體外放射分析法體外放射分析法類型一、競(jìng)爭(zhēng)性分析：

放射免疫分析法（RIA），標(biāo)記抗原二、非競(jìng)爭(zhēng)性分析：

免疫放射分析法（IRMA），標(biāo)記抗體體外放射分析法放射免疫分析一、基本原理：

限量標(biāo)記抗原（*Ag）和可變量的待測(cè)的非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的特異性抗體（Ab）發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物的放射性來(lái)計(jì)算出待測(cè)非標(biāo)記抗原的含量。*AgAgAb*Ag-AbAg-Ab*Ag＋＋體外放射分析法放射免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線常用的三種作圖法體外放射分析法二、RIA試劑盒的必備條件：1、抗體：

多克隆抗體與單克隆抗體理想的抗體：高親和力、高特異性、高滴度體外放射分析法放射免疫分析技術(shù)所用抗體質(zhì)量的三種主要指標(biāo)親和力測(cè)定交叉反應(yīng)測(cè)定滴度的檢測(cè)體外放射分析法（1）親和力

（2）交叉反應(yīng)

（3）滴度檢測(cè)：大分子抗原——125I小分子——3H或接一個(gè)大分子蛋白質(zhì)，常用牛血清白蛋白，再125I標(biāo)記125I標(biāo)記：每個(gè)蛋白分子小于1個(gè)125I原子3H標(biāo)記：每個(gè)蛋白分子可1~4個(gè)3H原子2、標(biāo)記抗原：●標(biāo)記率、比活度●放化純●T1/2不能太短：125I59.7天3H●不改變?cè)锌乖匦裕ㄌ禺愋?、親和力、免疫活性等）體外放射分析法3、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)試劑：4、質(zhì)控樣品：

標(biāo)準(zhǔn)品是定量的依據(jù)，要求純度盡量高，配制時(shí)濃度要準(zhǔn)確。

免疫活性與待測(cè)抗原相一致（平行試驗(yàn)）高、中、低三種；

質(zhì)控標(biāo)本為血清，用PBS稀釋，是提純抗原；

用“0”血清稀釋，“0”血清可用混合血清；

用活性炭等處理；體外放射分析法（1）液相分離劑：

a、雙抗體沉淀法；

b、PEG沉淀法；

c、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法；

d、活性炭吸附法：測(cè)上清液

e、微孔濾膜過(guò)濾法

f、其它：如鹽析法、層析法、電泳法等5、分離試劑和材料：體外放射分析法（2）固相分離劑：

材料：如塑料、纖維等，凝膠顆粒等

具備條件：

a、吸附牢固；

b、不影響抗體免疫活性；

c、NSB低；

d、吸附材料的理化性質(zhì)穩(wěn)定；

e、吸附材料價(jià)廉易得；體外放射分析法三、測(cè)定方法1、加樣：

（1）經(jīng)典加樣法；

（2）順序加樣法：

Ab+待測(cè)Ag*Ag

測(cè)小分子抗原可提高靈敏度，但穩(wěn)

定性、重復(fù)性較差

2、孵育：

3、分離結(jié)合與游離部分：

4、測(cè)放射性：

5、數(shù)據(jù)處理：體外放射分析法四、評(píng)估RIA試劑盒的

主要技術(shù)指標(biāo)1、靈敏度：

該試劑盒的最低檢測(cè)值

RIA：0管的結(jié)合率-2SD

IRMA：0管的結(jié)合率+2SD

2、準(zhǔn)確度：

指樣品測(cè)定值偏離真值的程度

回收試驗(yàn)：95~105%體外放射分析法3、精密度：

同一樣品重復(fù)測(cè)定的實(shí)測(cè)劑量的離散程度

CV=SD/均數(shù)×100%

批內(nèi)＜10%；

批間＜15%

ABCV：

一批試驗(yàn)的平均CV（為各樣品CV的平均值體外放射分析法

如兩批樣品的含量一高一低，ABCV就缺乏可比性，就必須作精密度圖：體外放射分析法4、特異性：

主要指抗體的特異性

5、非特異結(jié)合率：

PEG＜10%

雙抗或固相＜5%

6、劑量-反應(yīng)曲線和工作范圍：體外放射分析法改變抗體滴度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線不同區(qū)段斜率（A）及精密度圖（B）的影響體外放射分析法五、RIA的質(zhì)控1、目的：

質(zhì)控是對(duì)分析工作的誤差進(jìn)行經(jīng)常性檢查，遇到有質(zhì)量異常則及時(shí)采取對(duì)策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)（QC）。體外放射分析法2、內(nèi)容：

試驗(yàn)誤差：隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量；

（2）精密度檢驗(yàn)；

（3）整批試驗(yàn)的偏差；

（4）漂移；

（5）批間質(zhì)控；體外放射分析法精密度、偏差和準(zhǔn)確度三者關(guān)系示意圖體外放射分析法Schewart圖Cusum圖體外放射分析法其他放射免疫分析放射受體分析法；

放射競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析法；

放射酶分析法；體外放射分析法免疫放射分析一、基本原理：

免疫放射分析法（IRMA）是用過(guò)量的放射性核素標(biāo)記的抗體（*Ab）和限量的抗原或半抗原（Ag）結(jié)合，形成Ag*Ab、其放射性和所加Ag的量呈正相關(guān)。Ag+*AbAg*Ab

體外放射分析法二、IRMA的特點(diǎn)：1、屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)；

2、抗原抗體復(fù)合物的量與所加非標(biāo)記抗原量呈正相關(guān)；

3、在低劑量區(qū)不會(huì)有不確定因素，靈敏度較高；

4、IRMA的NSB對(duì)低劑量區(qū)影響大；

5、RIA低劑量區(qū)的放射性高，NSB主要影響高劑量區(qū)，IRMA相反，影響低劑量區(qū)；體外放射分析法三、IRMA的試劑：1、標(biāo)記抗體；通常是單克隆抗體。

2、標(biāo)準(zhǔn)品；

3、分離試劑：固相抗體

4、質(zhì)控；體外放射分析法四、IRMA的基本方法：1、雙抗體夾心法：

Ab1——Ag——*Ab2

2、標(biāo)記第三抗體法：

Ab1——Ag——Ab2——*抗Ab2

3、生物素標(biāo)記抗體：

Ab1——Ag——生物素標(biāo)記Ab2——125I標(biāo)記親和素特點(diǎn)：每一抗體分子可以連接幾十個(gè)分子生物素，提高靈敏度。體外放射分析法五、IRMA的實(shí)際應(yīng)用中的特點(diǎn)：1、標(biāo)記物的穩(wěn)定性：標(biāo)記抗體

2、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：

標(biāo)記抗體過(guò)量，反應(yīng)容易達(dá)到平衡

3、分析靈敏度：高體外放射分析法4、可測(cè)量的劑量范圍寬；IRMA和RIA精密度圖的比較5、特異性高；兩個(gè)抗體6、加樣誤差??；關(guān)鍵是Ag體外放射分析法五、IRMA的不足之處：

兩株抗體，針對(duì)不同抗原決定簇，要求被測(cè)抗原至少有12~16個(gè)氨基酸組成有特征性的序列（6~8個(gè)氨基酸決定一個(gè)抗原決定簇）。

主要測(cè)定肽類和蛋白質(zhì)，半抗原不能應(yīng)用。體外放射分析法非放射性標(biāo)記免疫分析優(yōu)點(diǎn)：

1、有些技術(shù)能提高靈敏度和穩(wěn)定性；

2、反應(yīng)迅速，縮短測(cè)定時(shí)間，提高工作效率；

3、能執(zhí)行全自動(dòng)化；

4、減少誤差，提高質(zhì)控水平；

5、有效半衰期較長(zhǎng)；

6、從免疫分析的角度說(shuō)，非放射性與放射性分析技術(shù)的原理是相同的，只是以酶、熒光、發(fā)光等代替125I，最后信號(hào)不是放射線而是其他物理形式。體外放射分析法一、酶標(biāo)記免疫分析法：固相Ab1——Ag——酶標(biāo)記Ab作用于酶底物，產(chǎn)生光吸收物質(zhì)、熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光。體外放射分析法1、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）原理：

在抗體分子上連接酶分子，代替放射性標(biāo)記的抗體，進(jìn)行與IRMA相似的夾心免疫反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，分離結(jié)合、游離部分，取結(jié)合部分，利用酶的催化活性，由結(jié)合部分上的酶將特定的底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，顏色的深淺與酶的量呈正比。體外放射分析法2、酶免疫熒光分析法將酶反應(yīng)的底物改為熒光物質(zhì)→光子激發(fā)→熒光體外放射分析法二、發(fā)光免疫分析法：采用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）酶增強(qiáng)發(fā)光免疫分析（ECLEA）電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）體外放射分析法1、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）原理：

發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記的發(fā)光物質(zhì)通過(guò)氫化反應(yīng)獲得能量，處于激發(fā)態(tài)，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)以光子形式釋放能量，其發(fā)光強(qiáng)度與被測(cè)物質(zhì)濃度相關(guān)。體外放射分析法固相Ab1——待測(cè)Ag——化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記Ab氧化等反應(yīng)——發(fā)生化學(xué)反應(yīng)——光子。發(fā)光物質(zhì)：1、異魯米諾；2、丫啶酯類；3、苯酚類；

4、咪唑類；5、苯基草酸酯類體外放射分析法2、酶增強(qiáng)發(fā)光免疫分析法（ECLEA）原理：

將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為酶的發(fā)光底物，由酶觸發(fā)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)激發(fā)過(guò)程，產(chǎn)生光子。酶：1、辣根過(guò)氧化酶系統(tǒng)；

2、堿性磷酸酶系統(tǒng)；體外放射分析法以DPC公司為例：AMPPD中間體減去一個(gè)磷酸基裂解金剛烷酮間氧苯酯陰離子（激發(fā)態(tài)）基態(tài)光子體外放射分析法3、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLIA）原理：是一種在電極表面由電化學(xué)引起的發(fā)光反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕+三丙胺（TPA）電場(chǎng)陽(yáng)極面氧化反應(yīng)（失去一個(gè)電子）TPA氧化成陽(yáng)離子自由基，失去一個(gè)質(zhì)子，形成一種強(qiáng)還原劑三價(jià)三聯(lián)吡啶釕二價(jià)（強(qiáng)氧化劑）激發(fā)態(tài)光子*三聯(lián)吡啶釕無(wú)消耗，僅消耗TPA體外放射分析法三、熒光免疫分析法：

該反應(yīng)系統(tǒng)不使用酶，而用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行分析。1、熒光偏振分析技術(shù)（FPIA）；2、時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TrFIA）；銪（Eu）標(biāo)記抗體+待測(cè)Ag——形成復(fù)合物酸性條件下Euˉ熒光弱信號(hào)增強(qiáng)液β-二酮體新的螯合物持續(xù)且強(qiáng)的熒光信號(hào)在此反應(yīng)中，自然本底熒光衰變4~10ns，而Eu3+的熒光衰變?yōu)?.3×105ns體外放射分析法RIA與化學(xué)發(fā)光的比較RIA存在以下不足：1、標(biāo)記物的穩(wěn)定性；2、反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；3、放射性計(jì)數(shù)有自身漲落；4、人工操作存在誤差；5、不能進(jìn)行全自動(dòng)化操作；6、藥盒有效期短；化學(xué)發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)：1、非放射性分析；2、靈敏度高；3、穩(wěn)定性好；4、檢測(cè)速度快；5、全自動(dòng)化；6、半衰期長(zhǎng)；體外放射分析法受體放射配基結(jié)合分析一、基本原理：

用放射性核素標(biāo)記配基與相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合，測(cè)定復(fù)合物的放射性活度，從而對(duì)受體進(jìn)行定性和定量。R+LRLK1,v1K2,v2R為游離受體；L為游離配基的濃度RL為復(fù)合物濃度K1為結(jié)合速率常數(shù)，k2為解離速率常數(shù)體外放射分析法1、飽和曲線：2、競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線：

若受體和放射性配基的結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中另加入該受體的非標(biāo)記配基，則后者會(huì)與放射性配基競(jìng)爭(zhēng)受體體外放射分析法一、基本條件：1、受體標(biāo)本：

（1）分離亞細(xì)胞組分；（2）完整的活細(xì)胞；（3）組織切片；2、標(biāo)記配基：

（1）高比活度；（2）高親和力；（3）高特異性；（4）高放化純度；體外放射分析法3、非標(biāo)記配基：

（1）測(cè)NSB；（2）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)中作為競(jìng)爭(zhēng)劑；4、結(jié)合反應(yīng)類型：

（1）多點(diǎn)飽和曲線；（2）單點(diǎn)法；5、反應(yīng)的環(huán)境條件：（1）PH、Buffer；（2）溫育溫度和時(shí)間；（3）反應(yīng)體積；6、分離結(jié)合和游離部分：體外放射分析法臨床意義：1、內(nèi)分泌系統(tǒng)：

（1）甲狀腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TMAb、TPOAb、Tg、TRAb；（2）糖尿?。阂雀咛撬?、胰島素、C肽、生長(zhǎng)抑素、IAb、IcAb、GAD；（3）腎上腺：皮質(zhì)醇、ACTH；（4）生殖系統(tǒng)：FSH、LH、T、P、E2、PRL、HCG、β-HCG；2、垂體系統(tǒng)：

ACTH、TSH、LH、FSH、PRL、HGH、ADH、……體外放射分析