分子生物學檢驗技術核酸擴增技術生物化學檢驗教研室學習目標掌握：PCR技術的基本原理及反應體系；及PCR產物電泳檢測方法。熟悉：PCR常見問題及體系優(yōu)化；實時熒光定量RCR的原理。了解：PCR衍生技術；產物的其他檢測方法；PCR方法標準化。目錄聚合酶鏈反應01PCR衍生技術02CONTENTS分子生物學檢驗技術CONTENTSPCR檢測技術的臨床應用03PCR衍生技術PART02一、實時熒光定量PCR指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，結合相應軟件，通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR常規(guī)PCR靈敏度高只能進行半定量定性分析高精確度不安全易污染安全省時費時費力一、實時熒光定量PCR實時、熒光、定量指在常規(guī)PCR基礎上引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，PCR產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。如何實時檢測？？？實時、熒光、定量參照已知拷貝數(shù)的DNA標準品為標準，通過擴增及對熒光值的監(jiān)測，對待測DNA起始模板量的定量。如何定量？？？一、實時熒光定量PCR基本概念擴增曲線1基線2熒光閾值3Ct值4基本概念在引物、模板、緩沖液、酶等都充足的理想狀態(tài)下，熒光定量PCR的擴增曲線應該是這樣的：基本概念在dNTP和酶都有限的情況下，擴增曲線如下圖所示，有一個平臺期，酶逐漸失活，dNTP消耗殆盡，產物增加量逐漸減少；直至沒有任何產物生成，數(shù)目保持恒定。擴增曲線橫坐標縱坐標擴增循環(huán)數(shù)熒光強度每個循環(huán)，進行一次熒光信號的收集。Q-PCR分四個階段擴增曲線對數(shù)圖譜線性圖譜基線基線平臺期熒光背景信號階段終產物與起始模板量之間沒有線性關系。擴增的信號被背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。一般把擴增PCR前15個循環(huán)信號為本底信號（基線期）。熒光信號指數(shù)擴增階段產物量的對數(shù)值與起始模板量呈線性關系。熒光閾值/fluorescencethreshold在熒光擴增曲線上人為設定的一個值（即一個標準），它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。熒光閾值/fluorescencethreshold閾值Ct值/CyclethresholdPCR擴增過程中，擴增產物（熒光信號）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值的意義Ct值與重復性同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增Ct值與濃度不同的模板達到熒光域值時的Ct值不同Ct值和初始模板有什么關系？每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系。如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析。標準曲線104105106103102起始拷貝數(shù)標準品熒光閾值熒光信號強度循環(huán)數(shù)未知濃度樣品10202530不同的模板達到熒光域值時的Ct值不同標準曲線初始DNA量（log/p>

5432Ct值利用已知起始拷貝數(shù)的標準品做標準曲線標準曲線通過未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度標準曲線標準曲線熒光染料摻入的原理？---熒光強度與模板數(shù)量成正比熒光探針：SYBRGreen1熒光染料常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它熒光報告基團。TaqManMolecularBeacons（一）熒光探針技術探針的5′端和3′端分別標記熒光報告基團R和熒光淬滅基團Q。探針完整時R基團與Q基團分別位于探針的二端，Q基團抑制R基團使其不能發(fā)射熒光。熒光素標記探針（一）熒光探針技術（一）熒光探針技術（二）SYBR熒光染料PCR反應體系中加入SYBRGreenⅠ染料，能選擇性地摻入至雙鏈DNA分子中，并且產生強烈熒光。PCR過程中，SYBRGreenI染料結合到新合成的雙鏈DNA分子中，結合的熒光信號和DNA含量成正比。（二）SYBR熒光染料SYBRGreen1SYBRGreen1結合到雙鏈DNA的小溝部位染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA