細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程演講人：日期:目錄CONTENTS01實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備02細(xì)胞復(fù)蘇流程03傳代培養(yǎng)操作04日常觀察檢測(cè)05細(xì)胞凍存處理06實(shí)驗(yàn)安全要求01實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備與耗材滅菌6px6px6px用于滅菌實(shí)驗(yàn)所需的器械和耗材，包括培養(yǎng)皿、移液器、試管等。滅菌鍋如乙醇、過氧化氫等，用于表面消毒和浸泡滅菌。滅菌劑用于實(shí)驗(yàn)前操作臺(tái)面和空氣的無菌處理。紫外線燈010302采用高壓蒸汽滅菌法對(duì)實(shí)驗(yàn)所需的耗材進(jìn)行滅菌。耗材滅菌04培養(yǎng)基配制規(guī)范配方選擇配制過程過濾除菌儲(chǔ)存條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適宜的培養(yǎng)基配方，確保其營(yíng)養(yǎng)成分和pH值適宜細(xì)胞生長(zhǎng)。在無菌條件下進(jìn)行，使用超純水溶解各組分，確保充分溶解和均勻混合。采用過濾法去除培養(yǎng)基中的細(xì)菌、真菌等微生物。配制好的培養(yǎng)基需放置于無菌容器內(nèi)，保存在適宜的溫度和濕度條件下，避免污染和變質(zhì)。無菌操作臺(tái)預(yù)檢清潔度檢查確保操作臺(tái)面、無菌器械和耗材表面潔凈無污漬。01無菌操作操作時(shí)需佩戴無菌手套和口罩，避免微生物污染。02廢棄物處理實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物需及時(shí)放入專用容器中，避免交叉污染。03空氣凈化保持操作臺(tái)內(nèi)空氣潔凈，避免污染。0402細(xì)胞復(fù)蘇流程凍存管快速解凍將細(xì)胞凍存管從液氮中迅速取出，放入37℃水浴中快速解凍，并不斷搖動(dòng)，使其在短時(shí)間內(nèi)融化。快速解凍解凍過程中要注意避免細(xì)胞受到過大的熱沖擊或冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。避免細(xì)胞受損離心清洗步驟將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，進(jìn)行離心，以去除上清中的DMSO等有害物質(zhì)。離心用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液對(duì)離心后的細(xì)胞進(jìn)行清洗，以去除殘留的有害物質(zhì)和死亡的細(xì)胞。清洗0102接種密度根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求，確定合適的細(xì)胞接種密度，以保證細(xì)胞在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的正常生長(zhǎng)。均勻接種將細(xì)胞懸液均勻接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，避免出現(xiàn)細(xì)胞聚集或分布不均的情況。接種密度控制03傳代培養(yǎng)操作消化時(shí)間判定細(xì)胞消化速度不同種類的細(xì)胞消化速度不同，需根據(jù)細(xì)胞特性確定消化時(shí)間。01消化液選擇選用適當(dāng)?shù)南?，如胰蛋白酶、膠原蛋白酶等，以加速細(xì)胞消化。02消化程度判斷消化過程中需不斷觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)即可終止消化。03細(xì)胞計(jì)數(shù)方法選用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板選擇清潔計(jì)數(shù)板，將蓋玻片覆蓋在計(jì)數(shù)板上。計(jì)數(shù)室準(zhǔn)備將細(xì)胞懸液滴于計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞密度計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)方法分瓶比例優(yōu)化分瓶方法采用無菌技術(shù)，將細(xì)胞懸液均勻分配到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。03根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的分瓶比例，如1:2、1:3等。02分瓶比例分瓶時(shí)機(jī)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)及時(shí)分瓶，以保證細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。0104日常觀察檢測(cè)形態(tài)學(xué)記錄標(biāo)準(zhǔn)觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常，包括細(xì)胞大小、形狀、折光性等。細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞數(shù)量記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如貼壁生長(zhǎng)、懸浮生長(zhǎng)、分裂狀態(tài)等。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。污染排查要點(diǎn)細(xì)菌污染觀察培養(yǎng)基是否渾濁，有無細(xì)菌菌落生長(zhǎng)。01真菌污染觀察培養(yǎng)基表面或內(nèi)部是否有菌絲或真菌菌落。02細(xì)胞交叉污染確認(rèn)細(xì)胞株是否純，有無其他細(xì)胞污染。03通過細(xì)胞增殖曲線或細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞增殖能力觀察細(xì)胞形態(tài)、折光性、胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)等，評(píng)估細(xì)胞活性。細(xì)胞活性對(duì)于某些特定類型的細(xì)胞，觀察其分化狀態(tài)是否正常。細(xì)胞分化狀態(tài)生長(zhǎng)狀態(tài)評(píng)估05細(xì)胞凍存處理凍存液配制方案DMSO濃度通常為5%-20%，過高過低均會(huì)影響細(xì)胞存活率。03一般使用10%-90%的血清濃度，具體根據(jù)細(xì)胞特性確定。02血清濃度細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清+DMSO等細(xì)胞凍存保護(hù)劑。01程序降溫設(shè)置一般以1℃/min的速率緩慢降溫至-80℃左右，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。降溫速率降溫階段注意事項(xiàng)先置于4℃冰箱中預(yù)冷30min，再轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置2h，最后放入-80℃冰箱過夜。降溫過程中避免溫度波動(dòng)，以免影響細(xì)胞存活。液氮保存規(guī)范液氮罐選擇質(zhì)量可靠的液氮罐，確保液氮罐內(nèi)部溫度低于-196℃。01細(xì)胞凍存管使用專門的細(xì)胞凍存管，確保密封性良好，避免液氮泄漏。02存放位置將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐的合適位置，避免與其他物品接觸，以減少溫度波動(dòng)對(duì)細(xì)胞的影響。0306實(shí)驗(yàn)安全要求生物污染防控實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面的消毒處理，確保無菌操作環(huán)境。個(gè)人防護(hù)實(shí)驗(yàn)人員需穿戴防護(hù)服、手套、口罩等防護(hù)用品，避免細(xì)胞污染。生物安全柜使用所有細(xì)胞操作均需在生物安全柜中進(jìn)行，避免外部環(huán)境污染。實(shí)驗(yàn)用品消毒實(shí)驗(yàn)前對(duì)所用器材、試劑等進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理。廢棄物處理流程廢棄物分類化學(xué)性廢棄物處理感染性廢棄物處理一般性廢棄物處理將實(shí)驗(yàn)廢棄物分為感染性廢棄物、化學(xué)性廢棄物和一般性廢棄物，分別處理。使用專用袋密封，標(biāo)明感染性廢棄物，送至指定地點(diǎn)進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行分類、儲(chǔ)存和處理，避免對(duì)環(huán)境和人員造成危害。如廢紙、廢塑料等，應(yīng)妥善處理，避免影響環(huán)境衛(wèi)生。應(yīng)急事故預(yù)案應(yīng)急預(yù)案制定應(yīng)急演練應(yīng)急器材準(zhǔn)備事故報(bào)告與處理針對(duì)可能發(fā)生的實(shí)驗(yàn)事故，制定詳細(xì)的應(yīng)急預(yù)案，包括應(yīng)急處理流程、救援措施等。定期組織