ICS11.020CCSC10CITST/CITS179—2024抗核抗體間接免疫熒光法檢測及臨床應(yīng)用Guidelinesforantinuclearantibodytestingbyindirectimmunofluorescenceandclinicalapplication2024-11-27發(fā)布2024-11-27實施中國檢驗檢測學(xué)會發(fā)布前言 I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15檢測原理與方法 25.1檢測原理 25.2檢測方法 26開展前準(zhǔn)備工作 26.1性能驗證 26.2人員培訓(xùn) 26.3儀器校準(zhǔn) 26.4制定SOP 27IIF-ANA檢測操作 37.1檢驗前 37.2檢驗中 37.3結(jié)果判讀 37.4結(jié)果報告 38質(zhì)量控制 48.1室內(nèi)質(zhì)控 48.2室間質(zhì)評 58.3數(shù)據(jù)總結(jié) 59ANA檢測的臨床應(yīng)用 59.1自身免疫性疾病的診斷 59.2病情監(jiān)測與療效評估 5參考文獻 6I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院、歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司、國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院提出。本文件由中國檢驗檢測學(xué)會歸口。本文件起草單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院、國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院、歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司、安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、巴彥淖爾市醫(yī)院、北京大學(xué)深圳醫(yī)院、北京實安科技有限公司、北京醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)會、北京中檢體外診斷工程技術(shù)研究中心、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院、淮安市第二人民醫(yī)院、江蘇三聯(lián)生物工程股份有限公司、晉江市醫(yī)院（上海市第六人民醫(yī)院福建醫(yī)院）、蘭州大學(xué)第一醫(yī)院、泉州市第一醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院、上海市皮膚病醫(yī)院、上海市第一人民醫(yī)院嘉定醫(yī)院（上海市嘉定區(qū)江橋醫(yī)院）、上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院、無錫市第二人民醫(yī)院、沃芬醫(yī)療器械商貿(mào)（北京）有限公司、廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、應(yīng)急總醫(yī)院、臺州市中心醫(yī)院、通標(biāo)偉業(yè)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院。本文件主要起草人：盛慧明、林錦驃、劉萬陽、李川、戴其全、朱俊、閆利明、杜靜、李娜、穆紅、范春梅、陳惠娟、張曉琍、王健、袁育林、薛麗、杜雪飛、鄒偉華、吳士及、梁勇、潘維華、朱宗林、于海濤、張志珊、翁文浩、杜芳、鄭冰、鄭英霞、羅清瓊、伍均、高華利、薛鸞、宗明、龔芳、唐小梅、宣景秀、李輝、孟存仁、許慧、吳曉宇、許雪英。I抗核抗體間接免疫熒光法檢測及臨床應(yīng)用指南本文件提供了間接免疫熒光法檢測抗核抗體的原理與方法、開展前準(zhǔn)備工作、IIF-ANA檢測操作、質(zhì)量控制和ANA檢測臨床應(yīng)用等方面的指導(dǎo)。本文件適用于醫(yī)療機構(gòu)、第三方實驗室開展抗核抗體檢測工作及臨床醫(yī)生對抗核抗體檢測結(jié)果的解讀和應(yīng)用。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1抗核抗體antinuclearantibodies；ANA以真核細(xì)胞的各組分為靶抗原的自身抗體總稱。3.2抗體antibody機體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞后產(chǎn)生的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合并介導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫效應(yīng)的球蛋白。[來源：GB/T40265—2021，3.1]3.3抗原antigen可以誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生抗體的物質(zhì)，能夠被相應(yīng)抗體識別并與之結(jié)合。[來源：GB/T40265—2021，3.2]3.4間接免疫熒光法indirectimmunofluorescenceassay；IIF用特異性抗體（抗原）與標(biāo)本中相應(yīng)抗原（抗體）反應(yīng)后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體（抗抗體）與抗原-抗體復(fù)合物中第一抗體結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀察特征性熒光，以檢測抗原或抗體的方法。4縮略語下列縮略語適用于本文件。AILD：自身免疫性肝病(autoimmuneliverdiseases)CAD：計算機輔助診斷系統(tǒng)（computeraideddiagnosis）DM:皮肌炎（dermatomyositis）HEp-2：人喉癌上皮細(xì)胞（humanepithelioma-2）MCTD：混合性結(jié)締組織?。╩ixedconnectivetissuedisease）1PM：多發(fā)性肌炎（polymyositis）SS：干燥綜合征（Sj?gren′ssyndrome）SSc：系統(tǒng)性硬化癥（systemicsclerosis）SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus）SOP：標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standardoperationprocedure）5檢測原理與方法5.1檢測原理將含有細(xì)胞核成分的細(xì)胞（如HEp-2）作為抗原底物，與患者血清中的ANA進行反應(yīng)，利用抗原抗體反應(yīng)及熒光標(biāo)記技術(shù)檢測ANA。如果血清中存在ANA，它們會與細(xì)胞核成分特異性結(jié)合。隨后加入熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體（以下簡稱二抗），該抗體會與ANA結(jié)合，從而在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表明ANA的存在。5.2檢測方法IIF法是檢測抗核抗體的參考方法。采用IIF法檢測時宜滿足以下條件：a)在HEp-2實驗基質(zhì)中，每顯微鏡視野（放大倍數(shù)為200倍）可見3個～5個有絲分裂細(xì)胞；b)二抗使用熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體；c)樣本稀釋方法可根據(jù)不同的檢測試劑而采用10稀釋系統(tǒng)或倍比稀釋系統(tǒng)。6開展前準(zhǔn)備工作6.1性能驗證在開展IIF-ANA檢測前宜進行性能驗證，驗證內(nèi)容包括但不限于：a)符合率；b)精密度（重復(fù)性）；e)抗干擾能力。6.2人員培訓(xùn)實驗操作以及結(jié)果判讀的人員宜參加培訓(xùn)并通過考核、獲得相關(guān)授權(quán)后方可獨立工作。培訓(xùn)的內(nèi)容包括但不限于：a)實驗基本原理和操作步驟；b)儀器和顯微鏡的操作、維護保養(yǎng)和處理一般性故障；c)質(zhì)量控制及失控處理；d)熒光模型判讀及相關(guān)抗體臨床意義；e)試劑更換批號比對。6.3儀器校準(zhǔn)儀器校準(zhǔn)內(nèi)容包括但不限于：a)加樣體積的準(zhǔn)確性和精密度在儀器說明書規(guī)定的范圍內(nèi)；b)攜帶污染率評估；c)顯微鏡及CAD的光強度，宜采用熒光顯微鏡校準(zhǔn)玻片或光功率計校準(zhǔn)，結(jié)果在儀器說明書規(guī)定d)至少每年校準(zhǔn)1次，對于使用頻次高的儀器，宜增加校準(zhǔn)頻率。6.4制定SOP6.4.1SOP包括但不限于下列內(nèi)容：2a)項目信息：項目名稱、檢測原理及方法、試劑、熒光顯微鏡、自動化儀器（如使用自動熒光制片機、CAD）等；b)樣本要求：檢測樣本類型及儲存要求；c)室內(nèi)質(zhì)控程序及可接受標(biāo)準(zhǔn)；d)實驗操作步驟：具體實驗步驟（手工和儀器）和注意事項等；e)項目性能參數(shù)：符合率、精密度、檢出限、臨界值和抗干擾能力等；f)結(jié)果報告：結(jié)果解釋、臨床意義、備注信息等；g)其他信息：熒光片保存條件（試劑保存及完成的熒光載片保存條件）等。6.4.2如果使用自動化儀器（自動化熒光制片機、CAD），其SOP的內(nèi)容在滿足6.4.1所列內(nèi)容基礎(chǔ)上還包括但不限于：a)儀器校準(zhǔn)要求；b)儀器操作步驟及維護保養(yǎng)；c)常見故障及處理措施。7IIF-ANA檢測操作7.1檢驗前檢驗前完成的內(nèi)容包括：a)確認(rèn)環(huán)境溫濕度符合檢測體系的要求，室溫宜為18℃~25℃,濕度宜為30％～70%;b)測試樣本和試劑平衡至室溫，熒光片進行室溫平衡時不宜從包裝的鋁膜中拆出；c)按試劑說明書配制緩沖液，并充分混合。注：如果使用自配緩沖液，建議考慮緩沖液的pH值為7.2～7.4。7.2檢驗中檢驗中的操作包括：a)每批實驗宜有血清基質(zhì)的質(zhì)控品；b)加樣時加樣槍不宜接觸到細(xì)胞，不宜產(chǎn)生氣泡，液體宜覆蓋整個孔，且不外溢到相鄰孔中；c)洗片時，不宜將洗液直接對著孔內(nèi)沖洗，避免損傷基質(zhì)上包被的細(xì)胞和組織；d)加熒光二抗前，宜去除熒光片上多余的洗液；e)觀察玻片的疏水性，保持熒光片上的試劑呈液滴狀態(tài)，避免液體散開并外流至其他孔中；f)實驗過程中手指避免觸碰熒光片的基質(zhì)；g)封片時，孔內(nèi)不宜有氣泡產(chǎn)生；h)完成實驗后，宜立刻讀片；如不能立即讀片，宜按熒光片要求的保存條件進行保存；i)實驗過程由全自動儀器完成時，實驗過程中宜確保每個樣本孔的樣本及試劑加樣準(zhǔn)確；實驗過程洗液宜充足，沒有干片現(xiàn)象。7.3結(jié)果判讀7.3.1結(jié)果判讀宜在顯微鏡下進行操作。使用光源為汞燈的顯微鏡時，在接通電源后宜預(yù)熱10min~15min，汞燈電源開、關(guān)時間宜間隔30min以上。使用光源為LED燈的顯微鏡時即開即用。宜定期維護保養(yǎng)顯微鏡，記錄顯微鏡每次使用時長，到達使用壽命宜及時更換。7.3.2結(jié)果判讀宜包括以下內(nèi)容：a)只有在質(zhì)控結(jié)果符合要求的情況下，才可進行結(jié)果判讀；b)低倍鏡（20倍物鏡）用于判讀陰陽性結(jié)果，高倍鏡（40倍物鏡）用于判讀熒光模型；c)采用CAD的實驗室，判讀結(jié)果由讀片人員復(fù)核后進行報告；d)結(jié)果判讀宜“雙人雙核”，結(jié)果不一致時由兩人討論后進行結(jié)果報告；e)若手工記錄判讀結(jié)果錄入信息系統(tǒng)，宜雙人核對，準(zhǔn)確錄入結(jié)果。7.4結(jié)果報告7.4.1IIF-ANA檢測結(jié)果報告宜包括：3a)檢測方法；b)定性結(jié)果（陽性/陰性）；c)熒光模型；d)陽性結(jié)果的滴度；e)必要的臨床建議。7.4.2IIF-ANA檢測結(jié)果報告格式范例見表1。表1IIF-ANA檢測結(jié)果報告范例序號報告內(nèi)容1檢測結(jié)果：陰性檢測方法：間接免疫熒光法建議：無2細(xì)胞核陽性熒光模型包括：核均質(zhì)型、核顆粒型、致密細(xì)顆粒型、著絲點型、核點型、核仁型、核膜型和核多形性型等檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560或（依據(jù)各實驗室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：如果臨床懷疑SLE、SS、SSc、MCTD或PM/DM等，考慮進一步檢測疾病相關(guān)抗體3細(xì)胞胞漿陽性熒光模型包括：胞漿纖維型、胞漿顆粒型、胞漿網(wǎng)狀/線粒體樣型、胞漿極性/高爾基體樣型和胞漿棒環(huán)狀型檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560或（依據(jù)各實驗室采用的試劑廠牌推薦的滴度系統(tǒng)報告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：如果臨床懷疑SLE、AILD或PM/DM等，考慮進一步檢測疾病相關(guān)抗體4細(xì)胞有絲分裂期核型陽性熒光模型包括：中心粒型、紡錘體型、中間體型、染色體型檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560（依據(jù)各實驗室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：臨床相關(guān)性不明5混合熒光模型陽性：參照：2、3和4，熒光模型的報告優(yōu)先級順序為細(xì)胞核熒光模型、細(xì)胞漿熒光模型、細(xì)胞有絲分裂期熒光模型。相同優(yōu)先級的熒光模型，宜按滴度高低順序依次報告檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560（依據(jù)各實驗室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：參照2、3和4，根據(jù)熒光模型進行相應(yīng)建議7.4.3混合熒光模型的報告優(yōu)先級順序為細(xì)胞核熒光模型、細(xì)胞漿熒光模型、細(xì)胞有絲分裂期熒光模型，相同優(yōu)先級的模型宜按滴度高低順序依次報告。7.4.4HEp-2細(xì)胞核、細(xì)胞胞漿及細(xì)胞有絲分裂期熒光模型宜納入ANA陽性結(jié)果。7.4.5針對靶抗原特異性自身抗體檢測結(jié)果，報告宜包括檢測方法、檢測結(jié)果、參考區(qū)間及必要的臨床建議。8質(zhì)量控制8.1室內(nèi)質(zhì)控48.1.1室內(nèi)質(zhì)控品包括陰性、陽性/弱陽性2個水平，可使用商品化的質(zhì)控血清或自制血清作為室內(nèi)質(zhì)控品。不宜僅采用商品化試劑盒中自帶的陰陽性對照品作為實驗檢測的室內(nèi)質(zhì)控品。8.1.2自制室內(nèi)質(zhì)控品可采用ANA檢測陰性、弱陽性、陽性混合血清或來源于單一患者的血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，充分混勻分裝后對自制質(zhì)控品進行均一性和穩(wěn)定性驗證。8.1.3質(zhì)控結(jié)果同時滿足以下條件則表明室內(nèi)質(zhì)控品結(jié)果符合要求：a)陰性、陽性一致；b)陽性質(zhì)控?zé)晒饽Ｐ鸵恢拢籧)陽性質(zhì)控品的滴度在靶值±一個滴度范圍內(nèi)。8.2室間質(zhì)評宜參加衛(wèi)生主管部門組織的室間質(zhì)評。如果室間質(zhì)評中未涉及的必報熒光模型，宜定期（一年兩次）進行實驗室間比對。8.3數(shù)據(jù)總結(jié)宜計算過去12個月ANA陽性率的均值，確立變異系數(shù)（coefficient