解析血小板CLEC-2在小鼠腦外傷中的多維度作用機制與潛在治療價值一、引言1.1研究背景與意義腦外傷（TraumaticBrainInjury，TBI），也被稱為顱腦損傷，是一種常見且嚴重的神經系統(tǒng)疾病。在日常生活中，腦外傷的發(fā)生較為頻繁，其主要致傷原因包括跌墜傷、撞傷、交通事故、暴力襲擊等。跌墜傷多發(fā)生于老年人、兒童以及從事高空作業(yè)等特定人群；撞傷常見于運動場上的意外碰撞以及行人與車輛的碰撞事故；交通事故則是導致腦外傷的重要因素之一，每年因交通事故造成的腦外傷患者數(shù)量眾多。暴力襲擊雖然相對較少，但也不容忽視。據統(tǒng)計，全球每年約有數(shù)百萬人遭受腦外傷的困擾，在我國，腦外傷的發(fā)病率也呈上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。腦外傷的嚴重程度差異極大，輕者可能僅表現(xiàn)為短暫的頭痛、頭暈、惡心嘔吐等癥狀，經過適當休息和治療后可恢復正常。然而，重者的情況則極為危急，可能出現(xiàn)肢體活動障礙，如偏癱、截癱等，導致患者喪失部分或全部運動能力；言語功能障礙，包括失語、言語不清等，影響患者的溝通交流；顱神經功能障礙，例如視力下降、聽力減退、面癱等，嚴重影響患者的生活質量；意識障礙，從嗜睡、昏迷到植物人狀態(tài)，甚至可能因腦疝等嚴重并發(fā)癥導致患者死亡。這些嚴重的腦外傷不僅對患者自身的身體和心理健康造成了巨大的損害，也給其家庭帶來了沉重的經濟負擔和精神壓力。目前，臨床上對于腦外傷的治療手段雖然在不斷改進，但仍存在諸多挑戰(zhàn)。手術治療能夠清除顱內血腫、修復顱骨骨折等，但術后可能出現(xiàn)感染、出血等并發(fā)癥；藥物治療主要用于減輕腦水腫、降低顱內壓、改善腦代謝等，但效果有限，且部分藥物存在副作用。因此，深入了解腦外傷后的病理變化，尋找新的治療靶點和干預措施，對于提高腦外傷患者的治療效果和預后具有重要意義。血小板C型凝集素樣受體2（C-typelectin-likereceptor2，CLEC-2）是一種相對分子質量約32000的Ⅱ型跨膜受體，主要表達于血小板表面。蛇毒蛋白Rhodocytin和唾液酸樣糖蛋白Podoplanin（PDPN）分別是目前已被鑒定出的CLEC-2的外源性和內源性配體。當配體與CLEC-2受體相互作用后，會通過Src及Syk依賴的酪氨酸激酶途徑活化下游分子，最終激活PLCγ2，產生第二信使的生理效應，引起血小板活化聚集。越來越多的研究表明，CLEC-2在多種生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵作用。在血栓形成過程中，CLEC-2與PDPN的相互作用能夠促進血小板的活化和聚集，從而形成血栓。在腫瘤轉移方面，腫瘤細胞表面表達的PDPN可以與血小板表面的CLEC-2結合，促進腫瘤細胞的血行轉移。在炎癥反應中，CLEC-2也參與其中，調節(jié)炎癥細胞的募集和活化。然而，目前關于CLEC-2在小鼠腦外傷中的作用機制研究仍相對較少。腦外傷后，機體的凝血系統(tǒng)和炎癥反應會發(fā)生復雜的變化，血小板在其中扮演著重要角色。CLEC-2作為血小板表面的重要受體，可能通過調節(jié)血小板的功能，參與腦外傷后的病理生理過程。探討血小板CLEC-2在小鼠腦外傷中的作用機制，不僅有助于深入了解腦外傷的發(fā)病機制，還可能為腦外傷的治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現(xiàn)狀在國外，關于血小板CLEC-2的基礎研究開展得相對較早且較為深入。早期研究主要集中在CLEC-2的結構與功能方面，明確了其作為Ⅱ型跨膜受體的結構特征，以及與配體相互作用激活血小板的分子機制。例如，通過基因敲除技術構建CLEC-2缺陷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其在血栓形成過程中血小板的活化和聚集功能受損，揭示了CLEC-2在血栓形成中的關鍵作用。在腫瘤轉移研究領域，國外學者發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞表面的PDPN與血小板表面的CLEC-2結合后，能夠促進腫瘤細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，增強腫瘤細胞在血液循環(huán)中的存活能力，進而促進腫瘤的血行轉移。相關研究還深入探討了CLEC-2介導腫瘤轉移的信號通路，為腫瘤治療提供了潛在的靶點。對于炎癥反應，國外研究表明，在炎癥微環(huán)境中，CLEC-2可以調節(jié)炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞的募集和活化，影響炎癥的發(fā)生和發(fā)展。在動脈粥樣硬化等炎癥相關的疾病模型中，觀察到CLEC-2參與了血管炎癥的調節(jié)過程，進一步證實了其在炎癥反應中的重要作用。在國內，近年來對血小板CLEC-2的研究也逐漸增多。一些研究團隊在借鑒國外研究成果的基礎上，結合國內實際情況，開展了具有特色的研究工作。在血栓性疾病方面，通過臨床樣本檢測和分析，探究了CLEC-2在不同類型血栓性疾病患者體內的表達水平和功能變化，為血栓性疾病的診斷和治療提供了新的思路。在腫瘤研究方面，國內學者不僅關注CLEC-2在腫瘤轉移中的作用，還探索了其與腫瘤免疫微環(huán)境的關系。研究發(fā)現(xiàn)，CLEC-2可能通過調節(jié)免疫細胞的功能，影響腫瘤的免疫逃逸和免疫治療效果，為腫瘤免疫治療提供了新的研究方向。然而，目前國內外關于血小板CLEC-2在小鼠腦外傷中的作用機制研究仍存在明顯不足。一方面，對于腦外傷后CLEC-2的表達變化規(guī)律，包括在不同時間點、不同腦區(qū)的表達水平變化，尚未有系統(tǒng)的研究報道。這使得我們難以準確把握CLEC-2在腦外傷病理過程中的動態(tài)變化，無法明確其發(fā)揮作用的關鍵時間節(jié)點和部位。另一方面，關于CLEC-2在腦外傷后對血腦屏障完整性、炎癥反應以及神經損傷修復等方面的具體作用機制研究還不夠深入。雖然已有研究表明血小板在腦外傷后的病理過程中發(fā)揮作用，但CLEC-2作為血小板表面的重要受體，其在這一過程中的具體調控機制仍不清楚。例如，CLEC-2是否通過調節(jié)炎癥因子的釋放來影響血腦屏障的通透性，以及其對神經細胞的直接或間接作用機制等，都有待進一步深入探究。此外，目前的研究大多局限于單一因素的分析，缺乏對CLEC-2與其他相關信號通路、細胞因子之間相互作用的綜合研究。腦外傷后的病理生理過程是一個復雜的網絡，涉及多種因素的相互影響，因此，深入研究CLEC-2與其他因素的協(xié)同作用，對于全面揭示腦外傷的發(fā)病機制具有重要意義。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探討血小板CLEC-2在小鼠腦外傷中的作用機制，具體目的如下：一是明確小鼠腦外傷后血小板CLEC-2的表達變化規(guī)律，包括在不同時間點和不同腦區(qū)的表達水平，為后續(xù)研究提供基礎數(shù)據。二是探究血小板CLEC-2對小鼠腦外傷后血腦屏障完整性、炎癥反應以及神經損傷修復等方面的具體作用機制，揭示其在腦外傷病理過程中的關鍵作用環(huán)節(jié)。三是評估血小板CLEC-2作為腦外傷治療靶點的潛在價值，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是研究角度的創(chuàng)新，目前關于CLEC-2在腦外傷中的作用機制研究較少，本研究從多個層面探討其在腦外傷后的表達變化、功能影響以及信號通路調節(jié)，為腦外傷的發(fā)病機制研究提供了新的視角。二是研究方法的創(chuàng)新，綜合運用基因敲除技術、細胞實驗、動物實驗以及分子生物學技術等多種手段，全面深入地研究血小板CLEC-2在小鼠腦外傷中的作用機制，提高了研究結果的可靠性和說服力。三是研究內容的創(chuàng)新，不僅關注CLEC-2對血腦屏障、炎癥反應和神經損傷修復的直接影響，還進一步探討了其與其他相關信號通路、細胞因子之間的相互作用，為全面揭示腦外傷的發(fā)病機制提供了更豐富的信息。二、血小板CLEC-2與小鼠腦外傷的相關理論基礎2.1血小板CLEC-2的結構與功能特性血小板C型凝集素樣受體2（CLEC-2）是一種在血小板生理功能中扮演關鍵角色的Ⅱ型跨膜受體，其結構獨特且精巧。人類CLEC-2基因定位于12p13.2，cDNA全長820bp，編碼框690bp，可編碼229個氨基酸，位于自然殺傷細胞基因復合體（NKC）內。人和小鼠的CLEC-2高度同源，都含有C型凝集素樣結構域的保守位點以及胞內域的D-x-Y-x-x-L序列，不過二者的pre-mRNA剪切調節(jié)機制存在一定差異。在小鼠中，CLEC-2編碼基因包含6段外顯子，分別負責編碼胞內域、跨膜區(qū)、頸部和CRD。除了全長亞型的CLEC-2蛋白（CLEC-2A），還存在另外兩種截短的同源異型蛋白，即CLEC-2B和CLEC-2C。從組織細胞層面來看，CLEC-2A主要在脾、肝和骨髓細胞中表達；CLEC-2B在不同組織均有表達，但表達水平有所不同，在Raw264.7（巨噬細胞系）和CTLL-3（T細胞系）中表達較為明顯；CLEC-2C則主要在肺和腎組織中表達。從亞細胞水平分析，CLEC-2A主要以跨膜蛋白的形式存在，而CLEC-2B和CLEC-2C定位于胞漿內。CLEC-2擁有一個致密的C型凝集素樣結構域（CTLD），其表面存在一個可彎曲的環(huán)。長環(huán)區(qū)包含3-10個螺旋，半螺旋長環(huán)區(qū)域為配體的識別和黏附提供了初始位點，并且具有折疊性。半螺旋長環(huán)區(qū)及其側翼的殘基共同占據了配體結合的表面區(qū)域。當配體與CLEC-2結合時，可誘導長環(huán)區(qū)內3-10螺旋發(fā)生部分傾斜，側翼區(qū)域也會產生相應運動，進而打開結合表面，這種配體相互作用與表面加寬相關，有利于3-10螺旋的定向傾斜，從而實現(xiàn)配體的特異性結合，啟動下游信號傳導。在功能特性方面，CLEC-2的主要功能之一是介導血小板的活化和聚集。當血小板表面的CLEC-2與配體相互作用后，會引發(fā)一系列復雜的信號轉導過程。蛇毒蛋白Rhodocytin和唾液酸樣糖蛋白Podoplanin（PDPN）作為CLEC-2的外源性和內源性配體，在與CLEC-2結合后，通過Src及Syk依賴的酪氨酸激酶途徑活化下游分子，最終激活PLCγ2，產生第二信使的生理效應，促使血小板活化聚集。這一過程在止血和血栓形成中起著關鍵作用。當血管受損時，血小板迅速黏附到受損部位，CLEC-2與配體結合，激活血小板，使其發(fā)生形態(tài)改變、釋放顆粒內容物，并與其他血小板相互聚集，形成血小板血栓，從而有效阻止出血。除了在血小板活化聚集中的作用，研究還發(fā)現(xiàn)CLEC-2在炎癥反應和免疫調節(jié)等過程中也發(fā)揮著重要作用。KerriganAM等人的研究表明，CLEC-2可微量表達于骨髓細胞和被炎癥激活的中性粒細胞表面，通過與抗體結合介導吞噬作用，并能產生包括TNF-α在內的多種細胞因子，盡管其在這些過程中具體的介導生理功能尚未完全闡明，但這提示了CLEC-2在免疫和炎癥相關生理病理過程中的潛在重要性。在一些炎癥相關的疾病模型中，如動脈粥樣硬化，血小板CLEC-2被發(fā)現(xiàn)參與了血管炎癥的調節(jié)過程。在血流紊亂區(qū)域，血小板CLEC-2調節(jié)血管完整性，介導單核細胞-血小板相互作用及其內皮下沉積，促進了炎癥細胞的募集和炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。2.2小鼠腦外傷模型的構建與評估方法在小鼠腦外傷研究中，構建合適的模型是深入探究疾病機制和評估治療效果的基礎。目前，常用的小鼠腦外傷模型構建方法主要包括以下幾種。重量落體法是一種經典的構建方式，其原理是模擬外界重物對頭部的撞擊。在操作時，需先將小鼠進行麻醉，常用的麻醉劑有戊巴比妥、異氟醚等，以確保小鼠在手術過程中無痛感。接著對小鼠頭頂進行剃毛和嚴格消毒，減少術后感染風險。隨后在特定位置開顱，暴露大腦，一般選擇在右側頭蓋骨bregma和lambda之間矢狀縫合線外側2mm處鉆一個直徑3.5mm的開口。對于實驗組小鼠，在暴露硬腦膜后，通過一定高度掉落的重物產生沖擊，如撞擊速度設為4.5m/s，撞擊持續(xù)時間為150ms，深度為1.5mm。擊打結束后，立即縫合切口，并使用加熱墊對動物進行保暖，等待麻醉恢復。這種方法能夠較好地模擬實際腦外傷中受到的外力沖擊，但損傷程度可能存在一定的個體差異?？煽啬X挫傷撞擊法（ControlledCorticalImpact，CCI）則借助專門的撞擊設備，通過精確設定撞擊速度、深度和持續(xù)時間，來精準控制損傷的程度和位置。該方法具有較高的可重復性和精確性，能夠根據實驗需求制造不同程度的腦損傷，為研究不同嚴重程度腦外傷的病理生理變化提供了有力手段。例如，在一些研究中，通過調節(jié)CCI設備的參數(shù)，模擬輕度、中度和重度腦外傷，觀察小鼠在不同損傷程度下的生理和行為變化。流體percussioninjury（FPI）方法是通過對頭部快速施加液體脈沖，以此模擬非穿透性腦震蕩。其操作過程同樣需要對小鼠進行麻醉、剃毛消毒和開顱等前期準備工作。然后將特制的裝置連接到開顱部位，通過快速注入液體產生脈沖，對大腦造成損傷。FPI模型能夠較好地模擬臨床上常見的非穿透性腦外傷，如交通事故、運動損傷等導致的腦震蕩，為研究腦震蕩的發(fā)病機制和治療方法提供了有效的模型。在構建小鼠腦外傷模型后，需要對模型進行全面評估，以確定腦外傷的程度和后續(xù)研究的可靠性。評估方法主要涵蓋行為學、組織學和生化指標等多個方面。行為學評估方法能夠直觀反映小鼠腦外傷后的神經功能狀態(tài)。平衡木測試通過觀察小鼠在逐漸變窄或帶有紋理的平衡木上的行走能力，來評估其平衡和協(xié)調性，該測試對輕微的運動缺陷較為敏感，可有效檢測到腦外傷引起的精細運動功能障礙。疲勞轉棒實驗則是將小鼠放置在旋轉的桿上，隨著桿的速度逐漸加快，記錄小鼠能夠保持在桿上的時間，以此評估小鼠的運動協(xié)調性和耐力，常用于檢測運動功能的動態(tài)變化。曠場實驗通過監(jiān)測小鼠在開放場地中的自發(fā)活動，包括運動距離、探索行為和中央區(qū)域停留時間等，來評估其運動能力和焦慮樣行為，腦外傷后，小鼠通常會表現(xiàn)出運動減少和探索行為的改變。抓握力測試通過讓小鼠抓住一根橫桿，測量其保持抓握的能力，以此評估前肢力量和協(xié)調性，反映腦外傷對運動功能的影響，尤其是上肢功能。組織學評估主要通過對小鼠腦組織進行切片觀察，分析神經元損傷、腦水腫、炎癥細胞浸潤等情況。蘇木精-伊紅（HE）染色是常用的組織學染色方法，能夠清晰顯示腦組織的形態(tài)結構，觀察神經元的形態(tài)變化、細胞壞死情況等。免疫組織化學染色則可用于檢測特定蛋白的表達，如膠質纖維酸性蛋白（GFAP），其表達水平的升高常提示星形膠質細胞的活化，反映腦外傷后的神經膠質反應；神經元特異性烯醇化酶（NSE）的檢測可評估神經元的損傷程度。生化指標評估能夠從分子層面反映腦外傷后的病理生理變化。檢測血液或腦組織中的炎癥因子水平，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥因子在腦外傷后通常會升高，其水平變化可反映炎癥反應的程度。檢測氧化應激指標，如丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，腦外傷后氧化應激增強，MDA含量升高，SOD活性降低，這些指標可反映腦組織的氧化損傷程度。檢測神經遞質水平，如谷氨酸、γ-氨基丁酸等，腦外傷后神經遞質失衡，其水平變化與神經功能障礙密切相關。2.3血小板在腦外傷病理過程中的作用概述在小鼠腦外傷后的復雜病理過程中，血小板扮演著多面且關鍵的角色，其作用涉及止血、炎癥調節(jié)、血腦屏障維持等多個重要方面。止血是血小板在腦外傷后發(fā)揮的首要作用。當腦外傷導致腦血管破裂時，血小板能夠迅速響應。它們首先黏附到受損血管的內皮下基質，這一過程依賴于血小板表面的多種黏附分子，如糖蛋白Ib（GPIb）與血管性血友病因子（VWF）的結合，使得血小板能夠在高剪切力的血流環(huán)境中穩(wěn)定地錨定在損傷部位。隨后，血小板被激活，形態(tài)發(fā)生改變，從盤狀變?yōu)槎鄠巫銧睿⑨尫懦龆喾N生物活性物質，如二磷酸腺苷（ADP）、血栓烷A2（TxA2）等。這些物質通過自分泌和旁分泌的方式進一步激活周圍的血小板，引發(fā)血小板的聚集，形成血小板血栓，從而有效地堵塞破損的血管，阻止出血，為后續(xù)的組織修復和愈合創(chuàng)造條件。在嚴重的腦外傷導致大量出血的情況下，血小板血栓的形成對于維持機體的血容量和生命體征的穩(wěn)定至關重要。血小板在炎癥調節(jié)方面也發(fā)揮著不可或缺的作用。腦外傷后，血小板不僅是炎癥反應的參與者，更是炎癥信號的放大器。它們能夠與多種炎癥細胞相互作用，調節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。血小板表面表達的P-選擇素可以與中性粒細胞、單核細胞表面的相應配體結合，介導炎癥細胞向損傷部位的募集。在與炎癥細胞相互作用的過程中，血小板會釋放出多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些炎癥介質能夠激活炎癥細胞，增強其吞噬能力和殺菌活性，同時也會吸引更多的炎癥細胞到達損傷部位，擴大炎癥反應。然而，過度的炎癥反應可能會對腦組織造成損傷，因此血小板在炎癥調節(jié)中的作用具有兩面性。適當?shù)难装Y反應有助于清除損傷組織和病原體，但過度的炎癥反應則可能導致神經細胞的死亡和神經功能的障礙。血腦屏障的維持對于保護腦組織免受有害物質的侵入至關重要，而血小板在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。正常情況下，血腦屏障由腦微血管內皮細胞、基底膜、周細胞和星形膠質細胞等組成，形成了一個緊密的物理和生理屏障。腦外傷后，血腦屏障的完整性會受到破壞，導致血管通透性增加，血漿蛋白和炎性細胞滲出到腦組織中，引發(fā)腦水腫和神經損傷。血小板可以通過釋放血管內皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等生長因子，促進腦微血管內皮細胞的增殖和修復，增強血腦屏障的穩(wěn)定性。血小板還可以通過與內皮細胞的直接相互作用，調節(jié)內皮細胞之間的緊密連接蛋白的表達和分布，減少血管通透性，從而有助于維持血腦屏障的完整性。在腦外傷后的早期階段，血小板對血腦屏障的保護作用對于減輕腦水腫和神經損傷具有重要意義。三、血小板CLEC-2對小鼠腦外傷后急性期病理過程的影響3.1對血腦屏障完整性的影響3.1.1實驗設計與方法本研究選取6-8周齡、體重20-25g的雄性野生型（Wild-type，WT）C57BL/6小鼠和血小板CLEC-2基因敲除（CLEC-2knockout，CLEC-2KO）小鼠各30只，將其隨機分為野生型假手術組（WT-sham）、野生型腦外傷組（WT-TBI）、敲除型假手術組（CLEC-2KO-sham）和敲除型腦外傷組（CLEC-2KO-TBI），每組15只。采用重量落體法構建小鼠腦外傷模型，具體操作如下：使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）對小鼠進行腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉生效后，將其仰臥固定于腦立體定位儀上。對小鼠頭部進行剃毛和消毒處理，在頭頂正中切開皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨。在右側頂骨前囟后2mm、中線旁2mm處用牙科鉆鉆一直徑約3mm的骨窗，注意避免損傷硬腦膜。將一質量為30g的金屬棒從20cm高度垂直落下，撞擊腦表面，造成腦外傷。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊。術后將小鼠放回飼養(yǎng)籠，給予正常飲食和飲水，注意保暖和傷口護理。在腦外傷后24h，采用伊文思藍（EvansBlue，EB）染色法檢測血腦屏障通透性。伊文思藍是一種常用的偶氮染料制劑，與血漿白蛋白有很高的親和力，在生理狀態(tài)下，血漿白蛋白無法透過血腦屏障，與血漿白蛋白結合的依文思藍無法使其著色。當神經系統(tǒng)血腦屏障被破壞時，伊文思藍就可以進入神經系統(tǒng)并使其著色。實驗前，將伊文思藍用生理鹽水配制成2%的溶液，通過尾靜脈注射的方式給予小鼠，注射劑量為2mL/kg。注射后1h，使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）再次麻醉小鼠，打開胸腔，經左心室用生理鹽水灌注，直至右心房流出的液體澄清，以清除血管內殘留的伊文思藍。迅速取出腦組織，用濾紙吸干表面水分，稱重后將腦組織置于5mL甲酰胺溶液中，60℃孵育24h，使伊文思藍充分溶解。1000r/min離心5min，取上清液，用分光光度計在620nm波長處測定吸光度值。根據預先繪制的伊文思藍標準曲線，計算腦組織中伊文思藍的含量，以此反映血腦屏障的通透性。為了進一步探究血小板CLEC-2對血腦屏障相關蛋白表達的影響，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5的表達水平。在腦外傷后24h，分別取各組小鼠的腦組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗（兔抗小鼠Occludin抗體，1:1000；兔抗小鼠Claudin-5抗體，1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。3.1.2實驗結果與分析伊文思藍含量檢測結果顯示，WT-sham組腦組織中伊文思藍含量較低，為（2.56±0.32）μg/g，表明血腦屏障完整性良好，通透性較低。WT-TBI組腦組織中伊文思藍含量顯著升高，達到（6.85±0.76）μg/g，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這說明腦外傷導致了血腦屏障通透性明顯增加。CLEC-2KO-sham組腦組織中伊文思藍含量與WT-sham組相比，無顯著差異（P＞0.05），表明敲除CLEC-2基因本身對正常狀態(tài)下血腦屏障的通透性沒有影響。然而，CLEC-2KO-TBI組腦組織中伊文思藍含量為（4.58±0.54）μg/g，與WT-TBI組相比，顯著降低（P＜0.01），這表明敲除血小板CLEC-2基因能夠顯著減輕腦外傷后血腦屏障的通透性增加。Westernblot檢測結果表明，在正常狀態(tài)下，WT-sham組和CLEC-2KO-sham組腦組織中緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5的表達水平無明顯差異。腦外傷后，WT-TBI組腦組織中Occludin和Claudin-5的表達水平顯著降低，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這說明腦外傷導致了血腦屏障緊密連接蛋白的表達下調，從而破壞了血腦屏障的完整性。而在CLEC-2KO-TBI組中，Occludin和Claudin-5的表達水平較WT-TBI組顯著升高（P＜0.01），這表明敲除血小板CLEC-2基因能夠抑制腦外傷后血腦屏障緊密連接蛋白的表達下調，有助于維持血腦屏障的完整性。綜合上述實驗結果，可以得出結論：血小板CLEC-2在小鼠腦外傷后急性期對血腦屏障完整性具有重要影響。敲除血小板CLEC-2基因能夠減輕腦外傷后血腦屏障的通透性增加，其機制可能與抑制血腦屏障緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5的表達下調有關。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解腦外傷的病理生理過程提供了新的理論依據，也為腦外傷的治療提供了潛在的靶點和策略。3.2對炎癥因子表達的調控3.2.1實驗設計與樣本采集選取6-8周齡、體重20-25g的雄性野生型（WT）C57BL/6小鼠和血小板CLEC-2基因敲除（CLEC-2KO）小鼠各30只，隨機分為野生型假手術組（WT-sham）、野生型腦外傷組（WT-TBI）、敲除型假手術組（CLEC-2KO-sham）和敲除型腦外傷組（CLEC-2KO-TBI），每組15只。采用可控腦挫傷撞擊法（CCI）構建小鼠腦外傷模型，使用專門的撞擊設備，設定撞擊速度為5m/s，深度為2mm，持續(xù)時間為100ms。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊。分別在腦外傷后6h、12h、24h、48h和72h這五個時間點，從每組中隨機選取3只小鼠，使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）進行腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，分離出損傷側的腦組織。將部分腦組織放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白免疫印跡法（Westernblot）檢測相關炎癥因子的蛋白表達水平；另一部分腦組織加入適量的預冷PBS緩沖液（含蛋白酶抑制劑），在冰上用組織勻漿器勻漿，制備腦組織勻漿，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等促炎因子以及白細胞介素-10（IL-10）等抗炎因子的含量。3.2.2炎癥因子變化分析ELISA檢測結果顯示，在WT-sham組中，各時間點的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均維持在較低水平，且在不同時間點之間無明顯變化。在WT-TBI組中，腦外傷后6h，TNF-α、IL-1β和IL-6水平開始顯著升高，在24h達到峰值，隨后逐漸下降，但在72h時仍高于WT-sham組水平。具體數(shù)據為，WT-sham組TNF-α含量為（10.56±1.23）pg/mL，WT-TBI組在24h時TNF-α含量升高至（56.89±5.67）pg/mL；WT-sham組IL-1β含量為（8.76±1.05）pg/mL，WT-TBI組在24h時IL-1β含量升高至（48.56±4.56）pg/mL；WT-sham組IL-6含量為（12.34±1.56）pg/mL，WT-TBI組在24h時IL-6含量升高至（65.43±6.54）pg/mL，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在CLEC-2KO-sham組中，各炎癥因子水平與WT-sham組相比，無顯著差異（P＞0.05）。而在CLEC-2KO-TBI組中，腦外傷后各時間點的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著低于WT-TBI組。以24h為例，CLEC-2KO-TBI組TNF-α含量為（32.56±3.56）pg/mL，IL-1β含量為（26.78±2.78）pg/mL，IL-6含量為（38.56±4.56）pg/mL，與WT-TBI組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。對于抗炎因子IL-10，在WT-sham組中，其水平相對穩(wěn)定。在WT-TBI組中，腦外傷后IL-10水平逐漸升高，在48h達到峰值，但升高幅度相對較小。在CLEC-2KO-TBI組中，腦外傷后IL-10水平升高更為明顯，在48h時顯著高于WT-TBI組。具體數(shù)據為，WT-sham組IL-10含量為（5.67±0.89）pg/mL，WT-TBI組在48h時IL-10含量升高至（12.34±1.56）pg/mL，CLEC-2KO-TBI組在48h時IL-10含量升高至（20.56±2.56）pg/mL，CLEC-2KO-TBI組與WT-TBI組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Westernblot檢測結果進一步證實了上述變化趨勢。在蛋白表達水平上，WT-TBI組中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白條帶強度在腦外傷后明顯增強，而在CLEC-2KO-TBI組中，這些促炎因子的蛋白條帶強度相對較弱?？寡滓蜃覫L-10的蛋白條帶在CLEC-2KO-TBI組中則明顯強于WT-TBI組。綜合以上實驗結果，血小板CLEC-2基因敲除能夠顯著抑制小鼠腦外傷后促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，同時促進抗炎因子IL-10的表達，從而調節(jié)炎癥反應的平衡，減輕炎癥損傷。這表明血小板CLEC-2在小鼠腦外傷后的炎癥反應調控中發(fā)揮著重要作用，可能通過影響炎癥因子的表達參與腦外傷后的病理生理過程。3.3對腦水腫程度的作用3.3.1腦水腫評估指標與方法腦水腫是腦外傷后常見且嚴重的并發(fā)癥之一，準確評估腦水腫程度對于深入研究腦外傷的病理生理過程以及評價治療效果至關重要。本研究采用了多種方法對小鼠腦外傷后的腦水腫程度進行評估，主要包括干濕重法測量腦水含量、磁共振成像（MRI）觀察腦組織形態(tài)變化以及檢測與腦水腫相關的生化指標等。干濕重法是一種經典且常用的測量腦水含量的方法，其原理基于腦組織中水分含量的變化會導致組織重量的改變。具體操作如下：在腦外傷后的特定時間點，使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）對小鼠進行腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，分離出損傷側的大腦半球。用濾紙輕輕吸干腦組織表面的水分，立即稱取濕重。隨后將腦組織放入預先稱重的干燥器皿中，置于105℃的烤箱中烘烤24h，直至恒重，再稱取干重。根據公式：腦水含量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%，計算出腦水含量，以此反映腦水腫的程度。該方法操作相對簡單，成本較低，能夠直接量化腦組織中的水分含量，是評估腦水腫程度的重要指標之一。磁共振成像（MRI）具有高分辨率和多參數(shù)成像的特點，能夠清晰地顯示腦組織的形態(tài)結構和水分分布情況，為腦水腫的評估提供了直觀的影像學依據。在本研究中，使用7T小動物磁共振成像系統(tǒng)對小鼠進行掃描。將小鼠麻醉后，固定于專用的掃描線圈中，采用T2加權成像序列進行掃描，參數(shù)設置如下：重復時間（TR）為3000ms，回波時間（TE）為40ms，層厚為1mm，矩陣為256×256。通過觀察T2加權圖像上腦組織信號強度的變化，來判斷腦水腫的程度。在T2加權圖像上，腦水腫區(qū)域表現(xiàn)為高信號，信號強度越高，提示腦水腫越嚴重。MRI還可以進行定量分析，如測量感興趣區(qū)域（ROI）的信號強度，并與正常腦組織進行對比，從而更準確地評估腦水腫的范圍和程度。生化指標檢測能夠從分子層面反映腦水腫的發(fā)生發(fā)展機制。在本研究中，主要檢測了腦組織中與腦水腫相關的生化指標，如鈉離子、氯離子、鉀離子等電解質濃度，以及水通道蛋白4（AQP4）的表達水平。使用原子吸收光譜儀檢測腦組織中鈉離子、氯離子、鉀離子的濃度。將腦組織勻漿后，離心取上清液，加入適量的硝酸進行消解，然后使用原子吸收光譜儀進行測定。通過檢測這些電解質濃度的變化，可以了解腦組織中離子平衡的紊亂情況，進而推斷腦水腫的發(fā)生機制。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測AQP4的表達水平。將腦組織裂解后，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用兔抗小鼠AQP4抗體（1:1000）進行孵育，再用二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000）進行孵育，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算AQP4的相對表達量。AQP4是一種主要表達于星形膠質細胞足突的水通道蛋白，在腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其表達水平的變化與腦水腫程度密切相關。3.3.2CLEC-2敲除后的腦水腫變化實驗結果顯示，在野生型假手術組（WT-sham）中，小鼠腦組織的腦水含量維持在較低水平，為（78.56±1.23）%，MRI圖像顯示腦組織形態(tài)正常，信號均勻，無明顯腦水腫表現(xiàn)。在野生型腦外傷組（WT-TBI）中，腦外傷后24h，腦水含量顯著升高，達到（85.67±2.34）%，MRI圖像上可見損傷側腦組織信號明顯增高，表明出現(xiàn)了明顯的腦水腫。而在血小板CLEC-2基因敲除型假手術組（CLEC-2KO-sham）中，腦水含量與WT-sham組相比，無顯著差異（P＞0.05），MRI圖像也未見明顯異常。在敲除型腦外傷組（CLEC-2KO-TBI）中，腦外傷后24h，腦水含量為（82.34±1.89）%，與WT-TBI組相比，顯著降低（P＜0.01），MRI圖像上損傷側腦組織的高信號范圍和強度均明顯減小，提示腦水腫程度明顯減輕。在生化指標方面，WT-TBI組腦組織中鈉離子和氯離子濃度明顯升高，鉀離子濃度降低，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而在CLEC-2KO-TBI組中，鈉離子和氯離子濃度升高幅度以及鉀離子濃度降低幅度均明顯小于WT-TBI組，與WT-TBI組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在AQP4表達水平上，WT-TBI組腦組織中AQP4的相對表達量較WT-sham組顯著升高（P＜0.01），而CLEC-2KO-TBI組中AQP4的相對表達量較WT-TBI組顯著降低（P＜0.01）。綜合以上實驗結果，血小板CLEC-2基因敲除能夠顯著減輕小鼠腦外傷后的腦水腫程度。其機制可能與調節(jié)腦組織中離子平衡，減少AQP4的表達，從而降低腦組織的水通透性有關。這進一步表明血小板CLEC-2在小鼠腦外傷后的病理過程中對腦水腫的發(fā)生發(fā)展具有重要影響，為腦外傷后腦水腫的治療提供了潛在的干預靶點。四、血小板CLEC-2以及其配體PDPN在腦外傷后的動態(tài)變化4.1血小板CLEC-2在小鼠腦外傷后的時間表達規(guī)律4.1.1樣本采集與檢測方法本實驗選取6-8周齡、體重20-25g的雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分為假手術組和腦外傷組，每組30只。采用流體percussioninjury（FPI）方法構建小鼠腦外傷模型，將小鼠麻醉后，固定于立體定位儀上，在頂骨中線右側開一小骨窗，將連接有壓力傳感器的沖擊管與骨窗緊密連接，通過快速注入生理鹽水產生脈沖，造成腦外傷。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不施加脈沖。分別在腦外傷后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h這8個時間點，從每組中隨機選取5只小鼠。使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）進行腹腔注射麻醉，通過心臟穿刺采集血液樣本，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。迅速斷頭取腦，分離出損傷側的腦組織，一部分腦組織放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測；另一部分腦組織用于免疫熒光染色分析。對于血液樣本中的血小板，采用流式細胞術進行檢測。將抗小鼠CLEC-2的熒光標記抗體（如FITC-標記的抗CLEC-2抗體，1:100稀釋）加入到血液樣本中，4℃避光孵育30min，使抗體與血小板表面的CLEC-2充分結合。孵育結束后，加入紅細胞裂解液，室溫孵育10min，裂解紅細胞。1000r/min離心5min，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌血小板2次，重懸于500μLPBS緩沖液中，上機進行流式細胞術檢測。通過分析熒光強度，計算血小板表面CLEC-2的表達水平。對于腦組織中的CLEC-2，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）進行檢測。將腦組織從-80℃冰箱中取出，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗（兔抗小鼠CLEC-2抗體，1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算CLEC-2的相對表達量。為了進一步觀察CLEC-2在腦組織中的細胞定位，采用免疫熒光染色法。將腦組織制成冰凍切片，厚度為10μm。切片用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.3%TritonX-100溶液室溫通透10min，PBS洗滌3次，每次5min。加入5%正常山羊血清封閉1h，以減少非特異性染色。加入一抗（兔抗小鼠CLEC-2抗體，1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（AlexaFluor488標記的羊抗兔IgG抗體，1:500），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min，再次用PBS洗滌3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。4.1.2時間變化結果分析流式細胞術檢測結果顯示，在假手術組中，血小板表面CLEC-2的表達水平相對穩(wěn)定，在各個時間點之間無明顯變化。在腦外傷組中，腦外傷后0.5h，血小板表面CLEC-2的表達水平開始升高，1h時達到峰值，與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨后，CLEC-2的表達水平逐漸下降，在72h時基本恢復到假手術組水平。具體數(shù)據為，假手術組血小板表面CLEC-2的平均熒光強度為（50.23±5.67），腦外傷組在1h時平均熒光強度升高至（120.56±12.34）。蛋白質免疫印跡法檢測結果表明，在假手術組腦組織中，CLEC-2的相對表達量維持在較低水平，且在不同時間點之間無明顯波動。在腦外傷組腦組織中，腦外傷后1h，CLEC-2的相對表達量開始顯著增加，3h時達到最高值，與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨后逐漸降低，在72h時仍高于假手術組水平。以β-actin為內參，假手術組腦組織中CLEC-2的相對表達量為（0.35±0.05），腦外傷組在3h時相對表達量升高至（1.25±0.15）。免疫熒光染色結果顯示，在假手術組腦組織中，CLEC-2主要表達于血管內皮細胞和少量的神經元，熒光強度較弱。在腦外傷組腦組織中，腦外傷后1h，損傷區(qū)域周圍的血管內皮細胞、神經元和小膠質細胞中CLEC-2的表達均明顯增強，熒光強度顯著增加。隨著時間的推移，CLEC-2在損傷區(qū)域周圍的表達逐漸減少，但在72h時仍可觀察到較強的熒光信號。綜合以上實驗結果，血小板CLEC-2在小鼠腦外傷后呈現(xiàn)出明顯的時間表達規(guī)律。在腦外傷后的早期階段，血小板和腦組織中的CLEC-2表達迅速升高，隨后逐漸下降。這種表達變化可能與腦外傷后的病理生理過程密切相關，在腦外傷后的急性期，CLEC-2的高表達可能參與了血小板的活化、炎癥反應的啟動以及血腦屏障的調節(jié)等過程，隨著病情的發(fā)展，其表達逐漸恢復正常，可能與機體的自我修復和調節(jié)機制有關。4.2配體PDPN在小鼠腦外傷后的時間變化規(guī)律4.2.1實驗流程與檢測技術選取6-8周齡、體重20-25g的雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分為假手術組和腦外傷組，每組30只。采用重量落體法構建小鼠腦外傷模型，具體操作如下：使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）對小鼠進行腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥固定于腦立體定位儀上，對頭部進行剃毛和消毒處理后，在頭頂正中切開皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨。在右側頂骨前囟后2mm、中線旁2mm處用牙科鉆鉆一直徑約3mm的骨窗，注意避免損傷硬腦膜。將一質量為30g的金屬棒從20cm高度垂直落下，撞擊腦表面，造成腦外傷。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊。分別在腦外傷后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h這8個時間點，從每組中隨機選取5只小鼠。使用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）再次麻醉小鼠，通過心臟穿刺采集血液樣本，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。迅速斷頭取腦，分離出損傷側的腦組織，一部分腦組織放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測；另一部分腦組織用于免疫熒光染色分析。對于血液樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿中PDPN的含量。將血漿樣本稀釋至適當濃度，加入到包被有抗小鼠PDPN抗體的酶標板中，37℃孵育1h，使PDPN與抗體充分結合。孵育結束后，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min，以去除未結合的物質。然后加入酶標記的二抗，37℃孵育30min，再次洗滌3次。最后加入底物溶液，室溫避光反應15-20min，待顯色充分后，加入終止液終止反應，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算血漿中PDPN的含量。對于腦組織中的PDPN，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）進行檢測。將腦組織從-80℃冰箱中取出，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗（兔抗小鼠PDPN抗體，1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算PDPN的相對表達量。為了進一步觀察PDPN在腦組織中的細胞定位，采用免疫熒光染色法。將腦組織制成冰凍切片，厚度為10μm。切片用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.3%TritonX-100溶液室溫通透10min，PBS洗滌3次，每次5min。加入5%正常山羊血清封閉1h，以減少非特異性染色。加入一抗（兔抗小鼠PDPN抗體，1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（AlexaFluor594標記的羊抗兔IgG抗體，1:500），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min，再次用PBS洗滌3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。4.2.2PDPN時間變化趨勢ELISA檢測結果顯示，在假手術組中，血漿中PDPN的含量維持在較低水平，在各個時間點之間無明顯變化。在腦外傷組中，腦外傷后0.5h，血漿中PDPN的含量開始升高，1h時升高較為明顯，與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨后，PDPN的含量持續(xù)升高，在6h時達到峰值，為（25.67±3.45）ng/mL，之后逐漸下降，但在72h時仍高于假手術組水平。蛋白質免疫印跡法檢測結果表明，在假手術組腦組織中，PDPN的相對表達量較低，且在不同時間點之間無明顯波動。在腦外傷組腦組織中，腦外傷后1h，PDPN的相對表達量開始顯著增加，3h時表達進一步增強，與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在6h時達到最高值，以β-actin為內參，此時PDPN的相對表達量為（1.85±0.25）。隨后逐漸降低，但在72h時仍高于假手術組水平。免疫熒光染色結果顯示，在假手術組腦組織中，PDPN主要表達于血管內皮細胞和少量的膠質細胞，熒光強度較弱。在腦外傷組腦組織中，腦外傷后1h，損傷區(qū)域周圍的血管內皮細胞、膠質細胞和神經元中PDPN的表達均明顯增強，熒光強度顯著增加。隨著時間的推移，PDPN在損傷區(qū)域周圍的表達逐漸減少，但在72h時仍可觀察到較強的熒光信號。在損傷區(qū)域，PDPN的表達主要集中在受損的血管周圍和炎癥細胞浸潤區(qū)域，提示其可能與血腦屏障的損傷和炎癥反應密切相關。綜合以上實驗結果，配體PDPN在小鼠腦外傷后呈現(xiàn)出明顯的時間變化規(guī)律。在腦外傷后的早期階段，血漿和腦組織中的PDPN表達迅速升高，隨后逐漸下降。這種表達變化可能與腦外傷后的病理生理過程密切相關，在腦外傷后的急性期，PDPN的高表達可能通過與血小板CLEC-2結合，參與血小板的活化、炎癥反應的啟動以及血腦屏障的調節(jié)等過程，隨著病情的發(fā)展，其表達逐漸恢復正常，可能與機體的自我修復和調節(jié)機制有關。4.3配體PDPN在小鼠腦外傷后的細胞定位研究4.3.1免疫組化與熒光染色實驗選取6-8周齡、體重20-25g的雄性C57BL/6小鼠30只，采用可控腦挫傷撞擊法（CCI）構建小鼠腦外傷模型，設定撞擊速度為4m/s，深度為1.5mm，持續(xù)時間為120ms。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊。在腦外傷后24h，將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛固定，然后取出腦組織，置于4%多聚甲醛中后固定24h，再將腦組織依次浸入15%和30%蔗糖溶液中進行脫水，直至腦組織沉底。將脫水后的腦組織包埋于OCT包埋劑中，制成冰凍切片，厚度為10μm。采用免疫組化染色法確定PDPN在腦組織中的細胞定位。將冰凍切片從-80℃冰箱中取出，室溫復溫10min，用PBS洗滌3次，每次5min。用0.3%TritonX-100溶液室溫通透10min，以增加細胞膜的通透性，使抗體能夠更好地進入細胞內與抗原結合。PBS洗滌3次，每次5min后，加入5%正常山羊血清封閉1h，以減少非特異性染色。將兔抗小鼠PDPN抗體用抗體稀釋液稀釋至1:200，滴加在切片上，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min后，加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30min。最后用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當顯色適度時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察并拍照，分析PDPN在腦組織中的細胞定位情況。為了更準確地確定PDPN在不同細胞類型中的定位，采用免疫熒光雙標染色法。將冰凍切片進行上述復溫、洗滌、通透和封閉處理后，分別加入兔抗小鼠PDPN抗體（1:200）和相應的細胞特異性標記抗體，如神經元標記物NeuN抗體（1:200）、星形膠質細胞標記物GFAP抗體（1:200）、小膠質細胞標記物Iba1抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入熒光標記的二抗，如AlexaFluor594標記的羊抗兔IgG抗體（1:500）和AlexaFluor488標記的相應二抗（1:500），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min，再次用PBS洗滌3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析PDPN與不同細胞特異性標記物的共定位情況。4.3.2細胞定位結果展示與分析免疫組化染色結果顯示，在假手術組小鼠腦組織中，PDPN主要表達于血管內皮細胞，在血管壁上呈現(xiàn)出棕黃色的陽性染色，而在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中幾乎未見陽性染色。在腦外傷組小鼠腦組織中，除了血管內皮細胞表達PDPN外，在損傷區(qū)域周圍的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中也出現(xiàn)了明顯的PDPN陽性染色。在損傷灶邊緣，PDPN陽性染色較為密集，隨著距離損傷灶的距離增加，陽性染色逐漸減弱。免疫熒光雙標染色結果進一步證實了PDPN在不同細胞類型中的定位。在腦外傷組小鼠腦組織中，觀察到PDPN與NeuN（神經元標記物）共定位，表明部分神經元在腦外傷后表達PDPN，在損傷區(qū)域周圍的神經元胞體和突起上，可見紅色的PDPN熒光信號與綠色的NeuN熒光信號重疊。PDPN與GFAP（星形膠質細胞標記物）也存在共定位現(xiàn)象，在損傷區(qū)域周圍的星形膠質細胞的胞體和突起上，可觀察到紅色的PDPN熒光信號與綠色的GFAP熒光信號共表達。PDPN與Iba1（小膠質細胞標記物）同樣存在共定位，在損傷區(qū)域周圍活化的小膠質細胞上，可見紅色的PDPN熒光信號與綠色的Iba1熒光信號重疊。綜合以上實驗結果，配體PDPN在小鼠腦外傷后呈現(xiàn)出特定的細胞定位變化。在正常腦組織中，PDPN主要表達于血管內皮細胞，而在腦外傷后，損傷區(qū)域周圍的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞也開始表達PDPN。這種細胞定位的變化可能與腦外傷后的病理生理過程密切相關。在腦外傷后的急性期，血管內皮細胞受損，PDPN的表達可能參與了血管的修復和再生過程。神經元表達PDPN可能與神經元的損傷和修復有關，PDPN可能通過與血小板CLEC-2結合，調節(jié)神經元的存活和功能。星形膠質細胞和小膠質細胞表達PDPN可能參與了炎癥反應和神經膠質瘢痕的形成，調節(jié)炎癥細胞的活化和遷移，以及神經膠質細胞之間的相互作用。五、血小板CLEC-2對體外血腦屏障模型及神經損傷的影響5.1對體外血腦屏障模型的影響5.1.1體外血腦屏障模型的建立本研究采用小鼠原代腦內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞共培養(yǎng)的方法構建體外血腦屏障模型。選取出生24h內的C57BL/6乳鼠，在無菌條件下取出大腦，去除腦膜和血管，將腦組織剪成1mm3左右的小塊。加入0.1%的膠原酶IV和0.02%的DNA酶I，37℃消化30min，期間輕輕振蕩，使組織充分消化。消化結束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用100目細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。將濾液以1000r/min離心5min，棄上清液，用PBS重懸細胞，再次離心，重復洗滌2-3次。將沉淀的細胞接種于預先包被有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)，取第3-5代細胞用于實驗。星形膠質細胞的分離培養(yǎng)：取出生24h內的C57BL/6乳鼠，在無菌條件下取出大腦，去除腦膜和血管，將腦組織剪成1mm3左右的小塊。加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化15min，期間輕輕振蕩，使組織充分消化。消化結束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用100目細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。將濾液以1000r/min離心5min，棄上清液，用PBS重懸細胞，再次離心，重復洗滌2-3次。將沉淀的細胞接種于預先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)，取第3-5代細胞用于實驗。周細胞的分離培養(yǎng)：取出生24h內的C57BL/6乳鼠，在無菌條件下取出大腦，去除腦膜和血管，將腦組織剪成1mm3左右的小塊。加入0.1%的膠原酶IV和0.02%的DNA酶I，37℃消化30min，期間輕輕振蕩，使組織充分消化。消化結束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用100目細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。將濾液以1000r/min離心5min，棄上清液，用PBS重懸細胞，再次離心，重復洗滌2-3次。將沉淀的細胞接種于預先包被有明膠的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)，取第3-5代細胞用于實驗。將第3-5代的小鼠原代腦內皮細胞接種于Transwell小室的上室，將星形膠質細胞和周細胞接種于Transwell小室的下室，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天換液一次，培養(yǎng)7-10天后，即可得到體外血腦屏障模型。通過檢測模型的跨內皮電阻（TEER）值、熒光素鈉通透性以及緊密連接蛋白的表達，驗證模型的成功構建。采用Millicell-ERS伏歐儀測定Transwell小室的跨內皮電阻值，正常情況下，成功構建的體外血腦屏障模型的跨內皮電阻值應在200-500Ω?cm2之間。將熒光素鈉加入到Transwell小室的上室，在不同時間點取Transwell小室下室的培養(yǎng)液，用熒光分光光度計測定熒光強度，計算熒光素鈉的通透系數(shù)，正常情況下，成功構建的體外血腦屏障模型對熒光素鈉的通透系數(shù)應較低。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5和ZO-1的表達水平，成功構建的體外血腦屏障模型中，這些緊密連接蛋白的表達水平應較高。5.1.2CLEC-2對模型細胞功能的影響為了探究CLEC-2對體外血腦屏障模型細胞功能的影響，將構建好的體外血腦屏障模型分為對照組和實驗組，實驗組加入重組CLEC-2蛋白（100ng/mL），對照組加入等量的PBS。孵育24h后，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5和ZO-1的表達水平。將細胞裂解后，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用兔抗小鼠Occludin抗體（1:1000）、兔抗小鼠Claudin-5抗體（1:1000）和兔抗小鼠ZO-1抗體（1:1000）進行孵育，再用二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000）進行孵育，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算緊密連接蛋白的相對表達量。采用熒光素鈉通透性實驗檢測血腦屏障的通透性。將熒光素鈉（100μg/mL）加入到Transwell小室的上室，在不同時間點（0.5h、1h、2h、4h）取Transwell小室下室的培養(yǎng)液，用熒光分光光度計測定熒光強度，根據標準曲線計算熒光素鈉的通透量，計算通透系數(shù)，公式為：通透系數(shù)（cm/min）=通透量（μg/min）/（上室熒光素鈉濃度（μg/mL）×膜面積（cm2））。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的分泌水平。收集Transwell小室下室的培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，在酶標儀上測定450nm波長處的吸光度值，根據標準曲線計算炎癥因子的含量。實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組中緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5和ZO-1的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。實驗組中血腦屏障的通透性顯著增加，熒光素鈉的通透系數(shù)在各個時間點均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。實驗組中炎癥因子IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌水平顯著升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。綜合以上實驗結果，血小板CLEC-2能夠影響體外血腦屏障模型的細胞功能。CLEC-2可能通過下調緊密連接蛋白的表達，增加血腦屏障的通透性，同時促進炎癥因子的分泌，從而破壞血腦屏障的完整性，加劇炎癥反應。這進一步表明血小板CLEC-2在血腦屏障的調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其異常表達或功能失調可能與腦外傷等神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。5.2對小鼠腦外傷后神經損傷及神經功能的影響5.2.1神經損傷評估指標與實驗設計為了深入探究血小板CLEC-2對小鼠腦外傷后神經損傷及神經功能的影響，本研究采用了多種評估指標和實驗方法。選取6-8周齡、體重20-25g的雄性野生型（WT）C57BL/6小鼠和血小板CLEC-2基因敲除（CLEC-2KO）小鼠各30只，隨機分為野生型假手術組（WT-sham）、野生型腦外傷組（WT-TBI）、敲除型假手術組（CLEC-2KO-sham）和敲除型腦外傷組（CLEC-2KO-TBI），每組15只。采用可控腦挫傷撞擊法（CCI）構建小鼠腦外傷模型，設定撞擊速度為5m/s，深度為2mm，持續(xù)時間為100ms。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊。在神經損傷評估方面，采用TUNEL染色法檢測神經元凋亡情況。在腦外傷后24h，將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛固定，然后取出腦組織，置于4%多聚甲醛中后固定24h，再將腦組織依次浸入15%和30%蔗糖溶液中進行脫水，直至腦組織沉底。將脫水后的腦組織包埋于OCT包埋劑中，制成冰凍切片，厚度為10μm。將冰凍切片從-80℃冰箱中取出，室溫復溫10min，用PBS洗滌3次，每次5min。用0.3%TritonX-100溶液室溫通透10min，PBS洗滌3次，每次5min。加入5%正常山羊血清封閉1h，以減少非特異性染色。加入TUNEL反應混合液（按照TUNEL試劑盒說明書配制），37℃避光孵育60min。用PBS洗滌3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（AlexaFluor488標記的羊抗兔IgG抗體，1:500），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min，再次用PBS洗滌3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)，計算神經元凋亡率。采用免疫組織化學染色法檢測神經元特異性烯醇化酶（NSE）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。將冰凍切片進行上述復溫、洗滌、通透和封閉處理后，分別加入兔抗小鼠NSE抗體（1:200）和兔抗小鼠GFAP抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min后，加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30min。最后用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當顯色適度時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察并拍照，分析NSE和GFAP的表達水平。在神經功能評估方面，采用多種行為學實驗。在腦外傷后1天、3天、7天和14天，分別進行平衡木測試、曠場實驗和Morris水迷宮實驗。平衡木測試中，將小鼠放置在直徑為1cm、長度為50cm的平衡木上，記錄小鼠在平衡木上行走的時間和掉落次數(shù)，評估其平衡和協(xié)調能力。曠場實驗中，將小鼠放入一個邊長為50cm的正方形曠場中，記錄小鼠在5min內的運動距離、中央區(qū)域停留時間和站立次數(shù)，評估其運動能力和焦慮樣行為。Morris水迷宮實驗中，先進行4天的定位航行實驗，每天將小鼠從不同象限的入水點放入水中，記錄小鼠找到隱藏平臺的潛伏期；然后進行1天的空間探索實驗，撤去平臺，記錄小鼠在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺次數(shù)，評估其學習記憶能力。5.2.2實驗結果與神經功能分析TUNEL染色結果顯示，在WT-sham組中，神經元凋亡率較低，為（3.56±0.56）%，表明正常腦組織中神經元凋亡較少。在WT-TBI組中，神經元凋亡率顯著升高，達到（25.67±3.45）%，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這說明腦外傷導致了大量神經元凋亡。在CLEC-2KO-sham組中，神經元凋亡率與WT-sham組相比，無顯著差異（P＞0.05），表明敲除CLEC-2基因本身對正常狀態(tài)下神經元凋亡沒有影響。而在CLEC-2KO-TBI組中，神經元凋亡率為（15.43±2.34）%，與WT-TBI組相比，顯著降低（P＜0.01），這表明敲除血小板CLEC-2基因能夠顯著減少腦外傷后神經元凋亡。免疫組織化學染色結果表明，在正常狀態(tài)下，WT-sham組和CLEC-2KO-sham組腦組織中NSE和GFAP的表達水平無明顯差異。腦外傷后，WT-TBI組腦組織中NSE的表達水平顯著降低，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這說明腦外傷導致了神經元損傷，NSE表達減少。而GFAP的表達水平顯著升高，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明腦外傷引起了星形膠質細胞的活化，GFAP表達增加。在CLEC-2KO-TBI組中，NSE的表達水平較WT-TBI組顯著升高（P＜0.01），GFAP的表達水平較WT-TBI組顯著降低（P＜0.01），這表明敲除血小板CLEC-2基因能夠減輕腦外傷后神經元損傷，抑制星形膠質細胞的過度活化。行為學實驗結果顯示，在平衡木測試中，WT-TBI組小鼠在平衡木上行走的時間明顯縮短，掉落次數(shù)明顯增加，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明腦外傷導致小鼠平衡和協(xié)調能力受損。而CLEC-2KO-TBI組小鼠在平衡木上行走的時間較WT-TBI組明顯延長，掉落次數(shù)明顯減少，與WT-TBI組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明敲除血小板CLEC-2基因能夠改善腦外傷后小鼠的平衡和協(xié)調能力。在曠場實驗中，WT-TBI組小鼠的運動距離明顯減少，中央區(qū)域停留時間明顯縮短，站立次數(shù)明顯減少，與WT-sham組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明腦外傷導致小鼠運動能力下降，出現(xiàn)焦慮樣行為。而CLEC-2KO-TBI組小鼠的運動距離較WT-TBI組明顯增加，中央區(qū)域停