導(dǎo)致錯誤的結(jié)論或嚴(yán)重的誤診，如在網(wǎng)染時把膠元纖維誤以為網(wǎng)狀纖維。

（4）盡量要陽性切片作對照，便于選擇特染方法，并與HE切片作對照。

（5）特染的組織，在其固定、脫水根據(jù)要求選擇。所用的器皿都必須化學(xué)清洗。

2021/6/275三、玻璃器皿的清潔

在病理實驗室可用的玻璃器皿，都必須經(jīng)過清洗干凈才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新舊而不同。2021/6/2761、新購玻璃器皿的處理

對于新購買的玻璃器皿應(yīng)先用洗衣粉浸泡洗刷，自來水沖洗后再用1—2%鹽酸水溶液浸泡數(shù)小時后，用自來水沖洗干凈，必要時可用少量蒸餾水洗2次2021/6/2772、使用后玻璃器皿的處理

每次使用后的玻璃器皿都必須及時徹底清洗干凈，以供下次實驗之用，如輕視這一步驟，可用的玻璃器皿不夠干凈，則會影響染色效果，甚至導(dǎo)致染色失敗，特別在酶組化和銀離子反應(yīng)操作過程中更有嚴(yán)格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，還要求用硫酸清洗液浸泡。2021/6/278

硫酸清洗液配制

重鉻酸鉀80g

自來水1000ml

濃硫酸（工業(yè)用）120m

新配制的清潔液為紅褐色，反復(fù)使用一段時間后，慢慢變成綠色，說明清潔液已失敗，不能繼續(xù)使用應(yīng)重新配制。2021/6/279

3、玻璃器皿的清洗方法

①任何玻璃器皿都必須用自來水沖洗，然后把殘余藥液或染液洗去。

②用毛刷沾洗衣粉擦干凈。

③自來水沖洗，蒸餾水洗2次。

④把晾干的器皿輕輕置入清潔液浸泡數(shù)日。

⑤取出器皿，用自來水把器皿內(nèi)外徹底沖洗干凈，最后用蒸餾水洗2次。

⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或溫箱中烤干，最后存放櫥內(nèi)備用。2021/6/2710

常用的特染

第一節(jié)結(jié)締組織染色2021/6/2711一、膠元纖維染色（VG染色）

㈠膠元纖維的分部組成成分

膠原纖維是結(jié)締組織中的三種纖維之一，分布最為廣泛，含量最多。主要分布于真皮、腱、韌帶、骨、透明軟骨、動脈、腸壁、子宮和基底膜等。膠原纖維具有韌性大，抗拉力強的特點。膠原纖維單位主要由纖維母細(xì)胞合成。2021/6/2712

苦味酸—酸性品紅法

1．VG染液試劑配制

1%酸性品紅10ml

苦味酸飽和液90ml

此液常分別配制臨用時加以混合，不能久用。2021/6/2713

【染色步驟】

（1）組織固定于10%早醛液中，常規(guī)脫水包埋

（2）組織切片脫臘至水。

（3）V-G染液2-5’（酸性品紅1：苦味酸飽和液9）

（4）傾去染液，無水酒精急速脫水，用濾紙吸干

（5）二甲苯透明，中性樹膠封片。

2021/6/2714【結(jié)果】

膠元纖維呈紅色，肌纖維、胞質(zhì)及紅細(xì)胞黃色。2021/6/27152021/6/2716

㈡膠元纖維染色應(yīng)用

膠原纖維染色在病理診斷上主要用于鑒定梭形、纖維形細(xì)胞腫瘤的組織來源；

常常要在纖維、平滑肌和神經(jīng)三者之中作出選擇。

觀察動脈硬化的心臟，在HＥ切片中，心肌內(nèi)散在的小疤痕灶和心肌均被染作紅色，而作膠原纖維染色可將膠原組織和肌肉上明顯地區(qū)分開來。

早期肝硬化用膠原纖維染色，也可使小葉之間少量增生的膠原纖維突出地顯示出來。2021/6/2717二、

網(wǎng)狀纖維染色

㈠網(wǎng)狀纖維染色的形態(tài)特點和染色原理

網(wǎng)狀纖維是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維。它由網(wǎng)狀細(xì)胞產(chǎn)生，網(wǎng)狀纖維細(xì)而有分支，穿行于細(xì)胞體和突之間，共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架。這種纖維用HE染色一般不易辨認(rèn)。若用銀氨溶液浸染能使纖維變成黑色，故又稱嗜銀纖維。2021/6/2718（二）網(wǎng)狀纖維染色的原理

網(wǎng)狀纖維的染色方法很多，但是染色原理基本相同，有以下方面。

（1）氧化使網(wǎng)狀纖維具有選擇性，不經(jīng)氧化的切片，常用的氧化劑是高錳酸鉀。

（2）漂白一般采用2%草酸，漂白后無色2021/6/2719（3）媒染多用2%硫酸鐵氨（俗稱鐵明礬）。這些試劑可增加網(wǎng)狀纖維對銀氨液的選擇性。

（4）浸銀也稱鍍銀，使銀氨配位化合物與網(wǎng)狀纖維結(jié)合，帶正電荷的二氨合銀Ag（NH3）+2被具有嗜銀性物質(zhì)的網(wǎng)狀纖維吸附。

（5）還原甲醛液是還原劑，能把與網(wǎng)狀纖維結(jié)合的銀氨配位化合物還原成棕黑色的金屬銀。

2021/6/2720

（三）網(wǎng)狀纖維纖維染色應(yīng)用

判定病變組織支架的破壞情況，組織、臟器網(wǎng)狀支架的存在與塌陷、完整與破壞、網(wǎng)狀纖維的分布及走行，有多少、粗細(xì)、疏密或有無斷裂形態(tài)變化。

2021/6/2721⑴用于顯示和鑒別腫瘤的性質(zhì)和來源

顯示和區(qū)分癌與肉瘤來源于上皮組織的惡性腫瘤（癌）僅癌巢周圍有網(wǎng)狀纖維包繞，巢內(nèi)癌細(xì)胞之間則沒有網(wǎng)狀纖維分部。來源于間葉組織的惡性腫瘤（肉瘤），瘤細(xì)胞之間往往可見較多的網(wǎng)狀纖存在。

2021/6/2722⑵用于某些腫瘤的診斷

根據(jù)染色所顯示的網(wǎng)狀纖維多少、分布及行走特點，可用于診斷下列腫瘤。2021/6/27231）平滑肌肉細(xì)胞之間見有大量平行分布的網(wǎng)狀纖維。

2）纖維肉瘤可見大量網(wǎng)狀纖維存在，并且密集包繞細(xì)胞。

3）滑膜肉瘤其梭形細(xì)胞也產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，但不如纖維肉瘤多。2021/6/2724⑶用于觀察和研究癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其惡性程度

癌組織發(fā)生，發(fā)展過程以及癌組織生長速度，可通過網(wǎng)染進(jìn)行觀察和研究，如癌巢周圍的網(wǎng)狀纖維包囊完整，說明癌組織生長較慢，惡性程度低；再如子宮頸鱗狀細(xì)胞癌巢周圍網(wǎng)狀纖維分解，說明癌組織正在擴散，其惡性程度較高。2021/6/2725(5)用于顯示和研究肝組織病變

用網(wǎng)狀纖維的染色法，觀察肝臟病變處的網(wǎng)狀支架形態(tài)、分布特點及其破壞情況，可以判定和研究其病變性質(zhì)、程度及其發(fā)展與轉(zhuǎn)規(guī)。

2021/6/2726（四）網(wǎng)狀纖維染色的注意事項

（1）用新蒸餾水配制最好用雙蒸水配制。

（2）所用玻璃器材及載玻片均要達(dá)到化學(xué)潔凈程度.

（3）對已配制好的硝酸銀液和氨銀溶液，要貯存冰箱中保存待用。

2021/6/2727（4）在染色過程中，用染氨銀染液或硝酸銀液的前后應(yīng)用蒸餾水洗浸。

（5）氯化金調(diào)色和硫代硫酸鈉固定的時間不應(yīng)太長，否則會引起網(wǎng)狀纖維染色變淡。

（6）切片脫水后及時封片，不宜在空氣中停留時間過長，以免產(chǎn)生色素顆粒。2021/6/2728

【氨銀液的配制】

1.取10%硝酸銀水溶液5ml于三角燒瓶內(nèi)，一滴一滴地滴加氨水（氫氧化銨），并同時搖動容器

2.硝酸銀遇到氨水立即產(chǎn)生沉淀，當(dāng)其沉淀物被溶解時（不能完全溶解也可）

3.再加入3%氫氧化鈉水溶液5ml。溶液重新產(chǎn)生沉淀

4.此時再滴加氨水。至其沉淀被溶解后，（為避免氨水加入過量最好能有少許沉淀物為妥，以免脫片）最后加蒸餾水稀釋至50ml。

5.濾過，貯存于棕色瓶中存放入冰箱備用。臨用前取出恢復(fù)室溫再用。2021/6/2729【染色步驟】

（1）切片脫蠟至水洗。

（2）0.25%高錳酸鉀液氧化5’。

（3）自來水洗2次。

（4）2.5%草酸液漂白1-2’，水洗2’。

（5）2%硫酸鐵銨媒染（鐵明礬）10’。

（6）水洗，蒸餾水洗2次。

（7）滴染氨銀液1’左右。2021/6/2730（8）蒸餾水洗2次。

（9）10%中性早醛還原3′。

（10）蒸餾水洗1—2次。

（11）0.2%的氯化金調(diào)色5′

水洗。

（12）5%硫代硫酸鈉固定5′。

（13）自來水沖洗，蒸餾水洗。

（14）復(fù)染（對比染色）伊紅、中性紅、ＶＧ。

（15）脫水、透明、封片。

2021/6/2731【結(jié)果】

膠元纖維呈黃色，網(wǎng)狀纖維成黑色。2021/6/2732

【染色結(jié)果】

網(wǎng)狀纖維染灰黑色，膠元纖維紅色，基質(zhì)黃色。

2021/6/2733三、彈力纖維染色法

彈力纖維較細(xì)，直徑0.2-1微米，且堅固，彈性大，容易伸展，纖維分枝連接成網(wǎng)，HE染色與膠原纖維著色相似，若用彈力纖維染色法，則可分辨的很清楚。2021/6/2734Weigert氏彈力纖維染色法：標(biāo)本用Zenker氏液，酒精或10%甲醛固定均可。石蠟或冰凍切片。脫蠟至水。水洗后，加入Weigert氏染色液2-6小時或更長的時間，一般依染色液的新舊而定。2021/6/2735取出后，直接浸入1%鹽酸酒精或酒精中進(jìn)行分化。如需復(fù)染細(xì)胞核，可染于明礬蘇木素溶液中10分鐘。沖洗后，可再以VG氏染液作對比染色1-2分鐘。95%酒精分化、脫水、透明、封固。2021/6/2736試劑配制：鹽基性復(fù)紅（堿性品紅）2g間苯二酚（雷鎖辛）4g蒸餾水200ml30%三氯化鐵水溶液25ml95%酒精200ml濃鹽酸4ml2021/6/2737先將鹽基性復(fù)紅（堿性品紅）溶于200ml的蒸餾水中，加入4-5g間苯二酚，加溫煮沸（不停攪拌），然后加入25ml的30%三氯化鐵水溶液，繼續(xù)攪拌煮沸2-5分鐘，冷卻后過濾傾去濾液，將濾紙及沉淀物置于溫箱中烘干。而后將濾紙和干燥的沉淀物一并投入燒杯，加200ml95%酒精，小心隔水加熱，徐徐攪拌使沉淀溶解，然后棄去濾紙冷卻后，補足因加熱蒸發(fā)的酒精。最后加入4ml的鹽酸即可應(yīng)用。（對苯二酚可代替間苯二酚）。2021/6/2738【注意事項】

Weigert氏彈力纖維染色的配制已有許多改變，鹽基性復(fù)紅（堿性品紅）可由其它鹽基性染料取代，配制時如將結(jié)晶紫1克加鹽基性復(fù)紅1克，則彈力纖維染成蘭綠色；全用甲紫或結(jié)晶紫，彈力纖維則呈暗綠色。2021/6/2739【染色結(jié)果】

彈力纖維藍(lán)黑色，膠原纖維染成紅色，肌纖維染成黃色。2021/6/2740小動脈光鏡圖(彈性染色)2021/6/2741Verhoeff氏彈力纖維染色法：操作方法：切片常規(guī)脫蠟。Verhoeff染液15-60分鐘。以2%三氯化鐵分化（鏡下控制）。水洗再以95%酒精洗去碘。流水洗。以HE或VG氏染液復(fù)染。脫水、透明、封固。2021/6/2742【染色結(jié)果】

彈力纖維藍(lán)黑色，其它組織視復(fù)染而定。注意事項：這種染色法染液配制簡單，但對微細(xì)彈力纖維不如Weigert氏效果好。2021/6/2743試劑配制：將1克蘇木素加熱溶于20ml的無水酒精，冷卻后，加1%三氯化鐵水溶液8ml攪拌；再加入8ml的Lugoi碘液（碘1克，碘化鉀2克，蒸餾水100ml）攪拌混合而成。染液僅可存放2-3周。2021/6/2744應(yīng)用：1.顯示皮膚組織中彈力纖維的變化2.顯示鑒別心血管疾病3.顯示呼吸系統(tǒng)和腎臟疾病時彈力纖維的變化4.對彈力纖維瘤的診斷有決定作用2021/6/2745四、Masson三色染色法

Masson三色染色法是由Mallory氏苯胺藍(lán)菊黃G發(fā)展改良而來，但對于固定液有一定的選擇性，雖然任何固定液固定后的組織可進(jìn)行染色，但最好是用Zenker氏固定液或Bouin氏固定液固定組織。福爾馬林固定的標(biāo)本切片在染色前以3%升汞作第二次固定一小時以上，則可增強著色效果。2021/6/2746操作方法：(1)切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；(2)Weigent氏蘇木素液染核5分鐘；(3)自來水洗；(4)1%鹽酸分化(5)自來水洗；(6)麗春紅--酸性品紅溶液染5-8分鐘；2021/6/2747(7)1%醋酸水溶液洗；(8)1%磷鉬酸分化（1-3分鐘）直到各種成分被染清晰（膠原纖維呈淡紅色，肌纖維、纖維素呈鮮紅色）(9)2%亮綠液染2-5分鐘（或用2%苯胺藍(lán)水溶液替代）(10)水洗（快速）(11)常規(guī)脫水、透明、封片。2021/6/2748【染色結(jié)果】

膠原纖維綠色(亮綠)（或苯胺藍(lán),藍(lán)色）肌肉、纖維素紅色，紅細(xì)胞橘黃色，核藍(lán)黑色。2021/6/27492021/6/27502021/6/2751試劑配制：1．麗春紅-品紅溶液麗春紅0.7g酸性品紅0.3—0.5g冰醋酸1ml蒸餾水99ml2．1%冰醋酸水溶液冰醋酸1ml蒸餾水99ml3．亮綠亮綠2.0g冰醋酸2ml蒸餾水98ml2021/6/2752第二節(jié)脂類染色法2021/6/2753脂肪和類脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）統(tǒng)稱為脂類。它是構(gòu)成人體組織的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶劑中。在化學(xué)組成上，脂類屬于脂肪酸的酯或與這些酯有關(guān)的物質(zhì)。脂類的主要功能是氧化供能。脂肪主要存積于脂肪組織中，并以油滴狀的微粒存在脂肪細(xì)胞漿內(nèi)。在病理檢驗中，脂類染色法最常用以證明脂肪變性，脂肪栓子以及腫瘤的鑒別。脂類染色使用最廣泛的染料是蘇丹染料，最常用的有蘇丹Ⅲ，蘇丹Ⅳ，蘇丹黑及油紅O等。脂肪被染色，實際上是蘇丹染料被脂肪溶解吸附而呈現(xiàn)染料的顏色。經(jīng)研究認(rèn)為組織中脂質(zhì)在液態(tài)或半液態(tài)時，對蘇丹染料著色效果最好。根據(jù)這一原理，適當(dāng)提高溫度（37℃-60℃）對組織切片染色效果是有好處的。2021/6/2754一、油紅染色法：2021/6/2755試劑配制：油紅O0.5g異丙醇（含量98%）100ml此為油紅飽和液，可長期保存?zhèn)溆谩?021/6/2756染色步驟：冰凍切片蒸餾水充分洗滌。油紅稀釋液染10-15分鐘，避光、密封。油紅稀釋液的配制：取油紅飽和液6毫升，加蒸餾水4毫升，靜置5-10分鐘后過濾后使用。60%乙醇鏡下分化至間質(zhì)清晰。水洗。Marry氏蘇木素復(fù)染核。水洗。甘油或甘油明膠封片。2021/6/2757【結(jié)果】

脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無色2021/6/2758注意事項：油紅染色時應(yīng)避免試劑揮發(fā)過多，否則易形成背景沉淀。60%乙醇分化，應(yīng)于鏡下控制至脂肪組織呈鮮紅色，間質(zhì)無色時為度。2021/6/2759二、蘇丹Ⅲ(SudanⅢ)染色法2021/6/2760操作方法：固定于10%甲醛的組織。水洗后采用冰凍或石蠟切片。經(jīng)蒸餾水后，浸染于Harris蘇木素或明礬蘇木素中淡染1-2分鐘。自來水沖洗。水洗后，移入70%酒精5秒鐘。投入蘇丹Ⅲ染液中約30分鐘或更長時間，置于56℃溫箱中。在70%酒精中洗滌5-10秒鐘。洗于蒸餾水中，將切片周圍的水分小心擦掉。甘油明膠封固。2021/6/2761試劑配制：1.蘇丹Ⅲ染液配法：將0.15克蘇丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或純丙酮和70%酒精混合液中（各50ml），臨用時過濾，所得濾液即為飽和濃度。注：浸染時，容器必須蓋好，否則酒精或丙酮揮發(fā)，染料沉淀。2.甘油明膠配制：明膠40g

蒸餾水210ml

甘油250ml

石碳酸結(jié)晶5ml先將明膠浸入蒸餾水中2小時或更長時間，然后加甘油和石碳酸，加熱15分鐘，搖攪直至混合液均勻為止。2021/6/2762【結(jié)果】

脂肪呈橙紅色，膽脂素呈淡紅色，脂肪酸不著色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。2021/6/27632021/6/27642021/6/2765蘇丹Ⅲ2021/6/2766蘇丹Ⅳ(SudanⅣ)染色法：蘇丹Ⅳ又名猩紅，是蘇丹Ⅲ的衍生物，作為脂肪染劑，經(jīng)各地實驗證明，其結(jié)果優(yōu)于蘇丹Ⅲ。其染色步驟與蘇丹Ⅲ染法完全相同，從略。2021/6/2767應(yīng)用：（1）心、腦、腎等組織器官的脂肪栓塞，脂肪染色即可判定栓子是否為脂肪滴。（2）心臟、肝臟等脂肪變性：脂肪染色可顯示變性細(xì)胞內(nèi)的脂滴。（3）脂肪肉瘤與其它間葉組織的惡性腫瘤的鑒別：脂肪染色即可顯示脂肪肉瘤瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂滴。2021/6/2768脂肪栓塞（Fatembolism）2021/6/2769

第三節(jié)糖原和粘液染色2021/6/2770

㈠糖原的概念

糖原（glycogen）系由糖衍化而來，是單純的多糖，正常情況下，糖原存在胞漿內(nèi)，在肝臟、心肌、骨骼、肌肉含量最多。通常根據(jù)機體能量代謝將組成內(nèi)的糖原分為不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性兩類：

不穩(wěn)定性糖原正常情況下儲積于肝臟和肌肉，這種糖原當(dāng)身體需要能量時很容易轉(zhuǎn)化為葡萄糖。

穩(wěn)定性糖原僅以微量存積于身體的各種組織和細(xì)胞中，如神經(jīng)、上皮、軟骨細(xì)胞，以及白細(xì)胞等。2021/6/2771

糖原易溶于水，在酶的作用下很容易分解葡萄糖更易溶于水，機體死后1小時葡萄糖可轉(zhuǎn)化為蔗糖，因此組織必須起新鮮時固定或冰凍起來，固定之前決不能用水或生理鹽水浸洗。作為糖原染色的切片，必需經(jīng)特殊固定液固定后而進(jìn)行石蠟切片，才能把糖元保存下來。2021/6/2772㈡組織固定

1）為了不使糖原損失，一般用含酒精的溶液，如AAF液

2）采用低溫固定，肝組織放入冰箱，使酶分解糖原慢。進(jìn)行冰凍切片，可以顯示糖原在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的糖元分布2021/6/2773㈢組織固定中的注意事項

1．盡可能選取小塊新鮮組織及時固定。

2．多次更換乙醇固定液，在4℃左右溫度內(nèi)固定與保存。

3．乙醇能沉淀和糖原，但仍可溶于水。所以最好以乙醇為溶劑的混合固定液固定為佳。2021/6/2774（四）糖原染色方法

PAS法——對碘酸雪夫化反應(yīng)。

它的應(yīng)用較廣泛，除用于糖元的鑒定和粘液的顯示外，還可以觀察腎小球基底膜，阿米巴滋養(yǎng)體的著色。

2021/6/2775

【雪夫氏試劑的配制】

①

堿性品紅1g

②

1N鹽酸20ml

③

偏重亞硫酸鈉1g

④

活性炭2g

⑤

蒸餾水200ml

2021/6/2776【配法】

1.

蒸餾水200ml煮沸后，加入堿性品紅1g，并不斷搖動，使堿性品紅徹底溶解（溶解液為深紅色）。

2.冷卻到50℃時，加入1N鹽酸20ml。

3.再待冷卻至35℃時加入2g偏重亞硫酸鈉，蓋緊膠木塞，輕輕搖動使其溶解，

4.堿性品紅明顯變化，然后放入冰箱內(nèi)24h，溶液為淡黃或淡紅色，

5.用活性炭過濾使溶液呈無色——無色品紅，又稱schiff氏液。貯存于棕色瓶中放入冰箱備用。2021/6/2777

【染色方法】

（1）組織切片，脫臘至水洗。

（2）蒸餾水洗。

（3）1%過碘酸氧化5--10’。

（4）充分蒸餾水洗。

（5）schiff氏液染色20’（放入暗處）。

（6）自來水洗10’。

（7）蘇木素染核

（8）脫水、透明、封片

2021/6/2778【結(jié)果】糖原和PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)成紅色，細(xì)胞核藍(lán)色。2021/6/27792021/6/27802021/6/2781

（五）糖原染色的應(yīng)用2021/6/27821．證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡狀變性

用ＨＥ染色