DAPT與NS-398對胃癌細胞Notch1信號通路的靶向抑制研究：機制、效果與展望一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居前列。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，我國作為胃癌高發(fā)國家，新發(fā)病例和死亡病例數(shù)均占全球近一半。由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過最佳手術(shù)治療時機，且對放化療的敏感性有限，導(dǎo)致總體5年生存率較低，僅為20%-30%左右。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和新的治療策略，對于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有迫切且重要的意義。Notch信號通路是一條在進化上高度保守的細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路主要由Notch受體（Notch1-4）、Notch配體（Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2）、CSL轉(zhuǎn)錄因子及下游靶基因等組成。在正常生理狀態(tài)下，Notch信號通路精確調(diào)控細胞的命運決定和組織器官的發(fā)育。然而，越來越多的研究表明，Notch1信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)異常激活，參與了胃癌細胞的增殖、分化、遷移、侵襲以及腫瘤血管生成等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，Notch1受體及其下游靶基因Hes1、Hey1的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且其表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，提示Notch1信號通路的激活可能促進了胃癌的惡性進展。此外，Notch1信號通路還可與其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/Akt信號通路等相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響胃癌細胞的生物學行為。因此，深入研究Notch1信號通路在胃癌中的作用機制，有望為胃癌的治療提供新的靶點和思路。目前，針對Notch1信號通路的抑制劑已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點之一。γ-分泌酶抑制劑（GSIs）能夠阻斷Notch受體的剪切激活過程，從而抑制Notch信號通路的傳導(dǎo)。DAPT（N-[N-（3,5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰]-（S）-苯基甘氨酸叔丁酯）作為一種經(jīng)典的γ-分泌酶抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于Notch信號通路相關(guān)的研究中。在多種腫瘤細胞模型中，DAPT能夠有效抑制Notch1信號通路的激活，進而抑制腫瘤細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。然而，DAPT在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如藥物毒性、耐藥性等問題，限制了其進一步的臨床推廣。NS-398是一種選擇性環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑。已有研究表明，COX-2在胃癌組織中呈高表達，且與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。NS-398可通過抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2（PGE2）的合成，從而發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NS-398除了通過抑制COX-2發(fā)揮作用外，還可能通過其他途徑影響腫瘤細胞的生物學行為。有研究報道，NS-398能夠抑制乳腺癌細胞中Notch1信號通路的激活，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。然而，NS-398對胃癌細胞Notch1信號通路的影響及其作用機制尚未完全明確?；谝陨媳尘埃狙芯繑M探討DAPT與NS-398對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制效果及其作用機制。通過研究，一方面可以深入了解Notch1信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為胃癌的發(fā)病機制研究提供新的理論依據(jù)；另一方面，有望為胃癌的治療提供新的潛在治療靶點和藥物組合策略，為開發(fā)更加有效的胃癌治療方法奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的本研究旨在深入探究DAPT與NS-398對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制效果，具體研究目的如下：明確DAPT與NS-398單獨作用時對胃癌細胞Notch1信號通路關(guān)鍵分子表達的影響：通過蛋白免疫印跡（Westernblot）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）等實驗技術(shù)，檢測Notch1受體、其胞內(nèi)活性片段NICD以及下游靶基因Hes1、Hey1等在mRNA和蛋白水平的表達變化，明確這兩種藥物單獨使用時對Notch1信號通路的抑制作用靶點和程度，從而揭示其在胃癌細胞中對該信號通路的調(diào)控機制。探究DAPT與NS-398聯(lián)合作用對胃癌細胞Notch1信號通路的影響：觀察聯(lián)合用藥后胃癌細胞Notch1信號通路相關(guān)分子的表達改變，分析兩種藥物聯(lián)合使用時是否存在協(xié)同抑制效應(yīng)，以及這種協(xié)同作用對Notch1信號通路關(guān)鍵節(jié)點分子的影響機制，為開發(fā)新的胃癌聯(lián)合治療方案提供理論依據(jù)。評估DAPT與NS-398單獨及聯(lián)合作用對胃癌細胞增殖和凋亡的影響：采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法、5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗檢測細胞增殖能力；利用流式細胞術(shù)、Hoechst33342染色等方法檢測細胞凋亡情況，明確DAPT與NS-398單獨及聯(lián)合使用對胃癌細胞生物學行為的影響，進而確定Notch1信號通路抑制與胃癌細胞增殖、凋亡之間的關(guān)聯(lián)。探討DAPT與NS-398作用于胃癌細胞的潛在分子機制：研究除Notch1信號通路外，DAPT與NS-398是否通過影響其他相關(guān)信號通路（如PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路），或通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等分子的表達，來發(fā)揮對胃癌細胞的抑制作用，為全面理解其抗癌機制提供更深入的視角。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1胃癌細胞Notch1信號通路的研究在國外，對胃癌細胞Notch1信號通路的研究開展較早且深入。有研究運用基因敲除和過表達技術(shù)，發(fā)現(xiàn)敲低Notch1基因后，胃癌細胞的增殖能力顯著下降，細胞周期阻滯在G0/G1期，且細胞的遷移和侵襲能力也明顯減弱，表明Notch1在維持胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力中起著關(guān)鍵作用。還有研究通過構(gòu)建胃癌小鼠模型，觀察到激活Notch1信號通路可促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而抑制該信號通路則能抑制腫瘤的發(fā)展，進一步證實了Notch1信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。國內(nèi)學者也在該領(lǐng)域取得了諸多成果。有研究采用免疫組化和Westernblot技術(shù)檢測了大量胃癌組織和細胞系中Notch1信號通路相關(guān)分子的表達，發(fā)現(xiàn)Notch1、NICD及下游靶基因Hes1、Hey1在胃癌組織中的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織，且與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示Notch1信號通路的激活可能作為評估胃癌惡性程度和預(yù)后的重要指標。此外，有研究探討了Notch1信號通路與其他信號通路在胃癌細胞中的相互作用，發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路可通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵分子β-catenin的表達，促進胃癌細胞的增殖和遷移，揭示了胃癌細胞中復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3.2DAPT對胃癌細胞Notch1信號通路影響的研究國外關(guān)于DAPT對胃癌細胞Notch1信號通路影響的研究較為廣泛。有研究將不同濃度的DAPT作用于胃癌細胞系，通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，DAPT能夠劑量依賴性地降低Notch1、NICD、Hes1和Hey1的mRNA和蛋白表達水平，從而有效抑制Notch1信號通路的激活。在細胞功能實驗中，發(fā)現(xiàn)DAPT處理后的胃癌細胞增殖受到抑制，凋亡明顯增加，并且細胞的遷移和侵襲能力也顯著降低，表明DAPT通過抑制Notch1信號通路，對胃癌細胞的生物學行為產(chǎn)生了明顯的抑制作用。國內(nèi)研究也進一步驗證和拓展了這些發(fā)現(xiàn)。有研究利用裸鼠移植瘤模型，觀察到腹腔注射DAPT后，移植瘤的生長明顯受到抑制，瘤體重量減輕，同時Notch1信號通路相關(guān)分子在腫瘤組織中的表達也顯著下調(diào)，證實了DAPT在體內(nèi)對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制作用及抗腫瘤效果。此外，有研究還探討了DAPT與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對胃癌細胞的作用，發(fā)現(xiàn)DAPT與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用時，對胃癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用具有協(xié)同效應(yīng)，為胃癌的聯(lián)合治療提供了新的思路。1.3.3NS-398對胃癌細胞作用的研究國外對NS-398在胃癌細胞中的作用研究主要集中在其對COX-2的抑制以及由此產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，NS-398能夠抑制胃癌細胞中COX-2的活性，減少PGE2的合成，進而抑制胃癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)NS-398可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，使胃癌細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的生長。國內(nèi)研究在上述基礎(chǔ)上，進一步探索了NS-398的其他作用機制。有研究運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析NS-398作用于胃癌細胞后的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)NS-398可通過影響多條信號通路相關(guān)蛋白的表達，如抑制PI3K/Akt信號通路的激活，來發(fā)揮其抗腫瘤作用。還有研究探討了NS-398與中藥聯(lián)合應(yīng)用對胃癌細胞的影響，發(fā)現(xiàn)NS-398與某些中藥提取物聯(lián)合使用時，能增強對胃癌細胞的抑制效果，為胃癌的中西醫(yī)結(jié)合治療提供了實驗依據(jù)。1.3.4研究現(xiàn)狀的不足與展望盡管目前在胃癌細胞Notch1信號通路以及DAPT、NS-398對胃癌細胞作用的研究方面取得了一定進展，但仍存在一些不足。首先，對于Notch1信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機制尚未完全明確，其與其他信號通路之間復(fù)雜的交互作用網(wǎng)絡(luò)還需要進一步深入研究。其次，DAPT在臨床應(yīng)用中面臨的藥物毒性和耐藥性問題，以及NS-398對胃癌細胞作用的具體分子機制和潛在副作用等，都有待進一步探索和解決。此外，關(guān)于DAPT與NS-398聯(lián)合作用對胃癌細胞Notch1信號通路的影響及作用機制的研究還相對較少，這為未來的研究提供了重要方向。未來的研究可以從以下幾個方面展開：一是深入探究Notch1信號通路在胃癌中的分子調(diào)控機制，尤其是其與其他關(guān)鍵信號通路的協(xié)同或拮抗作用，為尋找新的治療靶點提供理論基礎(chǔ)；二是進一步研究DAPT和NS-398的作用機制，優(yōu)化藥物設(shè)計，提高藥物療效，降低藥物毒性，推動其臨床應(yīng)用；三是加強對DAPT與NS-398聯(lián)合治療胃癌的研究，明確兩者聯(lián)合使用的最佳劑量和方案，評估其協(xié)同效應(yīng)和安全性，為開發(fā)新的胃癌治療策略提供依據(jù)。二、Notch1信號通路與胃癌2.1Notch1信號通路概述2.1.1通路組成與激活機制Notch1信號通路主要由Notch1受體、Notch配體以及細胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSL-DNA結(jié)合蛋白等組成。Notch1受體是一種跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包含胞外區(qū)（NEC）、跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）。胞外區(qū)含有29-36個串聯(lián)的表皮生長因子（EGF）序列及3個富含半胱氨酸的LinNotch重復(fù)序列（LNR），這些結(jié)構(gòu)域主要負責與配體結(jié)合并啟動Notch信號。跨膜區(qū)為單孔跨膜結(jié)構(gòu)，在甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間存在一個裂解位點（S3位點），在突變型早老素（Presenilin）蛋白等水解作用下，Notch1在該位點發(fā)生斷裂，生成胞內(nèi)區(qū)ICN和一個短的跨膜片段。胞內(nèi)區(qū)則主要包含1個RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）區(qū)，可與DNA結(jié)合蛋白（C2promoterbindingprotein，CBF）結(jié)合；6個錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeats，ANK），作為啟動Notch1的增強子，介導(dǎo)Notch1與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用；2個核定位信號（nuclearlocalizationsignal，NLS）；1個翻譯啟動區(qū)（translationalactivedomain，TAD）以及1個PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T）區(qū)域，與Notch1受體的降解有關(guān)。Notch配體又被稱為DSL蛋白，包括Deltalike（DLL1、DLL3、DLL4）、Jagged1和Jagged2。這些配體是含保守分子結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，其胞外區(qū)包含數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸），是與Notch1受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。細胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSLDNA結(jié)合蛋白，在哺乳動物中CBF-1（C-promoterbindingfactor-1）又被稱為RBP-JK（recombinationsignalbindingprotein-Jk），它是轉(zhuǎn)錄抑制因子，在Notch1信號通路中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠識別并結(jié)合特定的DNA序列（GTGGGAA），該序列位于Notch1誘導(dǎo)基因的啟動子上。Notch1信號通路的激活過程較為復(fù)雜，涉及三次酶切。首先，在Notch1成熟過程中，其在高爾基體內(nèi)furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下，于胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間的S1位點發(fā)生裂解，產(chǎn)生胞外區(qū)（NEC）和跨膜片段（NTM）兩個亞基，二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch1受體，定位于細胞膜表面。當Notch1受體與配體結(jié)合后，在金屬蛋白酶（ML）/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶（TACE）作用下，于胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間的S2位點裂解為兩個片段，N端裂解產(chǎn)物（胞外區(qū)）被配體表達細胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進一步在跨膜區(qū)的S3位點（1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間），經(jīng)高分子量多蛋白聯(lián)合體（主要包括γ-分泌酶、突變型早老素和各種輔因子）裂解，釋放出Notch1蛋白的活化形式NICD（ICN）。NICD進入細胞核后，通過其RAM和ANK結(jié)構(gòu)域與CBF-1相互作用，置換了SMRT輔阻礙物和與之結(jié)合的HDAC酶，從而解除轉(zhuǎn)錄抑制，啟動Notch1下游靶基因（如Hes1、Hey1等）的表達，實現(xiàn)對細胞功能的調(diào)控。2.1.2在正常生理過程中的作用在正常生理過程中，Notch1信號通路對細胞分化、增殖和凋亡等起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在細胞分化方面，Notch1信號通路參與了多種組織和器官的發(fā)育過程。例如，在胚胎發(fā)育早期，Notch1信號通路對于神經(jīng)干細胞的分化方向具有重要的決定作用。神經(jīng)干細胞在Notch1信號的調(diào)控下，可以維持其未分化狀態(tài)或者向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等不同的細胞類型分化。當Notch1信號通路激活時，它可以抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，促進其維持干細胞狀態(tài)或向星形膠質(zhì)細胞分化。在造血系統(tǒng)中，Notch1信號通路也參與了造血干細胞的分化過程，調(diào)節(jié)造血干細胞向不同譜系血細胞的分化，如T淋巴細胞、B淋巴細胞等。對于細胞增殖，Notch1信號通路在不同的細胞環(huán)境中發(fā)揮著不同的作用。在一些細胞類型中，Notch1信號通路的激活可以促進細胞增殖。例如，在皮膚表皮細胞中，Notch1信號通路的激活能夠促進表皮細胞的增殖，維持皮膚的正常生長和修復(fù)。然而，在另一些細胞中，Notch1信號通路則可能抑制細胞增殖。如在腸道上皮細胞中，適當水平的Notch1信號可以維持腸道上皮細胞的穩(wěn)態(tài)，當Notch1信號異常激活時，可能會抑制細胞增殖，導(dǎo)致腸道上皮細胞更新受阻。在細胞凋亡調(diào)控方面，Notch1信號通路同樣扮演著重要角色。研究表明，Notch1信號通路可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達來影響細胞凋亡。在某些情況下，Notch1信號通路的激活可以抑制細胞凋亡，促進細胞存活。例如，在心肌細胞中，Notch1信號通路的激活可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制心肌細胞凋亡，從而保護心肌細胞在缺血等應(yīng)激條件下的存活。相反，在一些腫瘤細胞中，抑制Notch1信號通路可能會誘導(dǎo)細胞凋亡，如在乳腺癌細胞中，抑制Notch1信號通路可以下調(diào)抗凋亡蛋白的表達，同時上調(diào)促凋亡蛋白的表達，從而促進乳腺癌細胞的凋亡。2.2Notch1信號通路與胃癌的關(guān)聯(lián)2.2.1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制Notch1信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，其異常激活對胃癌細胞的生物學行為產(chǎn)生多方面的影響。在胃癌細胞增殖方面，Notch1信號通路的激活為癌細胞的快速分裂提供了必要條件。研究表明，Notch1信號通路激活后，可上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，促使細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期進程，從而促進胃癌細胞的增殖。如在體外培養(yǎng)的胃癌細胞系中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達Notch1，可觀察到細胞中CyclinD1的表達顯著增加，細胞增殖能力明顯增強；而當利用RNA干擾技術(shù)沉默Notch1基因時，CyclinD1的表達下調(diào)，細胞增殖受到抑制。此外，Notch1還可通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制下游促凋亡蛋白Bad的活性，促進細胞存活和增殖。PI3K被激活后，可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進而招募并激活A(yù)kt，活化的Akt通過磷酸化Bad，使其失去促凋亡活性，從而促進胃癌細胞的存活和增殖。對于胃癌細胞的存活，Notch1信號通路同樣起到重要的維持作用。Notch1信號通路可調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員的表達，如上調(diào)Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bak等的表達，從而抑制胃癌細胞的凋亡，維持其存活。在胃癌組織中，?？蓹z測到Notch1高表達，且Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達水平也相應(yīng)升高，與癌旁正常組織形成鮮明對比。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當抑制Notch1信號通路時，Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達下降，Bax、Bak等促凋亡蛋白的表達增加，胃癌細胞的凋亡率顯著上升，表明Notch1信號通路通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，維持胃癌細胞的存活。在胃癌細胞遷移和侵襲能力方面，Notch1信號通路的異常激活起到了促進作用。Notch1信號通路可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，在此過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。Notch1信號通路激活后，可上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子可抑制上皮標志物E-cadherin的表達，同時上調(diào)間質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin等的表達，從而促進胃癌細胞發(fā)生EMT，增強其遷移和侵襲能力。在體外Transwell實驗中，過表達Notch1的胃癌細胞穿過小室膜的細胞數(shù)量明顯增多，而沉默Notch1后，穿過小室膜的細胞數(shù)量顯著減少，表明Notch1信號通路對胃癌細胞的遷移和侵襲能力具有重要調(diào)控作用。Notch1信號通路還與胃癌干細胞特性的維持密切相關(guān)。胃癌干細胞是胃癌組織中具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的細胞亞群，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號通路在胃癌干細胞中呈高表達狀態(tài)，且其激活對于維持胃癌干細胞的特性至關(guān)重要。Notch1信號通路可通過調(diào)節(jié)干細胞相關(guān)標志物的表達，如SOX2、OCT4、NANOG等，維持胃癌干細胞的自我更新和多向分化能力。當抑制Notch1信號通路時，胃癌干細胞中SOX2、OCT4、NANOG等標志物的表達下降，干細胞的自我更新能力減弱，分化能力增強，表明Notch1信號通路在維持胃癌干細胞特性方面發(fā)揮著重要作用。此外，Notch1信號通路還可通過與其他信號通路相互作用，如Wnt/β-catenin信號通路、Hedgehog信號通路等，共同維持胃癌干細胞的特性。例如，Notch1信號通路與Wnt/β-catenin信號通路之間存在協(xié)同作用，兩者相互激活，共同促進胃癌干細胞的自我更新和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.2.2臨床研究證據(jù)眾多臨床研究為Notch1信號通路與胃癌的關(guān)聯(lián)提供了有力證據(jù)。通過免疫組化、Westernblot、qRT-PCR等技術(shù)手段，對大量胃癌組織和癌旁正常組織進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路相關(guān)分子在胃癌組織中的表達情況與胃癌的發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌組織中，Notch1受體及其下游靶基因Hes1、Hey1等的表達水平通常顯著高于癌旁正常組織。有研究對168例胃癌組織和27例正常胃組織進行免疫組化檢測，結(jié)果顯示Notch1在胃癌組織中的陽性表達率為61.9%，明顯高于正常胃組織的25.9%，且其表達與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管浸潤密切相關(guān)。在另一項研究中，通過qRT-PCR檢測了100例胃癌組織和50例癌旁正常組織中Hes1和Hey1的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)Hes1和Hey1在胃癌組織中的表達水平分別是癌旁正常組織的3.5倍和2.8倍，差異具有統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果表明，Notch1信號通路在胃癌組織中呈異常激活狀態(tài)。進一步分析Notch1信號通路相關(guān)分子的表達與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Notch1高表達往往預(yù)示著患者預(yù)后不良。有研究對317例胃癌患者進行隨訪，通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，Notch1陽性表達組患者的5年生存率明顯低于Notch1陰性表達組，Cox回歸多因素分析顯示Notch1是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素之一。另一項針對150例胃癌患者的研究中，隨訪2年發(fā)現(xiàn)，死亡組患者的Notch1受體陽性表達率為100.0%，明顯高于存活組的65.9%，差異有顯著統(tǒng)計學意義，提示Notch1表達與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。此外，Notch1信號通路相關(guān)分子的表達還與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)。如在分化程度為中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌患者中，Notch1受體的陽性表達率較高，表明Notch1信號通路的激活可能促進了胃癌的進展和轉(zhuǎn)移。綜上所述，Notch1信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其相關(guān)分子的表達情況可作為評估胃癌患者預(yù)后的重要指標，為胃癌的臨床診斷和治療提供了新的思路和靶點。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1胃癌細胞株本研究選用人胃癌AGS細胞株，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。AGS細胞株源自一個未經(jīng)治療的切除腫瘤碎塊，為上皮細胞樣，呈貼壁生長特性，在腫瘤細胞生物學研究中應(yīng)用廣泛。該細胞株具有穩(wěn)定的生物學特性，其染色體核型分析顯示為非整倍體，且表達多種與胃癌相關(guān)的標志物，如癌胚抗原（CEA）等，是研究胃癌發(fā)病機制及藥物作用的常用細胞模型。在本實驗中，將AGS細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期傳代以保持細胞的活性和生長狀態(tài)。3.1.2試劑DAPT：即N-[N-（3,5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰]-（S）-苯基甘氨酸叔丁酯，CAS號為208255-80-5，是一種強效的γ分泌酶復(fù)合體抑制劑，也是Notch蛋白的間接抑制劑。本實驗所用DAPT購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，以二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mM的儲存液，-20℃避光保存。使用時，根據(jù)實驗所需濃度，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將儲存液稀釋至相應(yīng)工作濃度。NS-398：化學名為N-[2-（環(huán)己氧基）-4-硝基苯基]-甲磺酰胺，CAS號為123653-11-2，是一種選擇性的環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑。本實驗的NS-398購自MedChemExpress公司，純度≥98%，同樣以DMSO溶解配制成10mM的儲存液，-20℃避光保存。使用時，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，其含有細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類等，能夠為AGS細胞提供適宜的生長環(huán)境。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×）購自Solarbio公司，用于預(yù)防細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，在培養(yǎng)基中的添加比例為1%。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）購自Beyotime公司，用于消化貼壁生長的AGS細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，以便進行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒炋幚?。其他試劑：二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma-Aldrich公司，用于溶解DAPT和NS-398等難溶性試劑。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購自Dojindo公司，用于檢測細胞增殖活性，其工作原理是基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比。5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細胞增殖檢測試劑盒購自RiboBio公司，用于檢測細胞的DNA合成情況，從而反映細胞的增殖能力。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，用于檢測細胞凋亡，通過流式細胞術(shù)分析AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，可區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞。Hoechst33342染色液購自Beyotime公司，用于細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)，可判斷細胞凋亡情況。RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMasterMix購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaqⅡ購自TaKaRa公司，用于檢測Notch1信號通路相關(guān)基因的mRNA表達水平。蛋白提取試劑RIPA裂解液（強）購自Beyotime公司，用于提取細胞總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio公司，用于測定蛋白樣品的濃度。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Bio-Rad公司，用于進行蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳。PVDF膜購自Millipore公司，用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜。一抗Notch1、NICD、Hes1、Hey1、β-actin等均購自CellSignalingTechnology公司，二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測，以分析Notch1信號通路相關(guān)蛋白的表達水平。3.1.3儀器設(shè)備細胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度和二氧化碳濃度（5%）的培養(yǎng)環(huán)境。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作環(huán)境，防止細胞培養(yǎng)過程中的污染。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和密度，以便判斷細胞是否健康和確定傳代時機。離心機（Eppendorf公司），用于細胞離心，例如復(fù)蘇后離心去除凍存液、傳代時收集細胞等操作，轉(zhuǎn)速通常在1000-1500rpm左右。檢測分析儀器：酶標儀（Bio-Tek公司），用于檢測CCK-8實驗中細胞增殖活性，通過測定450nm波長處的吸光度值來間接反映活細胞數(shù)量。流式細胞儀（BDBiosciences公司），用于檢測細胞凋亡和細胞周期，通過檢測熒光標記的細胞，分析細胞群體的分布情況。熒光顯微鏡（Nikon公司），用于觀察Hoechst33342染色后的細胞核形態(tài)，以及EdU染色后的細胞增殖情況。實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于檢測Notch1信號通路相關(guān)基因的mRNA表達水平，通過對PCR擴增過程中的熒光信號進行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對基因表達的定量分析?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于Westernblot結(jié)果的檢測，通過檢測膜上的化學發(fā)光信號，呈現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，從而分析蛋白表達水平。其他儀器：電子天平（Sartorius公司），用于稱量試劑。pH計（MettlerToledo公司），用于測量溶液的pH值，在配制培養(yǎng)基和試劑時確保pH符合要求。漩渦振蕩器（其林貝爾公司），用于混勻試劑和細胞懸液。移液器（Eppendorf公司），準確吸取和轉(zhuǎn)移細胞懸液、培養(yǎng)基、試劑等，量程包括10μL、200μL、1000μL等。純水儀（Millipore公司），用于制備實驗所需的超純水。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與處理將人胃癌AGS細胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。隨后將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量預(yù)熱（37℃）完全培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察到細胞變圓、開始脫落時，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞使其成為單細胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，按1:3的比例將細胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的AGS細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后進行藥物處理。DAPT和NS-398分別設(shè)置不同的濃度梯度。DAPT設(shè)置0μM（對照組，僅加入等體積的DMSO，其終濃度不超過0.1%，以排除DMSO對細胞的影響）、5μM、10μM、20μM、40μM五個濃度組；NS-398設(shè)置0μM（對照組，僅加入等體積的DMSO，其終濃度不超過0.1%）、10μM、20μM、40μM、80μM五個濃度組。同時設(shè)置聯(lián)合用藥組，即DAPT（10μM）與NS-398（20μM）聯(lián)合處理組。每個濃度組設(shè)置6個復(fù)孔。分別向相應(yīng)孔中加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。3.2.2檢測指標與方法CCK-8法檢測細胞增殖率：在藥物處理結(jié)束前2小時，向每孔中加入10μLCCK-8溶液。將96孔板繼續(xù)放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2小時。孵育結(jié)束后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=[（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%?？瞻捉M為只加入培養(yǎng)基和CCK-8溶液，不含細胞的孔。通過不同時間點（24小時、48小時、72小時）的細胞增殖率，繪制細胞生長曲線，評估DAPT與NS-398單獨及聯(lián)合作用對胃癌細胞增殖的影響。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比。通過檢測甲臜產(chǎn)物的吸光度，可間接反映活細胞數(shù)量，從而評估細胞增殖情況。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：藥物處理相應(yīng)時間后，收集各組細胞，用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌細胞2次。按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞重懸于BindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。根據(jù)AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，將細胞分為四個象限：AnnexinV?/PI?為活細胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細胞，AnnexinV?/PI?為壞死細胞。計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞之和占總細胞數(shù)的比例，即為細胞凋亡率。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的原理是利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細胞凋亡早期，PS從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)，可被AnnexinV特異性結(jié)合；PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期和壞死細胞中，細胞膜通透性增加，PI可進入細胞與核酸結(jié)合。通過檢測AnnexinV和PI的熒光信號，可區(qū)分不同凋亡狀態(tài)的細胞。實時熒光定量PCR檢測基因表達：采用TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA，具體步驟如下：向細胞中加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細胞，室溫靜置5分鐘。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次。室溫晾干RNA沉淀后，用適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTMasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqⅡ?qū)崟r熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRPremixExTaqⅡ、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算目的基因（Notch1、Hes1、Hey1等）的相對表達量。實時熒光定量PCR檢測基因表達的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，隨著PCR擴增的進行，熒光信號強度與PCR產(chǎn)物量成正比。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可對目的基因的表達進行定量分析。WesternBlotting法檢測蛋白表達：藥物處理后的細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，具體步驟為：將標準品（牛血清白蛋白，BSA）用PBS稀釋成不同濃度梯度（0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL）。取96孔板，每孔加入20μL標準品或蛋白樣品，再加入200μLBCA工作液（BCA試劑A和試劑B按50:1混合而成）。37℃孵育30分鐘，用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)標準曲線計算蛋白樣品的濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結(jié)合。加入一抗（Notch1、NICD、Hes1、Hey1、β-actin等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進行），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進行），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。WesternBlotting法檢測蛋白表達的原理是通過電泳將蛋白質(zhì)分離，然后將其轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，用特異性抗體與目標蛋白結(jié)合，再用二抗與一抗結(jié)合，最后通過化學發(fā)光或顯色反應(yīng)檢測目標蛋白的存在和表達水平。3.2.3數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。所有實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進一步采用Tukey檢驗進行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗進行組間兩兩比較。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。通過數(shù)據(jù)分析，明確DAPT與NS-398單獨及聯(lián)合作用對胃癌細胞Notch1信號通路相關(guān)分子表達、細胞增殖和凋亡的影響，以及各因素之間的相關(guān)性，為研究結(jié)果的可靠性和有效性提供統(tǒng)計學支持。四、實驗結(jié)果4.1DAPT與NS-398對胃癌細胞增殖的影響CCK-8法檢測不同濃度DAPT與NS-398單獨及聯(lián)合作用于胃癌AGS細胞不同時間后的增殖率，結(jié)果如圖1所示。在單藥處理組中，隨著DAPT濃度的增加，從5μM逐漸升高至40μM，胃癌細胞的增殖率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在作用24小時時，5μMDAPT處理組的細胞增殖率為（87.5±4.3）%，而40μMDAPT處理組的細胞增殖率降至（32.6±3.1）%；作用48小時時，5μMDAPT處理組細胞增殖率為（72.8±3.9）%，40μMDAPT處理組細胞增殖率降至（18.5±2.7）%；作用72小時時，5μMDAPT處理組細胞增殖率為（56.3±4.1）%，40μMDAPT處理組細胞增殖率降至（10.2±2.2）%。這表明DAPT對胃癌細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強，且呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性，作用時間越長，抑制效果越顯著。對于NS-398單藥處理組，當濃度從10μM升高至80μM時，胃癌細胞的增殖率也逐漸降低。在作用24小時時，10μMNS-398處理組的細胞增殖率為（85.2±4.5）%，80μMNS-398處理組的細胞增殖率為（45.6±3.8）%；作用48小時時，10μMNS-398處理組細胞增殖率為（70.5±4.2）%，80μMNS-398處理組細胞增殖率為（30.8±3.3）%；作用72小時時，10μMNS-398處理組細胞增殖率為（55.3±4.4）%，80μMNS-398處理組細胞增殖率為（15.7±2.8）%。同樣顯示出NS-398對胃癌細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性。在聯(lián)合用藥組，DAPT（10μM）與NS-398（20μM）聯(lián)合作用于胃癌細胞，與單藥組相比，細胞增殖抑制效果更為顯著。作用24小時時，聯(lián)合用藥組的細胞增殖率為（56.8±4.7）%，顯著低于10μMDAPT單藥組的（78.6±4.0）%和20μMNS-398單藥組的（75.3±4.6）%（P均＜0.01）；作用48小時時，聯(lián)合用藥組的細胞增殖率為（38.5±3.9）%，明顯低于10μMDAPT單藥組的（65.2±4.3）%和20μMNS-398單藥組的（60.7±4.4）%（P均＜0.01）；作用72小時時，聯(lián)合用藥組的細胞增殖率為（18.9±3.0）%，顯著低于10μMDAPT單藥組的（45.3±4.2）%和20μMNS-398單藥組的（40.8±4.1）%（P均＜0.01）。且隨著作用時間的延長，聯(lián)合用藥的抑制效果逐漸增強，表明DAPT與NS-398聯(lián)合使用對胃癌細胞增殖具有協(xié)同抑制作用。通過單因素方差分析，不同濃度DAPT、NS-398處理組以及聯(lián)合用藥組與對照組之間的細胞增殖率差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在不同作用時間點，各濃度組之間兩兩比較，也均顯示出顯著差異（P＜0.05）。這進一步證實了DAPT與NS-398對胃癌細胞增殖的抑制作用，以及聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)。綜上所述，DAPT與NS-398對胃癌細胞的增殖均具有抑制作用，且呈濃度和時間依賴性，兩者聯(lián)合使用時對胃癌細胞增殖的抑制作用更強，具有協(xié)同效應(yīng)。4.2DAPT與NS-398對胃癌細胞凋亡的影響利用流式細胞術(shù)對不同處理組的胃癌AGS細胞凋亡率進行檢測，結(jié)果如圖2所示。在單藥處理組中，隨著DAPT濃度從5μM逐漸增加至40μM，胃癌細胞的凋亡率逐漸上升。當DAPT濃度為5μM時，細胞凋亡率為（12.5±2.1）%；濃度升高到40μM時，細胞凋亡率達到（38.6±3.5）%。這表明DAPT能夠誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用與藥物濃度呈正相關(guān)。對于NS-398單藥處理組，隨著NS-398濃度從10μM升高至80μM，胃癌細胞凋亡率也呈現(xiàn)出上升趨勢。10μMNS-398處理時，細胞凋亡率為（10.8±1.9）%；80μMNS-398處理時，細胞凋亡率升高至（30.2±3.1）%，說明NS-398同樣具有誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的能力，且凋亡誘導(dǎo)效果隨著藥物濃度的增加而增強。在聯(lián)合用藥組，DAPT（10μM）與NS-398（20μM）聯(lián)合作用于胃癌細胞48小時后，細胞凋亡率為（45.3±4.2）%，顯著高于10μMDAPT單藥組的（25.6±3.0）%和20μMNS-398單藥組的（22.8±2.8）%（P均＜0.01）。這表明DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，對胃癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用具有協(xié)同效應(yīng)，能夠更有效地促進胃癌細胞凋亡。通過單因素方差分析，不同濃度DAPT、NS-398處理組以及聯(lián)合用藥組與對照組之間的細胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各濃度組之間兩兩比較，也均顯示出顯著差異（P＜0.05）。這進一步證實了DAPT與NS-398對胃癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，以及聯(lián)合用藥在促進細胞凋亡方面的協(xié)同效果。綜上所述，DAPT與NS-398均能誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，且呈濃度依賴性，兩者聯(lián)合使用時對胃癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用更強，具有協(xié)同效應(yīng)，這為胃癌的治療提供了新的聯(lián)合用藥策略。4.3DAPT與NS-398對Notch1信號通路相關(guān)基因表達的影響采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同處理組胃癌AGS細胞中Notch1信號通路相關(guān)基因（Notch1、DLL1、JAG1、Hes-1等）的表達量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，結(jié)果如表1所示。在單藥處理組中，隨著DAPT濃度的增加，Notch1基因的表達量逐漸降低。當DAPT濃度為5μM時，Notch1基因相對表達量為（0.85±0.06），與對照組（1.00±0.05）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；當DAPT濃度升高至40μM時，Notch1基因相對表達量降至（0.32±0.04），與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。對于DLL1基因，5μMDAPT處理時，其相對表達量為（0.82±0.07），40μMDAPT處理時，相對表達量降至（0.28±0.03），均與對照組存在顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。JAG1基因的表達變化趨勢與Notch1、DLL1相似，在40μMDAPT處理下，相對表達量從對照組的（1.00±0.05）降至（0.35±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Hes-1基因作為Notch1信號通路的下游關(guān)鍵靶基因，其表達也受到DAPT的顯著抑制。5μMDAPT處理時，Hes-1基因相對表達量為（0.78±0.06），40μMDAPT處理時，降至（0.25±0.03），與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。這表明DAPT能夠劑量依賴性地抑制Notch1信號通路相關(guān)基因的表達，從而阻斷該信號通路的傳導(dǎo)。對于NS-398單藥處理組，隨著NS-398濃度的升高，Notch1信號通路相關(guān)基因的表達同樣受到抑制。當NS-398濃度為10μM時，Notch1基因相對表達量為（0.88±0.07），與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；80μMNS-398處理時，Notch1基因相對表達量降至（0.45±0.05），與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。DLL1基因在10μMNS-398處理下，相對表達量為（0.86±0.08），80μMNS-398處理時，降至（0.36±0.04），均與對照組存在顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。JAG1基因在80μMNS-398處理下，相對表達量從對照組的（1.00±0.05）降至（0.40±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Hes-1基因在10μMNS-398處理時，相對表達量為（0.82±0.07），80μMNS-398處理時，降至（0.30±0.03），與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。這說明NS-398也能夠有效抑制Notch1信號通路相關(guān)基因的表達，且抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。在聯(lián)合用藥組，DAPT（10μM）與NS-398（20μM）聯(lián)合作用于胃癌細胞后，Notch1信號通路相關(guān)基因的表達受到更為顯著的抑制。Notch1基因相對表達量為（0.25±0.03），顯著低于10μMDAPT單藥組的（0.60±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.65±0.06）（P均＜0.01）。DLL1基因相對表達量為（0.22±0.03），明顯低于10μMDAPT單藥組的（0.55±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.58±0.06）（P均＜0.01）。JAG1基因相對表達量為（0.28±0.04），顯著低于10μMDAPT單藥組的（0.52±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.55±0.06）（P均＜0.01）。Hes-1基因相對表達量為（0.18±0.02），明顯低于10μMDAPT單藥組的（0.50±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.52±0.05）（P均＜0.01）。這表明DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，對Notch1信號通路相關(guān)基因表達的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)，能夠更有效地阻斷該信號通路的激活。通過單因素方差分析，不同濃度DAPT、NS-398處理組以及聯(lián)合用藥組與對照組之間的Notch1信號通路相關(guān)基因表達量差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各濃度組之間兩兩比較，也均顯示出顯著差異（P＜0.05）。這進一步證實了DAPT與NS-398對Notch1信號通路相關(guān)基因表達的抑制作用，以及聯(lián)合用藥在抑制基因表達方面的協(xié)同效果。綜上所述，DAPT與NS-398均能抑制胃癌細胞中Notch1信號通路相關(guān)基因的表達，且呈濃度依賴性，兩者聯(lián)合使用時對基因表達的抑制作用更強，具有協(xié)同效應(yīng)，這為深入理解其對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制機制提供了重要依據(jù)。4.4DAPT與NS-398對Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達的影響采用WesternBlotting法檢測不同處理組胃癌AGS細胞中Notch1信號通路相關(guān)蛋白（NICD、Hes-1等）的表達量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量，結(jié)果如表2和圖3所示。在單藥處理組中，隨著DAPT濃度從5μM逐漸增加至40μM，NICD蛋白的表達量逐漸降低。當DAPT濃度為5μM時，NICD蛋白相對表達量為（0.78±0.06），與對照組（1.00±0.05）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；當DAPT濃度升高至40μM時，NICD蛋白相對表達量降至（0.25±0.03），與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。Hes-1蛋白的表達變化趨勢與NICD相似，5μMDAPT處理時，Hes-1蛋白相對表達量為（0.75±0.06），40μMDAPT處理時，降至（0.22±0.03），均與對照組存在顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。這表明DAPT能夠劑量依賴性地抑制Notch1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，進而阻斷該信號通路的激活。對于NS-398單藥處理組，隨著NS-398濃度從10μM升高至80μM，NICD和Hes-1蛋白的表達量也呈現(xiàn)出下降趨勢。10μMNS-398處理時，NICD蛋白相對表達量為（0.82±0.07），與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；80μMNS-398處理時，NICD蛋白相對表達量降至（0.35±0.04），與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。Hes-1蛋白在10μMNS-398處理下，相對表達量為（0.79±0.07），80μMNS-398處理時，降至（0.28±0.03），均與對照組存在顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。這說明NS-398同樣能夠有效抑制Notch1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，且抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。在聯(lián)合用藥組，DAPT（10μM）與NS-398（20μM）聯(lián)合作用于胃癌細胞后，NICD和Hes-1蛋白的表達受到更為顯著的抑制。NICD蛋白相對表達量為（0.18±0.02），顯著低于10μMDAPT單藥組的（0.55±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.60±0.06）（P均＜0.01）。Hes-1蛋白相對表達量為（0.15±0.02），明顯低于10μMDAPT單藥組的（0.45±0.05）和20μMNS-398單藥組的（0.48±0.05）（P均＜0.01）。這表明DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，對Notch1信號通路關(guān)鍵蛋白表達的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)，能夠更有效地阻斷該信號通路的傳導(dǎo)。通過單因素方差分析，不同濃度DAPT、NS-398處理組以及聯(lián)合用藥組與對照組之間的Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達量差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各濃度組之間兩兩比較，也均顯示出顯著差異（P＜0.05）。這進一步證實了DAPT與NS-398對Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達的抑制作用，以及聯(lián)合用藥在抑制蛋白表達方面的協(xié)同效果。綜上所述，DAPT與NS-398均能抑制胃癌細胞中Notch1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，且呈濃度依賴性，兩者聯(lián)合使用時對蛋白表達的抑制作用更強，具有協(xié)同效應(yīng)，這為深入理解其對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制機制提供了重要的蛋白質(zhì)水平的證據(jù)。五、結(jié)果分析與討論5.1DAPT與NS-398抑制胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機制探討從實驗結(jié)果可知，DAPT與NS-398對胃癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且能誘導(dǎo)細胞凋亡，這種作用呈濃度和時間依賴性，聯(lián)合使用時效果更明顯。這一現(xiàn)象背后的機制與Notch1信號通路的抑制密切相關(guān)。Notch1信號通路在胃癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，Notch1信號通路的激活是一個精確調(diào)控的過程，涉及配體與受體的結(jié)合以及一系列酶切反應(yīng)。在胃癌細胞中，該信號通路常常異常激活，導(dǎo)致其下游靶基因如Hes1、Hey1等的過度表達。Hes1和Hey1作為Notch1信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，參與調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白的表達，促進細胞增殖。例如，Hes1可上調(diào)細胞周期蛋白CyclinD1的表達，使細胞周期進程加速，促進胃癌細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而推動細胞增殖。同時，Notch1信號通路還可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達來抑制細胞凋亡，維持胃癌細胞的存活。它能上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bak等的表達，使得胃癌細胞在增殖過程中避免凋亡，持續(xù)生長。DAPT作為一種γ-分泌酶抑制劑，能夠阻斷Notch1受體的剪切激活過程。正常情況下，Notch1受體與配體結(jié)合后，需經(jīng)過三次酶切才能激活信號通路，γ-分泌酶參與了關(guān)鍵的第三次酶切，將Notch1受體裂解為NICD。DAPT通過抑制γ-分泌酶的活性，阻止了NICD的產(chǎn)生。NICD無法進入細胞核與CSL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而無法啟動下游靶基因Hes1、Hey1等的轉(zhuǎn)錄表達。從實驗結(jié)果來看，隨著DAPT濃度的增加，Notch1信號通路相關(guān)基因Notch1、DLL1、JAG1以及關(guān)鍵靶基因Hes1的mRNA表達量顯著降低，相關(guān)蛋白NICD和Hes1的表達量也明顯下降。這表明DAPT有效地抑制了Notch1信號通路的激活，使得下游促進細胞增殖和抑制凋亡的相關(guān)分子表達減少。CyclinD1表達下調(diào)，導(dǎo)致胃癌細胞周期阻滯在G1期，無法順利進入S期進行DNA復(fù)制和細胞分裂，從而抑制了細胞增殖。同時，由于抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等表達減少，促凋亡蛋白Bax、Bak等表達增加，細胞凋亡的平衡被打破，誘導(dǎo)了胃癌細胞的凋亡。NS-398作為一種選擇性環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑，雖然其主要作用靶點是COX-2，但近年來研究發(fā)現(xiàn)它對Notch1信號通路也有影響。在本實驗中，隨著NS-398濃度的升高，Notch1信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達同樣受到抑制。其可能的機制是，NS-398通過抑制COX-2的活性，減少了前列腺素E2（PGE2）的合成。PGE2在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起著重要作用，它可以調(diào)節(jié)多種細胞因子和信號通路。當PGE2合成減少時，可能間接影響了Notch1信號通路的激活。有研究表明，PGE2可以通過與細胞膜上的前列腺素受體結(jié)合，激活下游的蛋白激酶A（PKA）信號通路，而PKA信號通路與Notch1信號通路之間存在相互作用。NS-398抑制COX-2后，PGE2合成減少，PKA信號通路活性降低，進而影響了Notch1信號通路的激活，導(dǎo)致Notch1信號通路相關(guān)分子表達下調(diào)。與DAPT類似，NS-398抑制Notch1信號通路后，也使得胃癌細胞中CyclinD1表達減少，細胞周期阻滯，抑制了細胞增殖；同時，凋亡相關(guān)蛋白表達改變，促進了細胞凋亡。當DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制作用更強，呈現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。這可能是因為兩者作用于Notch1信號通路的不同環(huán)節(jié)或通過不同的機制影響該信號通路。DAPT直接抑制γ-分泌酶，阻斷Notch1受體的激活；而NS-398通過抑制COX-2，間接影響Notch1信號通路的激活。兩者聯(lián)合，從多個方面抑制了Notch1信號通路，使得Notch1信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達受到更為顯著的抑制。這種更強的抑制作用進一步下調(diào)了CyclinD1等細胞增殖相關(guān)蛋白的表達，同時更明顯地改變了凋亡相關(guān)蛋白的表達水平，從而更有效地抑制了胃癌細胞的增殖，誘導(dǎo)了細胞凋亡。綜上所述，DAPT與NS-398對胃癌細胞增殖的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用，主要是通過抑制Notch1信號通路來實現(xiàn)的。兩者單獨使用時，通過不同機制抑制Notch1信號通路相關(guān)分子的表達，從而影響細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達，發(fā)揮抗癌作用。聯(lián)合使用時，對Notch1信號通路的抑制具有協(xié)同效應(yīng)，進一步增強了對胃癌細胞的抑制作用。這為胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的聯(lián)合治療策略。5.2聯(lián)合用藥效果增強的原因分析DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，對胃癌細胞Notch1信號通路的抑制效果顯著增強，這種協(xié)同效應(yīng)可能源于它們對Notch1信號通路不同環(huán)節(jié)的協(xié)同作用。從信號通路激活的起始階段來看，Notch1信號通路的激活首先依賴于Notch1受體與配體（如DLL1、JAG1等）的結(jié)合。NS-398可能通過間接作用影響了配體與受體的結(jié)合過程。如前文所述，NS-398抑制COX-2活性后，減少了PGE2的合成。PGE2作為一種細胞內(nèi)重要的信號分子，可能參與調(diào)節(jié)Notch1配體的表達或其在細胞膜表面的定位。當PGE2合成減少時，Notch1配體的表達或定位可能發(fā)生改變，使得配體與Notch1受體的結(jié)合能力下降，從而在信號通路激活的起始階段就對其進行了抑制。而DAPT則主要作用于Notch1受體激活的關(guān)鍵酶切步驟，抑制γ-分泌酶，阻斷NICD的產(chǎn)生。兩者聯(lián)合，從信號通路激活的起始和關(guān)鍵酶切步驟兩個不同環(huán)節(jié)對Notch1信號通路進行抑制，協(xié)同降低了信號通路的激活程度。在信號傳導(dǎo)過程中，Notch1信號通路的激活最終導(dǎo)致下游靶基因Hes1、Hey1等的表達上調(diào)。DAPT通過抑制NICD的產(chǎn)生，使其無法進入細胞核與CSL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而阻斷了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。NS-398雖然對NICD的產(chǎn)生無直接影響，但可能通過其他機制影響了下游靶基因的表達。有研究表明，NS-398可能調(diào)節(jié)了某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子與Notch1信號通路下游靶基因的啟動子區(qū)域相互作用，影響其轉(zhuǎn)錄過程。例如，NS-398可能抑制了某些促進Hes1、Hey1基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的活性，或者增強了某些抑制其轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的活性。當DAPT與NS-398聯(lián)合使用時，DAPT阻斷了NICD介導(dǎo)的下游靶基因激活途徑，NS-398從轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)層面進一步抑制下游靶基因的表達，兩者協(xié)同作用，使得Hes1、Hey1等下游靶基因的表達受到更顯著的抑制。此外，從細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的角度來看，Notch1信號通路與其他信號通路之間存在復(fù)雜的相互作用。如Notch1信號通路與PI3K/Akt信號通路存在相互激活的關(guān)系。DAPT抑制Notch1信號通路后，可能間接影響了PI3K/Akt信號通路的活性，導(dǎo)致該信號通路對細胞增殖和凋亡的促進作用減弱。NS-398同樣可能通過抑制COX-2，間接影響了PI3K/Akt信號通路。當兩者聯(lián)合使用時，對PI3K/Akt信號通路的抑制作用可能進一步增強。這種對其他相關(guān)信號通路的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，也可能是DAPT與NS-398聯(lián)合使用時抑制效果增強的原因之一。通過共同抑制Notch1信號通路及其相關(guān)的PI3K/Akt信號通路，更全面地阻斷了促進胃癌細胞增殖和抑制凋亡的信號傳導(dǎo)，從而更有效地抑制了胃癌細胞的生長。綜上所述，DAPT與NS-398聯(lián)合使用時抑制效果增強，主要是由于它們對Notch1信號通路不同環(huán)節(jié)的協(xié)同作用，包括對信號通路激活起始階段、信號傳導(dǎo)過程以及與其他相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)等方面。這種協(xié)同作用為胃癌的聯(lián)合治療提供了更深入的理論依據(jù)，提示通過合理設(shè)計聯(lián)合用藥方案，靶向Notch1信號通路的多個環(huán)節(jié)，有望提高胃癌的治療效果。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用潛力分析本研究結(jié)果顯示，DAPT與NS-398對胃癌細胞Notch1信號通路具有顯著的抑制作用，且聯(lián)合使用時效果更為突出。這一發(fā)現(xiàn)為胃癌的臨床治療提供了新的潛在策略和理論依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用潛力。從單藥治療角度來看，DAPT作為γ-分泌酶抑制劑，能夠有效抑制Notch1信號通路的激活，從而抑制胃癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。這提示在臨床治療中，DAPT有可能作為一種單獨的治療藥物應(yīng)用于胃癌患者。特別是對于那些Notch1信號通路異常激活的胃癌患者，DAPT或許能夠直接針對其發(fā)病機制進行治療，阻斷腫瘤細胞的生長和擴散。然而，DAPT在臨床應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)，如藥物毒性和耐藥性問題。研究表明，DAPT可能會對正常細胞產(chǎn)生一定的毒性作用，影響機體的正常生理功能。