生物檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的液相色譜-質(zhì)譜檢驗(yàn)方法21)內(nèi)標(biāo)儲備溶液：精密稱取士的寧(或其他合適內(nèi)標(biāo)物)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0mg/mL士的寧內(nèi)標(biāo)儲備溶液。密封，置于冰箱中冷凍保存，有效期12個(gè)月，或采用市售標(biāo)準(zhǔn)溶液：2)內(nèi)標(biāo)工作溶液：2μ/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液由符合5.1h)1)的內(nèi)標(biāo)儲備溶液用甲醇稀釋得到。密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3個(gè)月。5.2儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備及要求如下。a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI。b)電子天平：分度值≤0.1mg。c)旋渦混合器。d離心機(jī)。e)恒溫水浴鍋。f)移液器。6定性分析6.1樣品前處理6.1.1檢材樣品6.1.1.1體液樣品取血液(或尿液)0.5mL,加入內(nèi)標(biāo)工作溶液10μL,然后加入1%氫氧化鈉溶液50μL,渦旋混勻，再加入乙酸乙酯3L,渦旋混勻，2500r/min離心3min,取上清液于55℃水浴中吹干，殘留物用甲醇：含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸銨緩沖溶液(體積比7:3)100μL復(fù)溶，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分6.1.1.2組織樣品稱取剪碎(或勻漿后)組織0.5g,加入內(nèi)標(biāo)工作溶液10山，然后加入1%氫氧化鈉溶液800μL,渦旋混勻，再加入乙酸乙酯3mL,渦旋混合，2500r/min離心3min,取上清液于55℃水浴中吹干，殘留物用甲醇：含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸銨緩沖溶液(體積比7:3)200L復(fù)溶，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，置于-20-C冰箱中放置30min,12000r/min離心3min,取上清液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。6.1.2空白樣品移取(或稱取)空白血液(或尿液》0.5mL,(或相似空白組織0.5g)作為空白樣品，按6.1.1.1(或6.1.1.2)的方法，與檢材樣品平行操作。6.1.3添加樣品移取(或稱取)空白血液(或尿液)0.5mL(或相似空白組織0.5g),添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液，配制成1ng/mL的鉤吻素子、鉤吻素甲和0.1ng/mL鉤吻素己的添加樣品，然后按6.1.1.1(或6.1.1.2)的方法，與檢材樣品平行操作。6.2儀器檢測6.2.1儀器條件6.2.1.1液相色譜條件以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。a)色譜柱：C18柱(150mm×2.1mm,5μm)或其他等效柱。b)流動相：流動相A為含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸銨緩沖溶液，流動相B為甲醇；采用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。3c)流速：0.2mL/mind)柱溫：室溫。表1流動相梯度洗脫程序06.2.1.2質(zhì)譜條件6.2.1.2.1以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。a)離子源：電噴霧電離-正離子模式(ESI+)。b)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。d)碰撞氣、氣簾氣、霧化氣、輔助氣均為高純氮?dú)?，使用前調(diào)節(jié)各氣流流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。e)去簇電壓、碰撞能量優(yōu)化至最佳靈敏度。6.2.1.2.2在符合6.2.1.1和6.2.1.2的液相色譜條件和質(zhì)譜條件下，目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間參見表2。表2目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間目標(biāo)物V土的寧(內(nèi)標(biāo)物)分別吸取空白樣品提取液、檢材樣品提取液和添加樣品提取液，按6.2.1的條件進(jìn)樣分析。記錄空白樣品、檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物可疑色譜峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜特征離子對和離子對豐度比。6.4定性判斷依據(jù)以保留時(shí)間、質(zhì)譜特征離子對峰和離子對豐度比作為定性判斷依據(jù)。若檢材樣品中出現(xiàn)目標(biāo)物的兩對定性離子對的色譜峰，保留時(shí)間與添加樣品中相應(yīng)目標(biāo)物的色譜峰保留時(shí)間比較，相對誤差在士2.5%內(nèi)，且定性離子對豐度比與添加樣品的離子對豐度比之相對誤差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷檢材樣品中檢出該種目標(biāo)物。4移取(或稱取)檢材樣品血液(或尿液)0.5mL(或組織0.5g)兩份，按6.1.1.1(或6.1.1.2)的方法操作。另取與檢材樣品相似基質(zhì)的空白樣品若干份，添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液適量，制得系列質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))或單點(diǎn)質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品，與檢材樣品平行操作。目標(biāo)物的相關(guān)資料見附錄A,相關(guān)信息及方法線性范圍、檢出限與定量限見附錄B。檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))應(yīng)在工作曲線的線性范圍內(nèi)。配制單點(diǎn)質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品時(shí)，檢材樣品中目標(biāo)物質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))應(yīng)在添加樣品目標(biāo)物質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的(100±50)%范圍內(nèi)。儀器條件應(yīng)符合6.2.1的規(guī)定。分別將檢材樣品、系列質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品或單點(diǎn)質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加記錄檢材樣品、系列質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品或單點(diǎn)質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)法)定量離子對的峰面積值，然后計(jì)算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))。在系列質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品中，以目標(biāo)物定量離子對的峰面積值(D為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)，○為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積值，按式(1)計(jì)算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))。C——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位a—線性方程的截距；b—線性方程的斜率。根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物的峰面積值，按式(2)計(jì)算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))。5式中：c——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位為納克每毫升(ng/mL)或納克每克(ng/g):——添加樣品中目標(biāo)物的峰面積值：在系列質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加樣品中，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值(D為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)，O為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值，按式(3)計(jì)算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))。C——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位為納克每毫升(ng/mL)或納克每克(ng/g);7.3.3.2內(nèi)標(biāo)-單點(diǎn)校正法根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值，按式(4)計(jì)算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))。c——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位為納克每毫升(ng/mL)或納克每克(ng/g);A—檢材樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值；——添加樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比c——添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位為納克每毫升(ng/mL)或納克每克(ng/g)。7.3.4計(jì)算相對相差檢材樣品平行測定兩份，相對相差按式(5)計(jì)算。G、C——兩份檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù)),單位為納克每毫升(ng/mL)或納克C——兩份檢材樣品中目標(biāo)物質(zhì)量濃度(或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的平均值(G+G)/2,單位為納克每毫升(ng/mL)或納克每克(ng/g)。陰性結(jié)果評價(jià)包括：a)若檢材樣品中僅檢出內(nèi)標(biāo)物，未檢出目標(biāo)物，且添加樣品中檢出目標(biāo)物，則陰性結(jié)果可靠；7(資料性)鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的相關(guān)資料鉤吻為馬錢科胡蔓藤屬植物胡蔓藤的全株。在民間，鉤吻以外用為主，具有祛風(fēng)、殺蟲止癢、消腫拔毒的療效。鉤吻主要化學(xué)成分為吲哚類生物堿，是其產(chǎn)生藥理活性和劇烈毒性的主要來源。鉤吻具極強(qiáng)的神經(jīng)毒性，主要抑制延腦的呼吸中樞，引起呼吸中樞麻痹，導(dǎo)致呼吸衰竭死亡。其中毒癥狀包括消化系統(tǒng)：口腔、咽喉灼痛、惡心、腹痛、腹脹、腹瀉或便秘等：神經(jīng)系統(tǒng)：眩暈、言語含糊、吞咽困難、肌肉松弛無力、呼吸肌麻痹、昏迷等；循環(huán)和呼吸系統(tǒng)：中毒早期心跳緩慢，呼吸快而深，之后心搏加快，呼吸慢而淺、不規(guī)則，后期呼吸困難，體溫及血壓下降，嚴(yán)重者昏迷抽