抗體的制備鮑會(huì)靜臨床免疫教研ris_10713@126.com抗體制備的重要性2抗體制備的重要性34抗體(antibody,Ab)是B細(xì)胞識(shí)別抗原后，增殖、分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。56抗體制備技術(shù)發(fā)展階段Polyclonalantibody,PAbMonoclonalantibody,McAbGeneticengineeringantibody7免疫原與抗血清的制備8多克隆抗體制備：一般策略1.免疫原的制備2.免疫動(dòng)物的選擇3.免疫方法的確定5.免疫血清的純化6.抗血清的鑒定和保存4.測(cè)效價(jià)采血9何謂免疫原？免疫原（immunogen)：刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原免疫原顆粒性抗原可溶性抗原人工修飾的抗原；10一

制備顆粒性免疫原顆粒性免疫原包括：細(xì)胞性抗原：血細(xì)胞和組織細(xì)胞病原體：細(xì)菌、病毒、支原體等11制備綿羊紅細(xì)胞采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調(diào)合適濃度12制備細(xì)菌性免疫原培養(yǎng)細(xì)菌分離、鑒定離心、洗滌合適濃度擴(kuò)大培養(yǎng)滅活處理13二

制備可溶性免疫原可溶性免疫原包括：

---蛋白質(zhì)，細(xì)菌毒素，糖蛋白，脂蛋白等可溶性免疫原制備一般步驟：破碎---提取蛋白---蛋白純化---純度鑒定14組織與細(xì)胞的破碎組織勻漿破碎細(xì)胞提純目的蛋白酶消化處理超聲粉碎反復(fù)凍融表面活性劑15提純目的蛋白超速離心親和層析凝膠層析離子交換層析電泳法選擇性沉淀層析技術(shù)16提純目的蛋白17免疫原純度鑒定免疫原的鑒定純度分子量蛋白含量免疫活性18三

制備人工免疫原人工免疫原：用化學(xué)合成法或基因重組法制備含有已知結(jié)構(gòu)決定簇的抗原人工結(jié)合抗原人工合成抗原基因重組抗原19三

制備人工免疫原人工結(jié)合抗原半抗原(hapten)：僅有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)，如多糖，多肽類脂類，核酸等。免疫原性(immunogenicity)：能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細(xì)胞。反應(yīng)原性(Reactiongenicity

)：抗原與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和/或致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)2021三

制備人工免疫原22三

制備人工免疫原用于連接的載體蛋白質(zhì)類：白蛋白多肽聚合物：多聚賴氨酸大分子聚合物：羧甲基纖維素常用：BSA23三

制備人工免疫原半抗原與載體連接：物理吸附：羧甲基纖維素化學(xué)方法：游離氨基or羧基羥基or醛基or酮基芳香族人工結(jié)合抗原的鑒定(半抗原的個(gè)數(shù)）24三

制備人工免疫原人工合成抗原（化學(xué)合成）基因重組抗原(基因工程抗原)25四

關(guān)于佐劑的使用何謂“佐劑”佐劑（adjuvant）是指能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，應(yīng)用時(shí)可與抗原同時(shí)或預(yù)先注射于機(jī)體。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒(méi)有免疫原性。26四

關(guān)于佐劑的使用佐劑種類：具有免疫原性卡介苗（BCG）無(wú)免疫原性福氏佐劑氫氧化鋁常用：福氏佐劑27福氏佐劑成分：羊毛脂液體石蠟BCG不完全佐劑完全佐劑28福氏佐劑使用原則：顆粒性抗原一般情況下不需使用；可溶性大分子量的蛋白質(zhì)免疫原、人工抗原，初次免疫時(shí)必須使用佐劑；不連續(xù)兩次使用完全福氏佐劑，以免導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重反應(yīng)；29制備福氏佐劑-可溶性抗原復(fù)合物可溶性抗原福氏佐劑充分乳化研磨法與注射器混合法30免疫動(dòng)物的選擇原則：免疫原與動(dòng)物種屬關(guān)系；動(dòng)物個(gè)體狀況的選擇；抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類；抗血清用量和要求；常用免疫動(dòng)物：鼠，兔，驢，馬，綿羊31動(dòng)物飼養(yǎng)做好標(biāo)記細(xì)心觀察做好記錄精心喂養(yǎng)32免疫方法的確定免疫原劑量免疫途徑免疫間隔時(shí)間佐劑的選擇33免疫方案之一：全量免疫法皮下接種福氏完全佐劑-抗原（l～10mg）皮下接種福氏不完全佐劑-抗原（l～10mg），并重復(fù)3-4次，間隔1周肌肉、腹腔或靜脈加強(qiáng)免疫（l～10mg）2周1周34免疫方案之二：微量免疫法皮下接種BCG（10～20mg）腋窩淋巴結(jié)注射福氏完全佐劑-抗原（0.1～0.2mg）肌肉或靜脈加強(qiáng)免疫（0.4～0.6mg）1周1周35如何采血并測(cè)定抗體效價(jià)：測(cè)效價(jià)加強(qiáng)免疫3-5日采血禁食顆粒性抗原免疫原性強(qiáng)，抗體效價(jià)高，可采用凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定。可溶性抗原采用沉淀反應(yīng)或其它標(biāo)記免疫技術(shù)測(cè)定。36如何采血并測(cè)定抗體效價(jià)：測(cè)效價(jià)

Mpre1000200040008000100001600037如何采血并測(cè)定抗體效價(jià)：采血頸動(dòng)脈放血靜脈采血心臟采血38抗血清的鑒定和保存：保存冷凍保存冷凍干燥保存4℃保存單克隆抗體與基因工程

抗體的制備40抗體制備：一般策略1.免疫原的制備2.免疫動(dòng)物的選擇3.免疫方法的確定5.免疫血清的純化6.抗血清的鑒定和保存4.測(cè)效價(jià)采血41單克隆抗體的概念

Monoclonalantibody,McAb由B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一表位、結(jié)構(gòu)相同、功能均一的抗體42雜交瘤技術(shù)的發(fā)展細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展骨髓瘤細(xì)胞株的建立1975KoehlerandMilsteinNature”分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)“1984諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)43雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)小鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞株穩(wěn)定、易于傳代培養(yǎng)細(xì)胞株自身不會(huì)產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子該細(xì)胞是HGPRT的缺陷株目前常用的為NS-1和SP2/O細(xì)胞株44雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)免疫脾細(xì)胞BALB/c小鼠8~12周體重約20g雌雄均可免疫用抗原提高純度和活性免疫途徑多為腹腔和皮內(nèi)多點(diǎn)注射法如果抗原珍貴，可采用脾臟內(nèi)直接注射法細(xì)胞性抗原每次(1~2)x10ug可溶性抗原加完全弗氏佐劑，抗原一般為100ug45雜交瘤技術(shù)的基本原理PEG細(xì)胞融合46雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合PEG融合脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞形態(tài)縮小、相互粘連、發(fā)生融合融合時(shí)間為2min以內(nèi)加培養(yǎng)基稀釋終止反應(yīng)形成2個(gè)或多個(gè)異核細(xì)胞47雜交瘤技術(shù)的基本原理HAT培養(yǎng)基選擇：正常脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞48核苷酸合成途徑次黃嘌呤、甲氨喋呤、胸腺嘧啶核苷酸49雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)HAT：次黃嘌呤、甲氨喋呤、胸腺嘧啶核苷酸脾細(xì)胞一般培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，5~7天死亡骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中不能增值而死亡雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中可正常生長(zhǎng)50雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆抗原抗體特異性結(jié)合51雜交瘤技術(shù)的基本原理陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化與凍存單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)成為克隆化有限稀釋法52雜交瘤技術(shù)的基本原理陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化與凍存單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)成為克隆化顯微鏡操作法：時(shí)間長(zhǎng)熒光激活細(xì)胞分選儀：價(jià)格昂貴軟瓊脂平板法：瓊脂溫度難掌握雜交瘤細(xì)胞的凍存DMSO液氮保存53單克隆抗體的制備

動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)法5455單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)和局限性不斷產(chǎn)生高特異性、高均一性抗體用相對(duì)不純的抗原獲得大量均一抗體適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析免疫導(dǎo)向治療親合力受限，不能沉淀和凝集反應(yīng)反應(yīng)強(qiáng)度不如多抗制備復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格高56單克隆抗體的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)病原微生物抗原、抗體檢測(cè)腫瘤抗原檢測(cè)免疫細(xì)胞及其亞群檢測(cè)激素檢測(cè)細(xì)胞因子的測(cè)定57基因工程抗體的制備

基因工程抗體(geneticengineeringantibody)：應(yīng)用DNA重組及蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)編碼抗體基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖痔峒?xì)胞后重新表達(dá)的抗體人源化抗體小分子抗體抗體融合蛋白雙特異性抗體噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)58基因工程抗體的制備

基因工程抗體(geneticengineeringantibody)：人源化抗體Humanizedantibody,HAb減少抗體的異源性，利于臨床應(yīng)用嵌合抗體(chimericantibody)鼠-人嵌合的重鏈和輕鏈改形抗體(reshapedantibodyRAb)CDRgraftingantibody使得多種鼠源的特異性單抗能夠應(yīng)用于臨床59基因工程抗體的制備

基因工程抗體(gen