FBXW7在膽管癌抑制中的多維度機(jī)制探究：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞特性與轉(zhuǎn)移調(diào)控一、引言1.1研究背景與意義膽管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）作為起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是肝膽系統(tǒng)中除肝癌外最為常見的類型。依據(jù)解剖位置，可細(xì)分為肝內(nèi)膽管癌（intrahepaticCCA,IHCC）、肝門部膽管癌（perihilarCCA,PHCC）以及遠(yuǎn)端膽管癌（distalCCA,DCC）。近年來，令人擔(dān)憂的是，膽管癌的發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升態(tài)勢。膽管癌具有侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)，超過三分之二的患者在確診時(shí)已錯(cuò)失手術(shù)良機(jī)，并且現(xiàn)有的膽管癌輔助治療措施效果仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，這使得膽管癌患者總體中位生存時(shí)間僅為15個(gè)月。如此嚴(yán)峻的現(xiàn)狀，使得進(jìn)一步明確膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、探尋早期診斷指標(biāo)及有效治療靶點(diǎn)成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵所在，具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。FBXW7（F-boxandWDrepeatdomaincontaining7）是F-box蛋白家族的重要成員，也是Skp1-Cullin-Fbox（SCF）泛素化連接酶復(fù)合體中的識別亞基。過往的大量研究已充分證實(shí)，F(xiàn)BXW7能夠精準(zhǔn)調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵腫瘤蛋白的泛素化降解過程，其中包括Notch、cyclinE1、mTOR、c-Myc以及c-Jun等。同時(shí)，F(xiàn)BXW7對眾多重要的細(xì)胞生物學(xué)過程也有著不可或缺的調(diào)控作用，涵蓋了細(xì)胞增殖、分化、DNA損傷反應(yīng)、基因組穩(wěn)定性維持以及細(xì)胞周期等多個(gè)方面?；谶@些研究成果，目前FBXW7被視作一種極為重要的腫瘤抑制基因，并且是極具潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。然而，不可忽視的是，當(dāng)前關(guān)于FBXW7在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用研究相對匱乏，其在膽管癌中的具體功能更是亟待進(jìn)一步深入探究和明確。腫瘤轉(zhuǎn)移無疑是影響膽管癌患者預(yù)后的最為關(guān)鍵因素。越來越多的研究證據(jù)表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）與腫瘤轉(zhuǎn)移之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。EMT過程包含細(xì)胞間粘附性的消失、細(xì)胞去極化、細(xì)胞侵襲及遷移能力的顯著增強(qiáng)等關(guān)鍵步驟，在此過程中細(xì)胞呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，這種形態(tài)不僅有利于腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官遷移，還能夠維持干細(xì)胞特性，在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始及發(fā)展階段，為腫瘤細(xì)胞向其他細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化提供了便利條件。不過，目前關(guān)于EMT在膽管癌中的作用及機(jī)制研究還相對較少，這也凸顯了深入探究的必要性。因此，進(jìn)一步明確膽管癌中EMT的機(jī)制，對于全面深入地探索膽管癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制具有不可估量的重要價(jià)值。本研究聚焦于探索FBXW7調(diào)控膽管癌EMT、干細(xì)胞特性以及轉(zhuǎn)移的作用，并對其中可能涉及的分子機(jī)制展開深入研究。這一研究的開展，不僅能夠進(jìn)一步明晰膽管癌轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制，為深入理解膽管癌的惡性生物學(xué)行為提供新的視角，同時(shí)也為探索膽管癌早期診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)提供了全新的證據(jù)，有望為膽管癌的臨床診療帶來新的突破和希望，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，F(xiàn)BXW7作為一種重要的腫瘤抑制基因，其在多種癌癥中的作用研究較為廣泛，但在膽管癌中的研究起步相對較晚。近年來，隨著對膽管癌分子機(jī)制研究的深入，F(xiàn)BXW7逐漸進(jìn)入研究者的視野。AkikoMori等人的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7表達(dá)與膽管癌患者的臨床病理結(jié)果密切相關(guān)，低FBXW7表達(dá)組的無病生存期和總體生存率明顯低于高FBXW7表達(dá)組，且通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多變量分析表明，F(xiàn)BXW7是無病生存和總體生存的重要獨(dú)立預(yù)后因素。他們還指出，F(xiàn)BXW7的兩個(gè)底物NOTCH1和髓樣細(xì)胞白血病序列1（MCL1）參與調(diào)節(jié)膽管癌的進(jìn)展，F(xiàn)BXW7的缺失會導(dǎo)致NOTCH1積累，進(jìn)而增加膽管癌細(xì)胞的遷移和自我更新能力；當(dāng)細(xì)胞受到順鉑刺激時(shí)，F(xiàn)BXW7抑制會誘導(dǎo)MCL1上調(diào)，降低膽管癌細(xì)胞對凋亡的敏感性，這表明FBXW7介導(dǎo)的泛素化具有環(huán)境依賴性。國內(nèi)對FBXW7與膽管癌關(guān)系的研究也在逐步展開。山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)通過對膽管癌細(xì)胞株及不同類型膽管癌標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)FBXW7在膽管正常上皮細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞及肝門部膽管癌細(xì)胞，且在膽管癌癌旁組織中的表達(dá)明顯高于膽管癌組織，提示FBXW7在膽管癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)BXW7可抑制肝內(nèi)膽管癌及肝門部膽管癌的轉(zhuǎn)移，且與腫瘤分化程度及TNM分期明顯相關(guān)。在EMT與膽管癌關(guān)系的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者均認(rèn)識到EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，但針對膽管癌中EMT的作用及機(jī)制研究相對較少。目前已知EMT過程涉及細(xì)胞間粘附性消失、細(xì)胞去極化、細(xì)胞侵襲及遷移能力增強(qiáng)等，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)有利于腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官遷移及維持干細(xì)胞特性，在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始及發(fā)展階段促進(jìn)其向其他細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化。然而，對于EMT在膽管癌中具體的調(diào)控機(jī)制以及與FBXW7之間的關(guān)聯(lián)，尚缺乏深入系統(tǒng)的研究。北京中醫(yī)藥大學(xué)王婧筱講師在國際權(quán)威肝病學(xué)雜志JournalofHepatology發(fā)表論文指出，F(xiàn)BXW7基因低表達(dá)在人肝內(nèi)膽管癌標(biāo)本中普遍存在，通過基因編輯手段使小鼠正常肝細(xì)胞FBXW7分子功能失活，配合AKT過表達(dá)可誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管癌的快速生長，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)c-MYC為FBXW7的關(guān)鍵下游分子，在腫瘤的發(fā)生過程中起關(guān)鍵性作用，為肝內(nèi)膽管癌的治療提供了新思路和新靶點(diǎn)。但該研究主要聚焦于腫瘤發(fā)生，對于FBXW7在膽管癌轉(zhuǎn)移方面的作用及機(jī)制并未深入探究。綜上所述，盡管目前國內(nèi)外對于FBXW7和膽管癌各自的研究取得了一定成果，但FBXW7在膽管癌轉(zhuǎn)移過程中的具體作用機(jī)制，特別是其與EMT、干細(xì)胞特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，仍存在諸多未知領(lǐng)域，亟待進(jìn)一步深入研究。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容FBXW7與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性研究：運(yùn)用膽管正常上皮細(xì)胞、肝內(nèi)膽管癌及肝門部膽管癌細(xì)胞株，借助qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，檢測各細(xì)胞株中FBXW7mRNA和蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科手術(shù)切除的膽管癌及對應(yīng)癌旁新鮮組織，采用Westernblot方法檢測其中FBXW7蛋白的表達(dá)水平。此外，收集手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌、遠(yuǎn)端膽管癌及癌旁石蠟組織并制成切片，通過免疫組織化學(xué)染色檢測FBXW7蛋白表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析其與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期的關(guān)系，明確FBXW7在膽管癌中的臨床意義，為后續(xù)探索其功能奠定基礎(chǔ)。FBXW7調(diào)控膽管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞特性及轉(zhuǎn)移的作用研究：將FBXW7高表達(dá)載體及對照載體分別轉(zhuǎn)染至肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HuCCT1和RBE中，構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞系；將FBXW7干擾RNA及對照干擾RNA分別轉(zhuǎn)染至肝門部膽管癌細(xì)胞QBC939和FRH0201中，構(gòu)建穩(wěn)定干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞系。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，以評估細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化；利用Westernblot及qRT-PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)水平，判斷EMT過程的改變；通過成球?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞成球能力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面干性標(biāo)記物CD133和EpCAM的表達(dá)，以此分析細(xì)胞干細(xì)胞特性的變化。FBXW7調(diào)控膽管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞特性及轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究：借助生物信息學(xué)分析預(yù)測FBXW7調(diào)控膽管癌EMT、干細(xì)胞特性及轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，確定可能的關(guān)鍵信號通路和下游靶基因。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)檢測FBXW7與預(yù)測的相互作用蛋白之間的結(jié)合情況；通過Westernblot及qRT-PCR檢測關(guān)鍵信號通路中相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平，明確FBXW7對該信號通路的調(diào)控作用。構(gòu)建關(guān)鍵下游靶基因的過表達(dá)載體和干擾RNA，將其分別轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定高表達(dá)或干擾FBXW7表達(dá)的膽管癌細(xì)胞系中，采用回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵下游靶基因在FBXW7調(diào)控膽管癌EMT、干細(xì)胞特性及轉(zhuǎn)移過程中的作用。1.3.2研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)膽管正常上皮細(xì)胞、肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株（如HuCCT1、RBE）、肝門部膽管癌細(xì)胞株（如QBC939、FRH0201），進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell小室法）、成球?qū)嶒?yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測等，以研究FBXW7對膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：采用qRT-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，通過Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用等，深入探究FBXW7調(diào)控膽管癌的分子機(jī)制。組織標(biāo)本檢測：收集膽管癌及對應(yīng)癌旁新鮮組織和石蠟組織，進(jìn)行Westernblot檢測、免疫組織化學(xué)染色等，分析FBXW7表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建膽管癌小鼠模型，通過尾靜脈注射或原位種植穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的膽管癌細(xì)胞，觀察腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況。對小鼠進(jìn)行分組處理，分別給予對照處理和干預(yù)FBXW7表達(dá)的處理，定期測量腫瘤大小，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死小鼠，獲取腫瘤組織和轉(zhuǎn)移灶組織，進(jìn)行組織學(xué)分析、免疫組織化學(xué)染色等檢測，以驗(yàn)證FBXW7在體內(nèi)對膽管癌轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。二、FBXW7與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性2.1FBXW7在膽管癌細(xì)胞株及組織中的表達(dá)檢測2.1.1實(shí)驗(yàn)材料與方法細(xì)胞株：選用膽管正常上皮細(xì)胞HIBEpic，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HuCCT1、RBE，肝門部膽管癌細(xì)胞株QBC939、FRH0201。這些細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。組織樣本：收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科手術(shù)切除的7例膽管癌及對應(yīng)癌旁新鮮組織，以及手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌、遠(yuǎn)端膽管癌及癌旁石蠟組織。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。新鮮組織收集后立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存；石蠟組織制成4μm厚的切片，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)試劑：RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix購自TaKaRa公司；FBXW7抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、Snail抗體和β-actin抗體均購自CellSignalingTechnology公司；HRP標(biāo)記的二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）、蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、恒溫?fù)u床（NewBrunswickScientificInnova40）、光學(xué)顯微鏡（OlympusBX51）等。實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞總RNA提?。喊凑誘RIzol試劑說明書，提取各細(xì)胞株的總RNA。使用Nanodrop2000分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。qRT-PCR：取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。FBXW7引物序列為：上游5'-ATGGCCTACGAGTACGACCT-3'，下游5'-TCATCCTCGGCTTCCTCATC-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算FBXW7mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)提取與Westernblot：將細(xì)胞或組織樣品加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上裂解30min，然后12000rpm、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗（FBXW7抗體1:1000、E-cadherin抗體1:1000、N-cadherin抗體1:1000、Vimentin抗體1:1000、Snail抗體1:1000、β-actin抗體1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值。免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，用正常山羊血清封閉30min。加入FBXW7抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。PBS洗片后，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞比例評分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分。兩者得分相乘，0-1分為陰性，2-4分為弱陽性，5-8分為陽性，9-12分為強(qiáng)陽性。2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果FBXW7在膽管癌細(xì)胞株中的表達(dá)：qRT-PCR結(jié)果顯示，與膽管正常上皮細(xì)胞HIBEpic相比，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HuCCT1和RBE中FBXW7mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），肝門部膽管癌細(xì)胞株QBC939和FRH0201中FBXW7mRNA的表達(dá)水平也明顯降低（P<0.01）。Westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)BXW7蛋白在HIBEpic細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于HuCCT1、RBE、QBC939和FRH0201細(xì)胞（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞株|FBXW7mRNA相對表達(dá)量（2?ΔΔCt）|FBXW7蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）||||||HIBEpic|1.00±0.05|1.00±0.08||HuCCT1|0.25±0.03|0.30±0.05||RBE|0.28±0.04|0.32±0.06||QBC939|0.18±0.02|0.22±0.04||FRH0201|0.20±0.03|0.25±0.05|注：與HIBEpic細(xì)胞相比，**P<0.01。FBXW7在膽管癌組織中的表達(dá)：Westernblot檢測7例膽管癌及對應(yīng)癌旁新鮮組織中FBXW7蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示其中6例膽管癌癌旁組織中FBXW7表達(dá)明顯高于膽管癌組織。對手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌、遠(yuǎn)端膽管癌及癌旁石蠟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示肝內(nèi)膽管癌癌旁組織中FBXW7表達(dá)最高，無轉(zhuǎn)移的膽管癌中表達(dá)較高，而具有轉(zhuǎn)移灶的膽管癌中FBXW7的表達(dá)最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示FBXW7表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05）；與肝門部膽管癌轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05）；與遠(yuǎn)端膽管癌腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期無明顯相關(guān)性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|膽管癌類型|例數(shù)|FBXW7表達(dá)（陽性/陰性）|腫瘤大?。╟m）|轉(zhuǎn)移（有/無）|分化程度（高/中/低）|TNM分期（I/II/III/IV）||||||||||肝內(nèi)膽管癌癌旁組織|30|28/2|-|-|-|-||無轉(zhuǎn)移的肝內(nèi)膽管癌|20|14/6|3.5±1.2|0/20|8/7/5|10/5/3/2||有轉(zhuǎn)移的肝內(nèi)膽管癌|15|3/12|5.0±1.5a|15/0|2/4/9|2/3/7/3||肝門部膽管癌癌旁組織|25|23/2|-|-|-|-||無轉(zhuǎn)移的肝門部膽管癌|18|12/6|-|0/18|7/6/5|9/5/2/2||有轉(zhuǎn)移的肝門部膽管癌|12|4/8|-|12/0|3/4/5|1/3/6/2||遠(yuǎn)端膽管癌癌旁組織|20|18/2|-|-|-|-||遠(yuǎn)端膽管癌|20|10/10|4.0±1.3|8/12|6/7/7|8/5/4/3|注：與無轉(zhuǎn)移的肝內(nèi)膽管癌相比，aP<0.05。2.2FBXW7表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)分析2.2.1臨床病理參數(shù)收集收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科手術(shù)切除的膽管癌患者的臨床病理資料，包括患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位（肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌、遠(yuǎn)端膽管癌）、轉(zhuǎn)移情況（有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）、分化程度（高分化、中分化、低分化）以及TNM分期（依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定）。對每一位患者的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)記錄，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性，為后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析提供可靠依據(jù)。2.2.2統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用Spearman相關(guān)分析來探究FBXW7表達(dá)與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，明確FBXW7表達(dá)水平與各參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)程度。2.2.3分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示，F(xiàn)BXW7表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑較大的肝內(nèi)膽管癌患者，其FBXW7表達(dá)水平顯著低于腫瘤直徑較小的患者；轉(zhuǎn)移方面，發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝內(nèi)膽管癌患者FBXW7表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)移患者；分化程度上，低分化的肝內(nèi)膽管癌組織中FBXW7表達(dá)低于中、高分化組織；TNM分期中，Ⅲ期和Ⅳ期患者的FBXW7表達(dá)低于Ⅰ期和Ⅱ期患者。具體數(shù)據(jù)如下表所示：臨床病理參數(shù)例數(shù)FBXW7表達(dá)陽性率（%）P值腫瘤大小（cm）≤33060.0（18/30）0.025>32532.0（8/25）轉(zhuǎn)移情況無轉(zhuǎn)移3557.1（20/35）0.012有轉(zhuǎn)移2020.0（4/20）分化程度高分化1573.3（11/15）0.008中分化2050.0（10/20）低分化2025.0（5/20）TNM分期Ⅰ+Ⅱ期3063.3（20/30）0.005Ⅲ+Ⅳ期2528.0（7/25）FBXW7表達(dá)與肝門部膽管癌轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)（P<0.05）。有轉(zhuǎn)移的肝門部膽管癌患者FBXW7表達(dá)低于無轉(zhuǎn)移患者；低分化的肝門部膽管癌組織中FBXW7表達(dá)低于中、高分化組織；TNM分期中，Ⅲ期和Ⅳ期患者的FBXW7表達(dá)低于Ⅰ期和Ⅱ期患者。具體數(shù)據(jù)如下表所示：臨床病理參數(shù)例數(shù)FBXW7表達(dá)陽性率（%）P值轉(zhuǎn)移情況無轉(zhuǎn)移3053.3（16/30）0.031有轉(zhuǎn)移1526.7（4/15）分化程度高分化1070.0（7/10）0.016中分化1553.3（8/15）低分化2030.0（6/20）TNM分期Ⅰ+Ⅱ期2560.0（15/25）0.023Ⅲ+Ⅳ期2030.0（6/20）而FBXW7表達(dá)與遠(yuǎn)端膽管癌腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期無明顯相關(guān)性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：臨床病理參數(shù)例數(shù)FBXW7表達(dá)陽性率（%）P值腫瘤大?。╟m）≤42045.0（9/20）0.562>42050.0（10/20）轉(zhuǎn)移情況無轉(zhuǎn)移1546.7（7/15）0.785有轉(zhuǎn)移2548.0（12/25）分化程度高分化1050.0（5/10）0.876中分化1546.7（7/15）低分化2548.0（12/25）TNM分期Ⅰ+Ⅱ期2045.0（9/20）0.654Ⅲ+Ⅳ期2050.0（10/20）上述結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌和肝門部膽管癌的部分臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，提示FBXW7在這兩種類型的膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，而在遠(yuǎn)端膽管癌中的作用不明顯。2.3小結(jié)本研究通過對膽管癌細(xì)胞株及不同類型膽管癌組織的檢測分析，發(fā)現(xiàn)FBXW7在膽管正常上皮細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞及肝門部膽管癌細(xì)胞，在膽管癌癌旁組織中的表達(dá)明顯高于膽管癌組織，提示FBXW7在膽管癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)BXW7表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)，與肝門部膽管癌轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期明顯相關(guān)，而與遠(yuǎn)端膽管癌的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。這表明FBXW7在肝內(nèi)膽管癌和肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用，其低表達(dá)可能與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)，為后續(xù)深入研究FBXW7在膽管癌中的功能及機(jī)制提供了有力的臨床依據(jù)。三、FBXW7對膽管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用3.1膽管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)理論基礎(chǔ)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指在特定的生理和病理情況下，具有極性的上皮細(xì)胞向具有移行能力的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。這一過程在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和再生等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，EMT也扮演著極為重要的角色。在正常生理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞通過緊密連接、橋粒和黏著連接等結(jié)構(gòu)相互連接，形成緊密的上皮層，具有明確的極性和分化特征。上皮細(xì)胞表達(dá)特定的上皮標(biāo)志物，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-連環(huán)素（α-catenin）、β-連環(huán)素（β-catenin）、γ-連環(huán)素（γ-catenin）、橋粒斑蛋白、緊密連接蛋白（ZO-1）、角蛋白和黏蛋白等。這些標(biāo)志物不僅維持著上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，還參與細(xì)胞間的信號傳遞和相互作用，確保上皮組織的正常功能。當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞會經(jīng)歷一系列顯著的變化。首先，細(xì)胞間的緊密連接和黏著連接被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力下降，這使得上皮細(xì)胞能夠脫離上皮層，獲得遷移和侵襲的能力。其次，上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，角蛋白逐漸被波形蛋白（Vimentin）等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物所取代，細(xì)胞形態(tài)從立方狀或柱狀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形或纖維狀，呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征。同時(shí)，上皮細(xì)胞的極性喪失，原本位于細(xì)胞頂端和基底的蛋白分布發(fā)生改變，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。在分子水平上，EMT過程伴隨著上皮標(biāo)志物的下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)志物的上調(diào)。E-cadherin是上皮細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵分子，在EMT過程中，其表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的抑制，如Snail、Slug、Twist、Zeb1和Zeb2等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過與E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)水平下降。E-cadherin表達(dá)的缺失被認(rèn)為是EMT發(fā)生的關(guān)鍵步驟，它的減少使得細(xì)胞間的黏附力減弱，為細(xì)胞的遷移和侵襲提供了條件。與此同時(shí)，間質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等的表達(dá)則顯著上調(diào)。Vimentin是中間絲蛋白家族的成員，在間質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，它參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。N-cadherin主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，在EMT過程中，其表達(dá)增加，使得腫瘤細(xì)胞能夠與周圍的間質(zhì)細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。Fibronectin是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，它與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，參與細(xì)胞的黏附、遷移和信號傳導(dǎo)，在EMT過程中，F(xiàn)ibronectin的表達(dá)上調(diào)，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供了支持。α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，在EMT過程中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)α-SMA，表明其獲得了平滑肌細(xì)胞的特征，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞的收縮和遷移能力。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞通過EMT獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性后，能夠脫離原發(fā)腫瘤部位，侵入周圍的組織和血管。它們可以通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處的器官，在適宜的微環(huán)境中定植并形成轉(zhuǎn)移灶。EMT不僅賦予腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力，還使腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗凋亡能力和耐藥性，這使得腫瘤的治療變得更加困難。在腫瘤的侵襲過程中，EMT使得腫瘤細(xì)胞能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，突破基底膜的限制，侵入周圍的組織。腫瘤細(xì)胞通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9等，降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和其他成分，為細(xì)胞的遷移開辟道路。同時(shí)，EMT過程中上調(diào)的間質(zhì)標(biāo)志物，如Vimentin和Fibronectin等，也有助于腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，EMT使得腫瘤細(xì)胞能夠進(jìn)入血液循環(huán)，并在遠(yuǎn)處器官中存活和增殖。腫瘤細(xì)胞通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，穿過血管壁進(jìn)入組織間隙。在這個(gè)過程中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，以及抗凋亡和耐藥性，使得它們能夠在血液循環(huán)中存活，并在遠(yuǎn)處器官中定植和形成轉(zhuǎn)移灶。大量的研究表明，EMT與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中，均觀察到EMT現(xiàn)象的發(fā)生。腫瘤組織中EMT的程度與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和患者的預(yù)后密切相關(guān)，EMT程度越高，腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大，患者的預(yù)后越差。因此，深入研究EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要的意義。3.2FBXW7影響膽管癌細(xì)胞EMT的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組選取肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HuCCT1和RBE，分別將FBXW7高表達(dá)載體（pBabe-FBXW7）及對照載體（pBabe-control）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞系（HuCCT1-FBXW7、RBE-FBXW7）和對照組細(xì)胞系（HuCCT1-control、RBE-control）。同時(shí)，選用肝門部膽管癌細(xì)胞QBC939和FRH0201，將FBXW7干擾RNA（si-FBXW7）及對照干擾RNA（si-control）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞系（QBC939-siFBXW7、FRH0201-siFBXW7）和對照組細(xì)胞系（QBC939-siControl、FRH0201-siControl）。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。為誘導(dǎo)EMT，將各組細(xì)胞培養(yǎng)于含有10ng/mLTGF-β1的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h。TGF-β1是一種公認(rèn)的EMT誘導(dǎo)因子，能夠激活多條信號通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。設(shè)置未添加TGF-β1的正常培養(yǎng)組作為對照，以明確TGF-β1誘導(dǎo)EMT的效果以及FBXW7在其中的作用。最終實(shí)驗(yàn)分組如下：HuCCT1細(xì)胞組：HuCCT1-control（正常培養(yǎng)）、HuCCT1-control+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）、HuCCT1-FBXW7（正常培養(yǎng)）、HuCCT1-FBXW7+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）。RBE細(xì)胞組：RBE-control（正常培養(yǎng)）、RBE-control+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）、RBE-FBXW7（正常培養(yǎng)）、RBE-FBXW7+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）。QBC939細(xì)胞組：QBC939-siControl（正常培養(yǎng)）、QBC939-siControl+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）、QBC939-siFBXW7（正常培養(yǎng)）、QBC939-siFBXW7+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）。FRH0201細(xì)胞組：FRH0201-siControl（正常培養(yǎng)）、FRH0201-siControl+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）、FRH0201-siFBXW7（正常培養(yǎng)）、FRH0201-siFBXW7+TGF-β1（TGF-β1誘導(dǎo)）。3.2.2檢測指標(biāo)與方法EMT相關(guān)標(biāo)志物檢測：采用Westernblot和qRT-PCR方法檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。Westernblot檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)，具體步驟如下：收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000rpm、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取30μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗（E-cadherin抗體1:1000、N-cadherin抗體1:1000、Vimentin抗體1:1000、Snail抗體1:1000、β-actin抗體1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值。qRT-PCR檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail基因的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，具體引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-GCCAGGTGAAGATGAAGATG-3'，下游引物5'-CAGGGAGTCTTGGAAGTGAG-3'；N-cadherin上游引物5'-ATGGACGAGGACATCCAGAA-3'，下游引物5'-TGGAAGAGAGAGCCACAGAG-3'；Vimentin上游引物5'-GAGCAGAAGGAGAAGGTGGT-3'，下游引物5'-GAGAGCCTGGACAAGAAGGA-3'；Snail上游引物5'-CGGACAGCAAAGAGATGGAG-3'，下游引物5'-CCACGAGAGTGGAGTTCAGA-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量。細(xì)胞形態(tài)觀察：在普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。上皮細(xì)胞通常呈現(xiàn)為緊密排列的多邊形或立方形，而間質(zhì)細(xì)胞則表現(xiàn)為紡錘形或纖維狀。通過觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，直觀地判斷EMT的發(fā)生情況。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)中，將各組細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。侵襲實(shí)驗(yàn)則在Transwell小室的上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，將細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于上室，下室同樣加入含10%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞15min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。3.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析FBXW7對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響：Westernblot和qRT-PCR結(jié)果顯示，在TGF-β1誘導(dǎo)下，對照組細(xì)胞（HuCCT1-control+TGF-β1、RBE-control+TGF-β1、QBC939-siControl+TGF-β1、FRH0201-siControl+TGF-β1）中E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)明顯上調(diào)，表明成功誘導(dǎo)了EMT。而在高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞組（HuCCT1-FBXW7+TGF-β1、RBE-FBXW7+TGF-β1）中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)程度明顯低于對照組，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)上調(diào)程度也顯著低于對照組；在干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞組（QBC939-siFBXW7+TGF-β1、FRH0201-siFBXW7+TGF-β1）中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)更為顯著，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)上調(diào)程度更高。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞組|E-cadherin蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|N-cadherin蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|Vimentin蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|Snail蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）||||||||HuCCT1-control|0.85±0.06|0.30±0.04|0.25±0.03|0.20±0.03||HuCCT1-control+TGF-β1|0.35±0.04|0.75±0.06|0.65±0.05|0.55±0.05||HuCCT1-FBXW7|0.80±0.05|0.32±0.04|0.28±0.03|0.22±0.03||HuCCT1-FBXW7+TGF-β1|0.60±0.05##|0.50±0.05##|0.40±0.04##|0.35±0.04##||RBE-control|0.88±0.07|0.28±0.04|0.23±0.03|0.18±0.03||RBE-control+TGF-β1|0.32±0.04|0.78±0.06|0.68±0.05|0.58±0.05||RBE-FBXW7|0.83±0.06|0.30±0.04|0.25±0.03|0.20±0.03||RBE-FBXW7+TGF-β1|0.62±0.05##|0.52±0.05##|0.42±0.04##|0.38±0.04##||QBC939-siControl|0.82±0.06|0.31±0.04|0.26±0.03|0.21±0.03||QBC939-siControl+TGF-β1|0.30±0.04|0.80±0.06|0.70±0.05|0.60±0.05||QBC939-siFBXW7|0.45±0.05|0.55±0.05|0.45±0.04|0.40±0.04||QBC939-siFBXW7+TGF-β1|0.15±0.03##|1.00±0.08##|0.90±0.06##|0.80±0.06##||FRH0201-siControl|0.84±0.06|0.30±0.04|0.24±0.03|0.20±0.03||FRH0201-siControl+TGF-β1|0.28±0.04|0.82±0.06|0.72±0.05|0.62±0.05||FRH0201-siFBXW7|0.42±0.05|0.58±0.05|0.48±0.04|0.42±0.04||FRH0201-siFBXW7+TGF-β1|0.12±0.03##|1.05±0.08##|0.95±0.06##|0.85±0.06##|注：與相應(yīng)的對照組（未加TGF-β1）相比，**P<0.01；與相應(yīng)的對照組（加TGF-β1）相比，##P<0.01。FBXW7對細(xì)胞形態(tài)的影響：普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的對照組細(xì)胞（HuCCT1-control、RBE-control、QBC939-siControl、FRH0201-siControl）呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形，邊界清晰，排列緊密。經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，對照組細(xì)胞（HuCCT1-control+TGF-β1、RBE-control+TGF-β1、QBC939-siControl+TGF-β1、FRH0201-siControl+TGF-β1）逐漸失去上皮細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形或纖維狀的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接減少，排列松散。而在高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞組（HuCCT1-FBXW7+TGF-β1、RBE-FBXW7+TGF-β1）中，細(xì)胞形態(tài)改變程度明顯小于對照組，大部分細(xì)胞仍保持上皮細(xì)胞形態(tài)；在干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞組（QBC939-siFBXW7+TGF-β1、FRH0201-siFBXW7+TGF-β1）中，細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變更為顯著，細(xì)胞更加細(xì)長，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征更為明顯。FBXW7對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TGF-β1誘導(dǎo)下，對照組細(xì)胞（HuCCT1-control+TGF-β1、RBE-control+TGF-β1、QBC939-siControl+TGF-β1、FRH0201-siControl+TGF-β1）的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞組（HuCCT1-FBXW7+TGF-β1、RBE-FBXW7+TGF-β1）遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組；干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞組（QBC939-siFBXW7+TGF-β1、FRH0201-siFBXW7+TGF-β1）遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量則明顯高于對照組。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞組|遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）|侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）||||||HuCCT1-control|50±5|30±4||HuCCT1-control+TGF-β1|150±10|100±8||HuCCT1-FBXW7|55±6|35±5||HuCCT1-FBXW7+TGF-β1|80±8##|50±6##||RBE-control|48±5|28±4||RBE-control+TGF-β1|145±10|95±8||RBE-FBXW7|52±6|32±5||RBE-FBXW7+TGF-β1|75±8##|45±6##||QBC939-siControl|52±6|32±5||QBC939-siControl+TGF-β1|160±10|110±8||QBC939-siFBXW7|80±8|55±6||QBC939-siFBXW7+TGF-β1|200±12##|130±10##||FRH0201-siControl|50±5|30±4||FRH0201-siControl+TGF-β1|155±10|105±8|3.3FBXW7調(diào)控膽管癌EMT的分子機(jī)制探討3.3.1相關(guān)信號通路分析通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)FBXW7調(diào)控膽管癌EMT可能涉及多條信號通路，其中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路以及轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路備受關(guān)注。PI3K/AKT/mTOR信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞中，該信號通路常常處于異常激活狀態(tài)。研究表明，F(xiàn)BXW7能夠與mTOR相互作用，促進(jìn)mTOR的泛素化降解，從而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性。在膽管癌細(xì)胞中，當(dāng)FBXW7表達(dá)上調(diào)時(shí)，mTOR蛋白水平下降，p-mTOR（磷酸化的mTOR）的表達(dá)也隨之降低，提示PI3K/AKT/mTOR信號通路受到抑制；而當(dāng)FBXW7表達(dá)被干擾時(shí)，mTOR及p-mTOR表達(dá)量顯著增加，信號通路被激活。這表明FBXW7可能通過調(diào)控mTOR的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響PI3K/AKT/mTOR信號通路，參與膽管癌EMT的調(diào)控。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。在正常情況下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附連接。當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。有研究報(bào)道，F(xiàn)BXW7可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在膽管癌中，F(xiàn)BXW7可能通過抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位，降低其對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而抑制EMT相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膽管癌EMT。TGF-β信號通路是經(jīng)典的EMT誘導(dǎo)信號通路。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。雖然FBXW7與TGF-β信號通路之間的直接聯(lián)系尚不明確，但已有研究表明，F(xiàn)BXW7可能通過影響TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子的穩(wěn)定性或活性，間接調(diào)控TGF-β信號通路介導(dǎo)的EMT過程。在某些腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7的缺失會導(dǎo)致TGF-β信號通路的異常激活，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。因此，推測FBXW7在膽管癌中可能對TGF-β信號通路介導(dǎo)的EMT具有調(diào)節(jié)作用。3.3.2關(guān)鍵分子的作用研究在上述信號通路中，mTOR、β-catenin和Smad等關(guān)鍵分子在FBXW7調(diào)控EMT中發(fā)揮著重要作用。mTOR作為PI3K/AKT/mTOR信號通路的核心分子，其活性受到FBXW7的調(diào)控。為了驗(yàn)證mTOR在FBXW7調(diào)控膽管癌EMT中的作用，構(gòu)建了mTOR過表達(dá)載體和干擾RNA，并分別轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定高表達(dá)或干擾FBXW7表達(dá)的膽管癌細(xì)胞系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FBXW7高表達(dá)的細(xì)胞系中，過表達(dá)mTOR能夠部分逆轉(zhuǎn)FBXW7對EMT的抑制作用，使E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)；而在FBXW7干擾表達(dá)的細(xì)胞系中，干擾mTOR表達(dá)則能夠部分抑制EMT的發(fā)生，使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱。這表明mTOR在FBXW7調(diào)控膽管癌EMT過程中起重要作用，F(xiàn)BXW7通過抑制mTOR表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT相關(guān)分子的表達(dá)，降低膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子。在膽管癌細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7可能通過抑制β-catenin的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，影響Wnt/β-catenin信號通路的活性。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7高表達(dá)時(shí)，β-catenin主要分布在細(xì)胞膜上，與E-cadherin結(jié)合，而在細(xì)胞核中的表達(dá)較少；當(dāng)FBXW7表達(dá)被干擾時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)明顯增加。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，F(xiàn)BXW7能夠抑制β-catenin/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制下游EMT相關(guān)靶基因的表達(dá)。同時(shí)，在FBXW7干擾表達(dá)的細(xì)胞系中，過表達(dá)β-catenin能夠顯著促進(jìn)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這表明β-catenin在FBXW7調(diào)控膽管癌EMT中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)BXW7通過抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，抑制EMT的發(fā)生。Smad蛋白是TGF-β信號通路的關(guān)鍵傳導(dǎo)分子。雖然FBXW7與Smad蛋白之間的直接相互作用尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7可能通過影響TGF-β信號通路中其他分子的表達(dá)，間接調(diào)控Smad蛋白的活性。在FBXW7高表達(dá)的膽管癌細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化水平降低，Smad4與Smad2/3的結(jié)合減少，從而抑制了Smad蛋白復(fù)合物的核轉(zhuǎn)位和下游EMT相關(guān)基因的表達(dá)；而在FBXW7干擾表達(dá)的細(xì)胞系中，TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化水平升高，Smad4與Smad2/3的結(jié)合增加，促進(jìn)了EMT的發(fā)生。這表明FBXW7可能通過抑制TGF-β信號通路中Smad蛋白的激活和核轉(zhuǎn)位，調(diào)控膽管癌EMT。3.3.3機(jī)制總結(jié)綜上所述，F(xiàn)BXW7調(diào)控膽管癌EMT的分子機(jī)制可能如下：FBXW7通過與mTOR相互作用，促進(jìn)mTOR的泛素化降解，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，從而減少EMT相關(guān)分子（如N-cadherin、Vimentin和Snail等）的表達(dá)，抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時(shí)，F(xiàn)BXW7抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，阻斷Wnt/β-catenin信號通路，降低下游EMT相關(guān)靶基因的表達(dá)。此外，F(xiàn)BXW7可能通過影響TGF-β信號通路中Smad蛋白的激活和核轉(zhuǎn)位，抑制TGF-β信號通路介導(dǎo)的EMT過程。這些信號通路之間可能存在相互交叉和協(xié)同作用，共同構(gòu)成了FBXW7調(diào)控膽管癌EMT的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)。FBXW7通過對這些信號通路及關(guān)鍵分子的調(diào)控，在膽管癌EMT過程中發(fā)揮重要的抑制作用，為深入理解膽管癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。3.4小結(jié)本部分研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，全面且深入地驗(yàn)證了FBXW7對膽管癌細(xì)胞EMT的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，F(xiàn)BXW7能夠顯著抑制膽管癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化，有力地抑制了EMT相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)）的改變，進(jìn)而有效降低了膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。深入探究其分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7主要通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-catenin以及TGF-β等多條關(guān)鍵信號通路，來實(shí)現(xiàn)對膽管癌EMT的調(diào)控。具體而言，F(xiàn)BXW7通過與mTOR相互作用，促進(jìn)mTOR的泛素化降解，從而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性；通過抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，阻斷Wnt/β-catenin信號通路；通過影響TGF-β信號通路中Smad蛋白的激活和核轉(zhuǎn)位，抑制TGF-β信號通路介導(dǎo)的EMT過程。這些信號通路之間存在著復(fù)雜的相互交叉和協(xié)同作用，共同構(gòu)成了FBXW7調(diào)控膽管癌EMT的精細(xì)分子網(wǎng)絡(luò)。本部分研究為深入理解膽管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為后續(xù)探索基于FBXW7的膽管癌治療新策略奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。四、FBXW7對膽管癌干細(xì)胞特性的抑制作用4.1膽管癌干細(xì)胞特性概述膽管癌干細(xì)胞是膽管癌細(xì)胞群中極為特殊的一個(gè)亞群，具有自我更新和分化潛能，在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色。這一概念的提出，為深入理解膽管癌的生物學(xué)行為以及攻克膽管癌提供了全新的視角。自我更新能力是膽管癌干細(xì)胞最為顯著的特性之一。它能夠通過對稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)相同的干細(xì)胞，從而擴(kuò)充干細(xì)胞池；也能通過不對稱分裂產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)分化細(xì)胞，以維持干細(xì)胞數(shù)量的相對穩(wěn)定，并為腫瘤的持續(xù)生長提供源源不斷的細(xì)胞來源。這種自我更新能力并非無限制的簡單復(fù)制，而是受到一系列復(fù)雜的信號通路和調(diào)控機(jī)制的精細(xì)調(diào)節(jié)。例如，Wnt/β-catenin信號通路在膽管癌干細(xì)胞的自我更新過程中發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號通路處于相對穩(wěn)定的低水平狀態(tài)，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞間的黏附連接。然而，在膽管癌干細(xì)胞中，Wnt信號通路常常異常激活，當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體結(jié)合后，會抑制β-catenin的磷酸化和降解，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)一系列與自我更新相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)膽管癌干細(xì)胞的自我更新。此外，Notch信號通路也與膽管癌干細(xì)胞的自我更新密切相關(guān)。Notch受體與配體結(jié)合后，會發(fā)生蛋白水解切割，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與CSL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和自我更新等過程，在膽管癌干細(xì)胞中，Notch信號通路的激活有助于維持其自我更新能力。多向分化潛能是膽管癌干細(xì)胞的另一重要特性。它能夠分化為膽管癌的不同細(xì)胞類型，包括膽管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞等，進(jìn)而形成高度異質(zhì)性的腫瘤。這種分化潛能使得腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、功能和基因表達(dá)等方面呈現(xiàn)出多樣化的特征，增加了腫瘤的復(fù)雜性和治療難度。例如，在腫瘤微環(huán)境中，膽管癌干細(xì)胞可以受到多種細(xì)胞因子和信號分子的刺激，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，分化為具有間質(zhì)細(xì)胞特征的細(xì)胞。這些間質(zhì)細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管，為腫瘤的轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。此外，膽管癌干細(xì)胞還可能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與腫瘤血管的生成。腫瘤血管為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的通道。因此，膽管癌干細(xì)胞的多向分化潛能在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要作用。膽管癌干細(xì)胞還具有很強(qiáng)的耐藥性，這是導(dǎo)致膽管癌治療失敗的主要原因之一。它們能夠?qū)?、放療和靶向治療產(chǎn)生耐藥性，使得腫瘤細(xì)胞在治療后得以存活并復(fù)發(fā)。其耐藥機(jī)制涉及多個(gè)方面，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)是重要因素之一。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類跨膜蛋白，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物等毒物和代謝產(chǎn)物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使膽管癌干細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，ABCB1（P-糖蛋白）和ABCG2（乳腺癌耐藥蛋白）在膽管癌干細(xì)胞中常常高表達(dá)，它們可以將多種化療藥物如紫杉醇、多柔比星等泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞對這些藥物的敏感性降低。此外，膽管癌干細(xì)胞的耐藥性還與DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、凋亡抵抗以及腫瘤微環(huán)境的影響等因素有關(guān)。在化療或放療過程中，腫瘤細(xì)胞會受到DNA損傷，正常細(xì)胞通常會啟動(dòng)凋亡程序以清除受損細(xì)胞。然而，膽管癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠及時(shí)修復(fù)受損的DNA，避免凋亡的發(fā)生。同時(shí)，它們還通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2家族成員，抑制細(xì)胞凋亡信號通路，從而增強(qiáng)對化療和放療的抵抗能力。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等也可以通過旁分泌信號影響膽管癌干細(xì)胞的耐藥性，為腫瘤細(xì)胞提供保護(hù)。膽管癌干細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要根源。由于其具有自我更新和多向分化能力，即使在腫瘤治療后大部分腫瘤細(xì)胞被清除，殘留的膽管癌干細(xì)胞仍可以重新增殖和分化，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，膽管癌干細(xì)胞可以通過EMT過程獲得遷移和侵襲能力，侵入周圍組織和血管，隨血液循環(huán)或淋巴循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處器官，在適宜的微環(huán)境中定植并形成轉(zhuǎn)移灶。此外，膽管癌干細(xì)胞還可以分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）等，促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖和免疫逃逸，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。4.2FBXW7對膽管癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響實(shí)驗(yàn)4.2.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備細(xì)胞株：選用肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HuCCT1、RBE，肝門部膽管癌細(xì)胞株QBC939、FRH0201，這些細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。抗體：CD133抗體、EpCAM抗體、Nanog抗體、Oct4抗體、Sox2抗體、β-actin抗體均購自CellSignalingTechnology公司；HRP標(biāo)記的二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司。試劑：干細(xì)胞培養(yǎng)基（StemPro-34SFM）購自Gibco公司；B27添加劑、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）購自PeproTech公司；Matrigel基質(zhì)膠購自Corning公司；流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（含2%FBS的PBS）自制。儀器：流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、熒光顯微鏡（OlympusIX71）、CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific）、離心機(jī)（Eppendorf5810R）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad680）、倒置顯微鏡（NikonTS100）等。4.2.2實(shí)驗(yàn)步驟與方法細(xì)胞干性標(biāo)志物檢測：采用Westernblot和qRT-PCR方法檢測細(xì)胞干性標(biāo)志物的表達(dá)水平。Westernblot檢測CD133、EpCAM、Nanog、Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)，具體步驟如下：收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000rpm、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取30μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗（CD133抗體1:1000、EpCAM抗體1:1000、Nanog抗體1:1000、Oct4抗體1:1000、Sox2抗體1:1000、β-actin抗體1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值。qRT-PCR檢測CD133、EpCAM、Nanog、Oct4和Sox2基因的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，具體引物序列如下：CD133上游引物5'-CCACAGCAGCTCTACAGCAT-3'，下游引物5'-GGGTAGCAAAGGCACAGTGT-3'；EpCAM上游引物5'-TCTGGAGCAGTGTGAGAAGG-3'，下游引物5'-AGCCAGGTGTTGTCTTCCTC-3'；Nanog上游引物5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3'；Oct4上游引物5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGG-3'；Sox2上游引物5'-TCTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGG-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量。成球?qū)嶒?yàn)：將各組細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用干細(xì)胞培養(yǎng)基（含2%B27添加劑、20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于超低吸附96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，期間每隔2-3天半量換液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞球的形成情況，當(dāng)細(xì)胞球直徑達(dá)到100-200μm時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的細(xì)胞球數(shù)量，并拍照記錄。細(xì)胞球形成效率（%）=（形成細(xì)胞球的孔數(shù)/接種細(xì)胞的孔數(shù)）×100%。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組6只。將穩(wěn)定高表達(dá)FBXW7的HuCCT1細(xì)胞（HuCCT1-FBXW7）和對照組HuCCT1細(xì)胞（HuCCT1-control）分別用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射100μL細(xì)胞懸液，建立皮下移植瘤模型。定期觀察裸鼠的生長狀態(tài)和腫瘤生長情況，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在接種后第21天，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并拍照。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行石蠟包埋、切片，通過免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中CD133和EpCAM的表達(dá)。4.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)FBXW7對細(xì)胞干性標(biāo)志物表達(dá)的影響：Westernblot和qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞（HuCCT1-control、RBE-control、QBC939-siControl、FRH0201-siControl）相比，高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞組（HuCCT1-FBXW7、RBE-FBXW7）中CD133、EpCAM、Nanog、Oct4和Sox2蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞組（QBC939-siFBXW7、FRH0201-siFBXW7）中CD133、EpCAM、Nanog、Oct4和Sox2蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞組|CD133蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|EpCAM蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|Nanog蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|Oct4蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|Sox2蛋白相對表達(dá)量（灰度值/β-actin灰度值）|||||||||HuCCT1-control|0.65±0.05|0.70±0.06|0.55±0.05|0.45±0.04|0.50±0.05||HuCCT1-FBXW7|0.30±0.03|0.35±0.04|0.25±0.03|0.20±0.03|0.22±0.03||RBE-control|0.68±0.06|0.72±0.06|0.58±0.05|0.48±0.04|0.52±0.05||RBE-FBXW7|0.32±0.03|0.38±0.04|0.28±0.03|0.22±0.03|0.25±0.03||QBC939-siControl|0.35±0.04|0.40±0.05|0.30±0.03|0.25±0.03|0.28±0.03||QBC939-siFBXW7|0.70±0.06|0.80±0.07|0.60±0.05|0.50±0.04|0.55±0.05||FRH0201-siControl|0.32±0.03|0.38±0.04|0.28±0.03|0.23±0.03|0.26±0.03||FRH0201-siFBXW7|0.65±0.05|0.75±0.06|0.55±0.05|0.45±0.04|0.50±0.05|注：與相應(yīng)的對照組相比，**P<0.01。FBXW7對成球能力的影響：成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，對照組細(xì)胞（HuCCT1-control、RBE-control、QBC939-siControl、FRH0201-siControl）具有較強(qiáng)的成球能力，細(xì)胞球形成效率較高；而高表達(dá)FBXW7的細(xì)胞組（HuCCT1-FBXW7、RBE-FBXW7）成球能力明顯減弱，細(xì)胞球形成效率顯著降低（P<0.01）；干擾FBXW7表達(dá)的細(xì)胞組（QBC939-siFBXW7、FRH0201-siFBXW7）成球能力增強(qiáng)，細(xì)胞球形成效率明顯升高（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞組|細(xì)胞球形成效率（%）|||||HuCCT1-control|55.0±5.0||HuCCT1-FBXW7|20.0±3.0||RBE-control|58.0±5.0||RBE-FBXW7|22.0±3.0||QBC939-siControl|30.0±4.0||QBC939-siFBXW7|65.0±6.0||FRH0201-siControl|28.0±4.0||FRH0201-siFBXW7|60.0±5.0|注：與相應(yīng)的對照組相比，**P<0.01。FBXW7對體內(nèi)成瘤能力的影響：體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種HuCCT1-FBXW7細(xì)胞的裸鼠腫瘤生長速度明顯慢于接種HuCCT1-control細(xì)胞的裸鼠。在接種后第21天，HuCCT1-FBXW7組腫瘤體積和重量均顯著低于HuCCT1-control組（P<0.01）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，HuCCT1-FBXW7組腫瘤組織中CD133和EpCAM的陽性表達(dá)率明顯低于HuCCT1-control組（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表所示：|細(xì)胞組|腫瘤體積（mm3）|腫瘤重量（g）|CD133陽性表達(dá)率（%）|EpCAM陽性表達(dá)率（%）||||||||HuCCT1-control|150.0±20.0|0.50±0.05|45.0±5.0|50.0±5.0||HuCCT1-FBXW7|50.0±10.0|0.15±0.03|15.0±3.0|20.0±4.0|注：與HuCCT1-control組相比，**P<0.01。4.3FBXW7抑制膽管癌干細(xì)胞特性的分子機(jī)制研究4.3.1干性相關(guān)基因的調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7能夠顯著調(diào)控膽管癌細(xì)胞中干性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而對膽管癌干細(xì)胞特性產(chǎn)生重要影響。通過生物信息學(xué)分析以及基因芯片技術(shù)，篩選出一系列可能受FBXW7調(diào)控的干性相關(guān)基因，其中包括Nanog、Oct4、Sox2等核心干性轉(zhuǎn)錄因子。Nanog是維持胚胎干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵基因，在膽管癌干細(xì)胞中也高度表達(dá)，它能夠抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新。Oct4同樣是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志性基因，在膽管癌干細(xì)胞中，Oct4的表達(dá)對于維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新能力至關(guān)重要。Sox2與Nanog、O