選擇性必修三《生物技術(shù)與工程》第3章

基因工程

第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。普通棉花如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花基因工程基因工程P67◎

基因工程

按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在

DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。①操作對象：②操作水平：③原理：④結(jié)果：⑤意義：基因（DNA）DNA分子水平基因重組創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品定向改造生物遺傳特性；克服遠緣雜交不親和障礙水母的綠色熒光蛋白基因基因工程基因工程概念1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內(nèi)表達？DNA分子的組成、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補

配對方式相同。（四種脫氧核苷酸、規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)）生物界共用同一套遺傳密碼。（都遵循中心法則）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)基因工程脫氧核糖含氮堿基磷酸DNA平面結(jié)構(gòu)DNA立體結(jié)構(gòu)科學家通過精心設(shè)計，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？情境導入轉(zhuǎn)基因番木瓜思考培育抗番木瓜環(huán)斑病毒的木瓜“分子手術(shù)刀”準確切割DNA分子“分子縫合針”將DNA片段連接起來“分子運輸車”將體外重組好DNA分子導入受體細胞抗病基因與運載體DNA“縫合”抗病基因提取出來抗病基因進入番木瓜分子工具情境導入目錄課堂小結(jié)探究新知04情境導入030201課堂練習一.限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”二.DNA連接酶—“分子縫合針”三.基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”四.DNA的粗提取與鑒定切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切核酸酶，又稱

。1.來源：2.種類：主要來自原核生物限制酶數(shù)千種(不是一種酶，而是一類酶)3.作用特點：專一性(特異性)

能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”注意：①只能識別DNA雙鏈不識別RNA或DNA單鏈②識別特定的核苷酸序列非堿基序列③有專一性但并非一種限制酶只識別一種特定的核苷酸序列4.識別序列EcoRⅠSmaⅠTaqⅠ5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成；也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。1.都可以找到一條中（心）軸線；2.中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復排列的，稱為回文序列。正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”特點:5.切割結(jié)果黏性末端黏性末端

實例1—EcoRⅠ限制酶

形成黏性末端識別特定序列為GAATTC切割特定部位為G、A之間的磷酸二酯鍵當限制酶在識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端。黏性末端？一TTAA—G—CTTAAAATTC—G—一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”實例2——Sma

Ⅰ限制酶平末端形成平末端識別特定序列為CCCGGG切割特定部位為C、G之間的磷酸二酯鍵當限制酶在它識別序列的中軸線處將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是平末端?！狦GG—CCCCCC—GGG—一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”問題1.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端。黏性末端？一CTAG一TTAA一TCGA一CTAG同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？相同可能會相同同尾酶：識別的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”思考:2.結(jié)合右圖，推斷限制酶切一次可斷開

個磷酸二酯鍵，產(chǎn)生

個游離的磷酸基團，消耗

分子水。

兩2兩3.下圖甲是一個DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點，據(jù)圖回答：(1)用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；(2)用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；23(3)要想獲得抗病基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”5.推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？限制酶是原核生物的一種防御工具，用來切割侵入細胞的外源DNA，以保證自身安全。4.為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？該生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾。（如甲基化）一、限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”想一想：把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)“分子縫合針”—DNA連接酶二、DNA連接酶—“分子縫合針”1.作用：2.種類：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶類型E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶來源功能縫合

和

；

縫合__________和_______________結(jié)果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端(效率低)磷酸二酯鍵★DNA連接酶沒有識別特異性(相同或互補的黏性末端以及平末端都能連接)二、DNA連接酶—“分子縫合針”注意：不是連接氫鍵平末端（連接平末端效率遠低于T4DNA連接酶）3.E·coliDNA連接酶的縫合作用兩個DNA片段要具有互補（相同的）黏性末端才能連接起來把兩個DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接兩個雙鏈DNA片段中的DNA單鏈缺口，但不能直接連接兩條單鏈的DNA！二、DNA連接酶—“分子縫合針”DNA連接酶作用部位？是磷酸二酯鍵（扶手）不是氫鍵DNA連接酶將兩個雙鏈DNA片段“縫合”連接起來，形成一個雙鏈DNA分子，恢復被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。二、DNA連接酶—“分子縫合針”T4DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率相對較低。T4DNA連接酶的縫合作用二、DNA連接酶—“分子縫合針”二DNA連接酶——“分子縫合針”旁欄思考題DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？▲

DNA復制中DNA聚合酶發(fā)揮作用AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶作用示意圖只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵。二、DNA連接酶—“分子縫合針”二DNA連接酶——“分子縫合針”項目DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質(zhì)化學本質(zhì)不同點模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵二、DNA連接酶—“分子縫合針”4.比較DNA連接酶和DNA聚合酶【核心歸納】與DNA相關(guān)的幾種酶的比較項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵作用對象DNA片段DNA單個的脫氧核苷酸DNA作用結(jié)果將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸DNA酶二、DNA連接酶—“分子縫合針”思考：根據(jù)所

學知識，完成以下填空：①限制酶

②解旋酶

③DNA連接酶

④DNA聚合酶

⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵二、DNA連接酶—“分子縫合針”1.作用：2.種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。將目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞，在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細胞將外源基因?qū)胫参锛毎麑⑼庠椿驅(qū)雱游锛毎麃碓床煌诖笮?、結(jié)構(gòu)、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”3.最常用的載體——質(zhì)粒

一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。其基因?qū)儆诩毎|(zhì)基因。不是一種細胞器為什么質(zhì)粒能作為載體呢？它具有什么特點？三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”復制原點目的基因插入位點氨芐青霉素抗性基因①能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。外源DNA片段（目的基因）插入其中②有一個至多個限制酶切割位點EcoR

ⅠSma

Ⅰ...便于重組DNA分子的篩選③具有標記基因除了氨芐青霉素抗性基因外，四環(huán)素抗性基因，熒光蛋白基因等也可作為標記基因。圖1-14.★作為載體所具備的條件及原因使外源基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并復制，以擴增外源基因的數(shù)量④無毒害作用避免受體細胞受到損傷三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。標記基因的篩選原理

載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，受體細胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。也可用熒光蛋白基因做標記重組DNA導入受體細胞不是100%，而且導入率較低三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”現(xiàn)有一段DNA，含有g(shù)1、g2、g3，若要將g2提取出來，如何操作？28g1g2g3請同學找到兩條片段上EcoRI的識別序列和切割位點。實例：重組DNA分子的模擬操作(P73)三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…重組DNA分子GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對?

如果不能，可能是什么原因造成的？

如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能。因為基因的長度一般在100個堿基對以上。三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”用相同的限制酶切割目的基因和運載體。產(chǎn)生相同末端，便于連接。1.目的基因是要與運載體結(jié)合的，那如何處理質(zhì)粒？用DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)目的基因自身環(huán)化、質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因與質(zhì)粒連接（正反向）三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”小結(jié)(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了：

。但是使用該法缺點是容易發(fā)生

以及

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質(zhì)粒反向連接目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶（雙酶切法）去切割目的基因和運載體三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”小結(jié)不破壞目的基因至少保留一個完整的標記基因，便于篩選(2)選擇限制酶切割位點的基本原則：①切割目的基因時：

。②切割質(zhì)粒時：

。③切割目的基因和質(zhì)粒時：

。理由：防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和目的基因反向連接最好選用不同的限制酶切割三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”溶解度:1.提取原理：利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面存在的差異，提取DNA，去除其他成分。②DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，可提純DNA。①DNA不溶于酒精，細胞中某些蛋白質(zhì)溶于酒精，初步分離DNA和蛋白質(zhì)。0DNA溶解度NaCl濃度（mol/L）0.142四、DNA的粗提取與鑒定

當NaCl的物質(zhì)的濃度為0.14mol/L時，DNA的溶解度

。此時DNA

（溶解或析出）。當NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol/L時，DNA的溶解度最大。最小析出0DNA溶解度NaCl濃度（mol/L）0.1422.鑒定原理：二苯胺有毒，現(xiàn)配現(xiàn)用并用棕色瓶存放在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色。四、DNA的粗提取與鑒定注意:3.材料用具

富含DNA的材料(如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜和豬肝等)、研磨液、體積分數(shù)為95％的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。利用動物細胞提取DNA破碎細胞的方法：動物細胞無細胞壁，可直接吸水漲破。不能用哺乳動物成熟的紅細胞中無細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。四、DNA的粗提取與鑒定4.方法步驟（1）通過研磨釋放DNA

稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。①研磨的目的：②研磨時間不宜太長：③有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶：

④研磨不宜太用力破碎細胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中防止研磨時產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量研磨效果好（有利于充分研磨）研磨液成分作用SDS使蛋白質(zhì)變性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNA四、DNA的粗提取與鑒定（2）過濾獲取含DNA的上清液可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。過濾能用濾紙代替嗎？①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂。不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。4.方法步驟低溫放置幾分鐘的作用：四、DNA的粗提取與鑒定

在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%),靜置2~3min,溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分;或者將溶液倒入塑料離心管中,在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,棄上清液,將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子。①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；②低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。③使蛋白質(zhì)溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。（3）冷卻酒精析出DNA4.方法步驟四、DNA的粗提取與鑒定（4）DNA的鑒定

取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。

加入2mol/L氯化鈉溶液不加入絲狀物加入4mL二苯胺試劑加入2mol/L氯化鈉溶液加入絲狀物加入4mL二苯胺試劑實驗組水浴加熱對照組溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關(guān)四、DNA的粗提取與鑒定5.結(jié)果分析①材料中的核物質(zhì)沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠。②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞。③二苯胺最好現(xiàn)用現(xiàn)配，否則二苯胺變成淺藍色，影響鑒定效果。1.怎么確認實驗提取出來的是DNA所含雜質(zhì)較少？若鑒定結(jié)果呈現(xiàn)藍色比

較淺，說明什么問題？

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。2.與其他同學提取的DNA進行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。四、DNA的粗提取與鑒定6.進一步探究方法一：可以先添加質(zhì)量分數(shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。方法二：由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。本實驗只是對DNA進行了粗提取，請在閱資料，了解實驗室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實驗中所使用的方法進行比較，總結(jié)兩種方法的異同。四、DNA的粗提取與鑒定刑偵破案DNA提取的應用基因組測序插入人胰島素基因的大腸桿菌基因工程親子鑒定四、DNA的粗提取與鑒定限制酶作用部位：種類E.coliDNA連接酶運載工具條件③

有一個至多個限制酶切割位點質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒DNA連接酶作用部位：切開DNA分子的磷酸二酯鍵來源：主要存在于原核生物中特點：具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接