Genistein聯(lián)合順鉑：卵巢癌治療的新策略與機(jī)制洞察一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，位居第三，但其死亡率卻高居榜首。卵巢腫瘤組織成分復(fù)雜，不同類型的組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為存在顯著差異，且卵巢癌起病隱匿，早期常無明顯癥狀，這使得大部分患者確診時(shí)已處于晚期。卵巢癌晚期患者的5年總生存率低于29%，預(yù)后較差。卵巢癌不僅會(huì)引起腹痛、貧血、消瘦等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及生命，對(duì)患者的生理和心理都產(chǎn)生巨大的影響。目前，卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法為手術(shù)切除聯(lián)合化療。手術(shù)旨在盡可能切除卵巢內(nèi)的腫瘤負(fù)擔(dān)以及腹腔內(nèi)的癌細(xì)胞，但由于癌細(xì)胞難以完全可視，徹底切除存在挑戰(zhàn)?；焺t常用鉑類藥物或紫杉烷類藥物，以根除體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞。順鉑作為一種常用的鉑類化療藥物，通過與癌細(xì)胞的DNA結(jié)合形成交叉鏈接，抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。順鉑常與其他化療藥物聯(lián)合使用，以增強(qiáng)化療效果，也可緩解癌癥引起的癥狀。然而，化療存在諸多局限性。一方面，化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、腎毒性、耳毒性等一系列副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。另一方面，長期化療容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，疾病復(fù)發(fā)率升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%的卵巢癌患者在最初診斷后的兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者被分為鉑敏感或鉑耐藥，其中鉑耐藥卵巢癌患者預(yù)后極差，對(duì)常規(guī)化療的反應(yīng)率非常低。鑒于化療的局限性，尋找新的治療方法或藥物，以提高卵巢癌的治療效果、降低化療藥物的毒副作用、克服腫瘤耐藥性，成為當(dāng)前卵巢癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Genistein（金雀異黃素，又稱染料木黃酮）是一種天然的異黃酮，廣泛存在于大豆和多種中草藥中。研究表明，Genistein具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、調(diào)節(jié)激素水平、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，在多種腫瘤中展現(xiàn)出化學(xué)預(yù)防及治療潛能，對(duì)前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等均有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)Genistein對(duì)絨癌、卵巢癌細(xì)胞也具有生長抑制作用，且能夠增強(qiáng)多種耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于卵巢癌的具體作用機(jī)制及協(xié)同效果尚未完全明確。因此，探討Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的體內(nèi)外作用及其機(jī)制，具有重要的理論和臨床意義，有望為卵巢癌的治療提供新的策略和方法。1.2Genistein與順鉑概述Genistein，化學(xué)名為4',5,7-三羥基異黃酮，是一種天然的異黃酮類化合物，主要來源于大豆等豆類植物以及多種中草藥。其在豆類中的含量豐富，以大豆為例，每100克大豆中Genistein的含量可達(dá)100-400毫克。Genistein的分子結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的生物學(xué)活性，它能夠模擬雌激素的作用，與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮弱雌激素效應(yīng)，同時(shí)也能表現(xiàn)出抗雌激素作用，這種雙重調(diào)節(jié)作用在維持機(jī)體激素平衡方面具有重要意義。大量研究表明，Genistein展現(xiàn)出顯著的抗癌潛能。它可以通過多種途徑發(fā)揮抗癌作用。在抑制細(xì)胞增殖方面，Genistein能夠阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，使癌細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期階段，從而抑制其分裂和增殖。例如，在乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，Genistein可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，抑制癌細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂，進(jìn)而減少癌細(xì)胞數(shù)量。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，Genistein能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。研究證實(shí)，Genistein可以上調(diào)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值，引發(fā)線粒體膜電位的改變，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。此外，Genistein還具有抑制腫瘤血管生成的能力，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣，Genistein通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，阻礙腫瘤血管的形成，從而限制腫瘤的生長和擴(kuò)散。順鉑（Cisplatin），化學(xué)名為順式-二氯二氨合鉑（Ⅱ），是一種經(jīng)典的鉑類化療藥物，在卵巢癌化療中占據(jù)重要地位。自1978年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于癌癥治療以來，順鉑廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，尤其是卵巢癌。在卵巢癌的治療中，順鉑常作為一線化療藥物，無論是在早期卵巢癌術(shù)后的輔助化療，還是晚期卵巢癌的姑息化療中，都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其作用原理主要基于對(duì)癌細(xì)胞DNA的損傷。順鉑進(jìn)入癌細(xì)胞后，首先發(fā)生水合作用，氯離子被水分子取代，形成帶正電荷的水合絡(luò)合物。這些絡(luò)合物能夠與DNA分子中的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基結(jié)合，特別是與相鄰的鳥嘌呤堿基形成鏈內(nèi)交聯(lián)，較少情況下形成鏈間交聯(lián)。這種交聯(lián)作用破壞了DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)，阻礙了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。當(dāng)DNA復(fù)制受到抑制時(shí)，癌細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂和增殖；而轉(zhuǎn)錄過程受阻則導(dǎo)致相關(guān)基因無法正常表達(dá)，影響癌細(xì)胞的代謝和生存。此外，順鉑還可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)揮其抗腫瘤作用。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的體內(nèi)外作用及其潛在的作用機(jī)制。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，精確分析Genistein與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯等生物學(xué)行為的影響，明確兩者聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同增效作用。同時(shí)，借助體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌腫瘤生長的抑制效果，評(píng)估其安全性和毒副作用。從分子生物學(xué)層面，深入剖析聯(lián)合用藥影響卵巢癌細(xì)胞的信號(hào)通路和相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)變化，揭示其作用機(jī)制。卵巢癌作為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，目前的治療手段仍存在諸多局限性。本研究對(duì)卵巢癌的治療具有重要的潛在價(jià)值。一方面，若能證實(shí)Genistein聯(lián)合順鉑具有協(xié)同增效作用，將為卵巢癌的臨床治療提供新的聯(lián)合用藥方案，有望提高化療效果，延長患者的生存期。另一方面，深入了解其作用機(jī)制，有助于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)，為卵巢癌的精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。此外，Genistein作為一種天然的異黃酮，具有低毒副作用的優(yōu)勢，其與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，或許能夠降低順鉑的用藥劑量，減少化療的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。本研究也為拓展Genistein在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，推動(dòng)天然產(chǎn)物在癌癥治療中的研究和開發(fā)。二、Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的體外研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑實(shí)驗(yàn)選用人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3，該細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），具有高增殖活性和一定的耐藥特性，常被用于卵巢癌相關(guān)的研究，能夠較好地模擬卵巢癌在體內(nèi)的生物學(xué)行為。Genistein（金雀異黃素）購自Sigma公司，純度≥98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，活性明確。使用時(shí)，用二甲基亞砜（DMSO）將Genistein配制成10mg/ml的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，避免光照和溫度波動(dòng)影響其活性。順鉑（Cisplatin）購自齊魯制藥廠，為臨床常用的注射用順鉑，每支10mg。順鉑是一種經(jīng)典的鉑類化療藥物，其作用機(jī)制是通過與癌細(xì)胞DNA結(jié)合，抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗癌作用。噻唑藍(lán)（MTT）購自Amresco公司，是一種用于檢測細(xì)胞增殖和活性的黃色染料。細(xì)胞周期檢測試劑盒（DNA-PrepStainkit）為BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品，可精確檢測細(xì)胞周期各階段的DNA含量變化。AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒為Biovision公司產(chǎn)品，能夠準(zhǔn)確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞，為研究細(xì)胞凋亡提供可靠的檢測手段。2.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，添加100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素以防止細(xì)菌污染，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中呈貼壁生長，定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，使其脫離培養(yǎng)瓶壁，然后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其均勻分散，再按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Genistein單藥組、順鉑單藥組以及Genistein聯(lián)合順鉑組。Genistein單藥組設(shè)置濃度梯度為2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml，順鉑單藥組濃度梯度為0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml。聯(lián)合用藥組則根據(jù)單藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取合適的濃度組合，如Genistein5μg/ml與順鉑2.5μg/ml聯(lián)合等。藥物處理時(shí)間設(shè)置為24h、48h、72h，以全面觀察藥物對(duì)細(xì)胞的短期和長期作用效果。在藥物處理過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，確保每組細(xì)胞處于相同的環(huán)境中，減少實(shí)驗(yàn)誤差。2.1.3檢測指標(biāo)與方法采用MTT法檢測細(xì)胞增殖。MTT法的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體操作如下：將對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞以每孔8×103個(gè)的密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO?孵箱培養(yǎng)12h，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基200μl。繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，繼續(xù)孵育4h，使MTT充分被活細(xì)胞還原。然后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（WellscanMK3型，LabsystemsDragon）在490nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組A490值-實(shí)驗(yàn)組A490值）/對(duì)照組A490值×100%。利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡。對(duì)于細(xì)胞周期檢測，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取合適的藥物濃度處理細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，按照DNA-PrepStainkit試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌，加入RNA酶A消化RNA，再加入碘化丙啶（PI）染色液，避光染色30min，最后用流式細(xì)胞儀（ELITEESP型，BECKMAN-COULTER）檢測細(xì)胞周期各階段（G1期、S期、G2/M期）的DNA含量，分析細(xì)胞周期分布情況。對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測，同樣選取合適藥物濃度處理細(xì)胞48h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光反應(yīng)15min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，AnnexinV-FITC標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞，PI可標(biāo)記晚期凋亡和壞死細(xì)胞，通過雙參數(shù)分析區(qū)分不同凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。采用RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)。RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。具體操作如下：用Trizol試劑提取藥物處理后的SKOV-3細(xì)胞總RNA，按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，加入上下游引物、dNTP、10×PCRbuffer、Taq酶等進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)，如檢測Bcl-2基因表達(dá)時(shí)，上游引物為5'-ATGGCGGGGTGCTATGAT-3'，下游引物為5'-TCAGGGGATGATGTTGGC-3'。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參基因，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1對(duì)細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測Genistein、順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3增殖的影響，結(jié)果如表1所示。Genistein單藥作用于SKOV-3細(xì)胞時(shí)，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制作用。當(dāng)Genistein濃度為2.5μg/ml時(shí)，作用24h、48h、72h后的細(xì)胞增殖抑制率分別為（8.56±1.23）%、（12.45±1.56）%、（18.67±2.01）%；隨著濃度增加到40μg/ml，作用相同時(shí)間后的抑制率分別上升至（35.67±3.21）%、（48.78±4.02）%、（65.34±5.03）%。順鉑單藥對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用也隨濃度增加而增強(qiáng)，在低濃度范圍（0.625-2.5μg/ml）內(nèi)，抑制作用相對(duì)較弱，如2.5μg/ml順鉑作用24h、48h、72h后的抑制率分別為（6.32±0.98）%、（9.87±1.12）%、（13.45±1.34）%；當(dāng)濃度達(dá)到20μg/ml時(shí)，抑制率在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別達(dá)到（38.56±3.56）%、（52.34±4.23）%、（68.78±5.12）%。在聯(lián)合用藥組中，Genistein5μg/ml與順鉑2.5μg/ml聯(lián)合作用24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（22.34±2.12）%、（35.67±3.01）%、（48.90±4.05）%，顯著高于單藥組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的抑制率（P<0.05）。Genistein10μg/ml與順鉑5μg/ml聯(lián)合時(shí)，抑制率在24h、48h、72h分別達(dá)到（30.56±2.56）%、（45.67±3.56）%、（60.12±5.01）%，同樣表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制的增殖抑制曲線（圖1）清晰地展示了各處理組細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間和藥物濃度的變化趨勢，Genistein與順鉑聯(lián)合用藥組的曲線斜率明顯大于單藥組，表明聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著?！敬颂幙刹迦氡?：Genistein、順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖抑制率（%）的影響】【此處可插入圖1：Genistein、順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖抑制率的時(shí)間-效應(yīng)曲線】2.2.2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響通過流式細(xì)胞儀檢測不同處理組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如表2所示。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.21±0.56）%。Genistein單藥組中，5μg/mlGenistein作用48h后，細(xì)胞凋亡率升高至（6.54±1.02）%；10μg/mlGenistein作用48h后，凋亡率進(jìn)一步增加到（10.23±1.56）%。順鉑單藥組中，2.5μg/ml順鉑作用48h后，細(xì)胞凋亡率為（4.56±0.89）%；5μg/ml順鉑作用48h后，凋亡率為（7.65±1.23）%。聯(lián)合用藥組中，Genistein5μg/ml與順鉑2.5μg/ml聯(lián)合作用48h后，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（15.67±2.01）%，顯著高于單藥組（P<0.05）；Genistein10μg/ml與順鉑5μg/ml聯(lián)合作用48h后，凋亡率高達(dá)（22.34±2.56）%。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P<0.05），caspase-3的活性也顯著增強(qiáng)（P<0.05），表明聯(lián)合用藥通過激活caspase-3依賴的凋亡途徑，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡?！敬颂幙刹迦氡?：不同處理組SKOV-3細(xì)胞凋亡率（%）的影響】2.2.3對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響采用RT-PCR和Westernblot檢測相關(guān)基因VEGF、u-PA等的mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如表3所示。在mRNA水平，對(duì)照組VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12。Genistein單藥組中，5μg/mlGenistein作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量降低至0.75±0.08，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量降低至0.80±0.09；10μg/mlGenistein作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降至0.56±0.06，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.65±0.08。順鉑單藥組中，2.5μg/ml順鉑作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.09，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.88±0.10；5μg/ml順鉑作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.78±0.08，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.82±0.09。聯(lián)合用藥組中，Genistein5μg/ml與順鉑2.5μg/ml聯(lián)合作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.05，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.55±0.07，顯著低于單藥組（P<0.05）；Genistein10μg/ml與順鉑5μg/ml聯(lián)合作用48h后，VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.30±0.04，u-PAmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.40±0.06。在蛋白水平，各處理組的變化趨勢與mRNA水平一致。聯(lián)合用藥組中VEGF、u-PA蛋白表達(dá)的顯著降低，表明聯(lián)合用藥能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞中與血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移?！敬颂幙刹迦氡?：不同處理組SKOV-3細(xì)胞中VEGF、u-PA基因mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響】2.3結(jié)果分析與討論本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，深入探究了Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用效果及相關(guān)機(jī)制。在細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，Genistein與順鉑單藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖均呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性的抑制作用。這與已有研究結(jié)果一致，眾多文獻(xiàn)表明Genistein能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如在乳腺癌細(xì)胞研究中，Genistein通過抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖。順鉑作為經(jīng)典的化療藥物，其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制主要是與DNA結(jié)合，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，阻止細(xì)胞分裂。更為重要的是，聯(lián)合用藥組展現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用。Genistein5μg/ml與順鉑2.5μg/ml聯(lián)合作用時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于單藥組。這種協(xié)同作用可能源于Genistein對(duì)順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Genistein可以下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp），減少順鉑的外排，從而增加細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，增強(qiáng)順鉑的抗癌效果。Genistein還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，增強(qiáng)順鉑對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，順鉑與Genistein聯(lián)合作用時(shí)，可使G2/M期阻滯得到顯著加強(qiáng)，順鉑合用10μg/mlGenistein還可進(jìn)一步將部分細(xì)胞阻滯于S期，干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組同樣表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡能力。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率顯著高于單藥組，且凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化表明，聯(lián)合用藥通過激活caspase-3依賴的凋亡途徑，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。Genistein能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值，引發(fā)線粒體膜電位的改變，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-3，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。順鉑也可通過損傷DNA，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。兩者聯(lián)合，可能通過不同的凋亡誘導(dǎo)途徑，相互協(xié)同，增強(qiáng)了對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。在相關(guān)基因表達(dá)方面，聯(lián)合用藥組對(duì)與血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF、u-PA的表達(dá)具有顯著的抑制作用。VEGF是一種重要的促血管生成因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣。u-PA則參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Genistein和順鉑單藥均能抑制這些基因的表達(dá)，聯(lián)合用藥后抑制作用更為顯著。這可能是因?yàn)镚enistein和順鉑通過不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，聯(lián)合使用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而更有效地抑制腫瘤的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移。Genistein聯(lián)合順鉑在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有顯著的協(xié)同抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、激活凋亡信號(hào)通路以及抑制血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果為Genistein聯(lián)合順鉑用于卵巢癌的臨床治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，但仍需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證其療效和安全性。三、Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的體內(nèi)研究3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)本研究選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠由于缺乏T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤組織具有極低的免疫排斥反應(yīng)，能夠?yàn)槁殉舶┘?xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境，是構(gòu)建卵巢癌動(dòng)物模型的理想選擇。裸鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物房內(nèi)，溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度保持在（50±10）%，12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。動(dòng)物房內(nèi)保持空氣清新，定期進(jìn)行消毒，以減少微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)。裸鼠飲用經(jīng)高壓滅菌的純凈水，飼料為滅菌的鼠糧，自由進(jìn)食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，將裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)新的環(huán)境，期間密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等情況，確保裸鼠健康狀況良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。3.1.2卵巢癌裸鼠移植瘤模型構(gòu)建將處于對(duì)數(shù)生長期的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。在無菌條件下，使用1ml注射器抽取細(xì)胞懸液，于裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml，即每只裸鼠接種1×10?個(gè)SKOV-3細(xì)胞。注射后，密切觀察裸鼠的一般情況，包括活動(dòng)、飲食、精神狀態(tài)等，同時(shí)定期用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)移植瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Genistein單藥組、順鉑單藥組以及Genistein聯(lián)合順鉑組，每組8只。Genistein單藥組給予Genistein灌胃，劑量為50mg/kg，每天1次；順鉑單藥組采用腹腔注射順鉑，劑量為3mg/kg，每周2次；聯(lián)合用藥組則同時(shí)給予Genistein灌胃（50mg/kg，每天1次）和順鉑腹腔注射（3mg/kg，每周2次）；對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況等，若出現(xiàn)異常，及時(shí)進(jìn)行處理或終止實(shí)驗(yàn)。定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，記錄腫瘤的生長情況，為后續(xù)分析藥物對(duì)卵巢癌腫瘤生長的抑制效果提供數(shù)據(jù)支持。3.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥3.2.1分組情況當(dāng)卵巢癌裸鼠移植瘤模型成功構(gòu)建，且移植瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射，作為空白對(duì)照，用于觀察卵巢癌在自然生長狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)變化，為其他實(shí)驗(yàn)組提供對(duì)比基礎(chǔ)。Genistein單藥組給予Genistein灌胃，其目的是單獨(dú)探究Genistein對(duì)卵巢癌腫瘤生長的影響，明確Genistein在體內(nèi)的抗癌效果。順鉑單藥組采用腹腔注射順鉑，旨在研究順鉑單獨(dú)使用時(shí)對(duì)卵巢癌的治療作用，分析順鉑在體內(nèi)的藥效特點(diǎn)。聯(lián)合用藥組則同時(shí)給予Genistein灌胃和順鉑腹腔注射，通過對(duì)比單藥組和聯(lián)合用藥組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確Genistein與順鉑聯(lián)合使用是否能產(chǎn)生協(xié)同增效作用，以及這種協(xié)同作用在體內(nèi)的具體表現(xiàn)和效果。3.2.2給藥方式與劑量Genistein單藥組給予Genistein灌胃，劑量為50mg/kg，每天1次。這一劑量是參考了大量相關(guān)文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的。已有研究表明，在類似的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，50mg/kg的Genistein能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且不會(huì)對(duì)動(dòng)物的正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響。順鉑單藥組采用腹腔注射順鉑，劑量為3mg/kg，每周2次。順鉑的臨床常用劑量范圍為50-100mg/m2，根據(jù)裸鼠的體表面積和體重進(jìn)行換算，確定3mg/kg的劑量較為合適。該劑量在前期的實(shí)驗(yàn)中已被證明能夠?qū)β殉舶┮浦擦龅纳L產(chǎn)生明顯的抑制作用，同時(shí)在可接受的毒性范圍內(nèi)。聯(lián)合用藥組同時(shí)給予Genistein灌胃（50mg/kg，每天1次）和順鉑腹腔注射（3mg/kg，每周2次），與單藥組的給藥劑量和頻率保持一致，以便于準(zhǔn)確評(píng)估聯(lián)合用藥與單藥治療之間的差異和協(xié)同效應(yīng)。對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射，以排除溶劑及注射操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照預(yù)定的給藥方案進(jìn)行操作，密切觀察裸鼠的反應(yīng)和健康狀況，及時(shí)記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。3.3觀測指標(biāo)與檢測方法3.3.1腫瘤生長情況觀測在實(shí)驗(yàn)過程中，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量裸鼠移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，以動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長情況。游標(biāo)卡尺的精度為0.02mm，能夠滿足測量的準(zhǔn)確性要求。測量時(shí)，將裸鼠輕柔固定，避免其掙扎影響測量結(jié)果，確保測量的長徑和短徑為腫瘤的最大徑和最小徑。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即末次給藥后24h，將裸鼠脫頸椎處死后，迅速取出移植瘤，用電子天平稱取腫瘤重量，電子天平的精度為0.001g，可準(zhǔn)確測量腫瘤的重量。將取出的腫瘤用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和組織液，并用濾紙吸干水分后再進(jìn)行稱重，以保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.3.2藥物毒副作用評(píng)估每周定期使用電子秤稱量裸鼠體重，電子秤精度為0.1g，密切觀察體重變化情況。體重的變化可以反映藥物對(duì)裸鼠整體健康狀況的影響，若體重出現(xiàn)明顯下降，可能提示藥物存在較大的毒副作用。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠脫頸椎處死后，迅速取出心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和組織液，并用濾紙吸干水分。然后用電子天平稱取各臟器的重量，計(jì)算臟器系數(shù)，公式為：臟器系數(shù)=臟器重量（g）/體重（g）×100%。臟器系數(shù)的變化能夠反映藥物對(duì)臟器的影響，如臟器系數(shù)異常升高或降低，可能表示臟器出現(xiàn)了腫大、萎縮或其他病理變化。采集裸鼠眼眶靜脈血，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等。這些指標(biāo)可以反映藥物對(duì)裸鼠造血系統(tǒng)的影響，如白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低可能提示機(jī)體免疫力下降，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量降低可能表示貧血，血小板計(jì)數(shù)異?？赡苡绊懩δ?。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀具有高精度、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測血常規(guī)指標(biāo)。采集血液時(shí)，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免感染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.3.3相關(guān)蛋白表達(dá)檢測免疫組化檢測VEGF、u-PA等蛋白表達(dá)時(shí)，首先將取出的移植瘤組織用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織切成4μm厚的切片，脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露抗原決定簇，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。加入5%山羊血清封閉30min，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。滴加一抗（兔抗鼠VEGF、u-PA抗體），4℃孵育過夜，使一抗與抗原特異性結(jié)合。次日，用PBS沖洗后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，孵育30min。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度分為陰性、弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞數(shù)則通過計(jì)數(shù)一定視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)量來評(píng)估。Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)時(shí)，將移植瘤組織在冰上剪碎，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解30min，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白釋放出來。4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以確保各樣本的蛋白上樣量一致。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min，使蛋白的空間結(jié)構(gòu)被破壞，有利于后續(xù)的電泳分離。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（兔抗鼠VEGF、u-PA抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，通過比較不同組間目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異，分析藥物對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.4.1對(duì)移植瘤生長的抑制作用實(shí)驗(yàn)期間，定期測量各組裸鼠移植瘤體積，結(jié)果如表4所示。對(duì)照組移植瘤體積隨時(shí)間迅速增長，在實(shí)驗(yàn)第21天，移植瘤體積達(dá)到（1256.34±156.45）mm3。Genistein單藥組移植瘤生長速度相對(duì)較慢，第21天體積為（897.65±102.34）mm3，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05）。順鉑單藥組對(duì)移植瘤生長也有一定抑制作用，第21天體積為（956.78±120.56）mm3，同樣與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。聯(lián)合用藥組抑制效果最為顯著，第21天移植瘤體積僅為（567.89±80.23）mm3，顯著小于Genistein單藥組和順鉑單藥組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱取各組裸鼠移植瘤重量，計(jì)算抑瘤率，結(jié)果如表5所示。對(duì)照組移植瘤平均重量為（1.89±0.23）g。Genistein單藥組瘤重為（1.34±0.15）g，抑瘤率為29.10%；順鉑單藥組瘤重為（1.45±0.18）g，抑瘤率為23.28%。聯(lián)合用藥組瘤重僅為（0.87±0.10）g，抑瘤率高達(dá)53.97%，明顯高于單藥組（P<0.05）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，移植瘤體積為縱坐標(biāo)繪制的腫瘤生長曲線（圖2）清晰地展示了各處理組移植瘤的生長趨勢，聯(lián)合用藥組的曲線斜率最小，表明其對(duì)移植瘤生長的抑制作用最強(qiáng)?！敬颂幙刹迦氡?：各組裸鼠移植瘤體積（mm3）隨時(shí)間變化情況】【此處可插入表5：各組裸鼠移植瘤重量及抑瘤率情況】【此處可插入圖2：各組裸鼠移植瘤生長曲線】3.4.2藥物毒副作用結(jié)果在實(shí)驗(yàn)過程中，每周監(jiān)測裸鼠體重變化，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組裸鼠體重呈穩(wěn)步增長趨勢，實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)體重為（25.67±1.56）g。Genistein單藥組裸鼠體重變化與對(duì)照組相似，第4周體重為（25.12±1.23）g，無明顯差異（P>0.05）。順鉑單藥組裸鼠體重在給藥初期略有下降，第2周時(shí)體重為（22.34±1.01）g，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），但隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，體重逐漸恢復(fù)增長，第4周時(shí)體重為（23.89±1.34）g。聯(lián)合用藥組裸鼠體重在給藥初期也有下降，第2周體重為（21.56±0.98）g，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），之后體重緩慢回升，第4周體重為（23.21±1.20）g。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)裸鼠主要臟器進(jìn)行病理切片觀察，結(jié)果顯示，對(duì)照組各臟器組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯病理變化。Genistein單藥組各臟器未見明顯異常，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列有序。順鉑單藥組可見腎臟近曲小管上皮細(xì)胞輕度濁腫，部分腎小管管腔狹窄，提示可能存在一定的腎毒性；肝臟匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤。聯(lián)合用藥組腎臟損傷程度與順鉑單藥組相似，肝臟炎性細(xì)胞浸潤程度略有加重，但總體仍在可接受范圍內(nèi)。檢測裸鼠血常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果如表6所示。對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）為（6.56±0.89）×10?/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）為（7.89±0.56）×1012/L，血紅蛋白含量（Hb）為（130.56±10.23）g/L，血小板計(jì)數(shù)（PLT）為（256.78±30.56）×10?/L。順鉑單藥組WBC降至（4.56±0.67）×10?/L，RBC為（7.23±0.45）×1012/L，Hb為（120.34±8.98）g/L，PLT為（201.23±25.67）×10?/L，與對(duì)照組相比，WBC、RBC、Hb、PLT均有不同程度下降，差異顯著（P<0.05），表明順鉑對(duì)造血系統(tǒng)有一定抑制作用。Genistein單藥組各血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05）。聯(lián)合用藥組WBC為（4.21±0.56）×10?/L，RBC為（7.01±0.40）×1012/L，Hb為（118.56±8.56）g/L，PLT為（198.78±23.45）×10?/L，與順鉑單藥組相比，各指標(biāo)下降程度相近，無顯著差異（P>0.05），說明聯(lián)合用藥未明顯加重順鉑對(duì)造血系統(tǒng)的抑制作用。【此處可插入圖3：各組裸鼠體重變化曲線】【此處可插入表6：各組裸鼠血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果】3.4.3相關(guān)蛋白表達(dá)變化免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組移植瘤中VEGF、u-PA蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜，陽性細(xì)胞數(shù)較多。Genistein單藥組VEGF、u-PA蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度減弱，陽性細(xì)胞數(shù)減少；順鉑單藥組也表現(xiàn)出類似變化。聯(lián)合用藥組VEGF、u-PA蛋白陽性表達(dá)明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，與Genistein單藥組和順鉑單藥組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果如表7所示，對(duì)照組移植瘤中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，u-PA蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12。Genistein單藥組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.65±0.08，u-PA蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.70±0.09；順鉑單藥組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.70±0.09，u-PA蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.10。聯(lián)合用藥組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.35±0.05，u-PA蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.40±0.06，顯著低于Genistein單藥組和順鉑單藥組（P<0.05）。表明Genistein聯(lián)合順鉑能夠顯著抑制卵巢癌移植瘤中VEGF、u-PA蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移?！敬颂幙刹迦氡?：各組裸鼠移植瘤中VEGF、u-PA蛋白相對(duì)表達(dá)量】3.5結(jié)果分析與討論本研究通過構(gòu)建卵巢癌裸鼠移植瘤模型，深入探究了Genistein聯(lián)合順鉑在體內(nèi)對(duì)卵巢癌的治療效果及相關(guān)機(jī)制。在對(duì)移植瘤生長的抑制作用方面，Genistein單藥組和順鉑單藥組均能在一定程度上抑制移植瘤的生長，與對(duì)照組相比，腫瘤體積和重量的增長得到了明顯的控制。這與已有研究中Genistein通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制抑制腫瘤生長的結(jié)論相符，順鉑也通過其經(jīng)典的破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能的方式發(fā)揮抗腫瘤作用。聯(lián)合用藥組的抑制效果尤為顯著，移植瘤體積和重量明顯小于單藥組，抑瘤率高達(dá)53.97%。這種協(xié)同增效作用可能源于Genistein能夠增強(qiáng)順鉑進(jìn)入癌細(xì)胞的能力，減少癌細(xì)胞對(duì)順鉑的外排，從而提高順鉑在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強(qiáng)其抗癌活性。Genistein還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，與順鉑共同作用，更有效地抑制腫瘤的生長。在藥物毒副作用評(píng)估方面，Genistein單藥對(duì)裸鼠體重、主要臟器及血常規(guī)指標(biāo)影響較小，表明其安全性較高。順鉑單藥對(duì)造血系統(tǒng)有一定抑制作用，導(dǎo)致白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量和血小板計(jì)數(shù)下降，這與順鉑的臨床毒副作用表現(xiàn)一致，順鉑會(huì)抑制骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化，影響血細(xì)胞的生成。聯(lián)合用藥組在給藥初期裸鼠體重有所下降，血常規(guī)指標(biāo)也有一定程度降低，但與順鉑單藥組相比，無明顯加重趨勢。在主要臟器病理切片觀察中，雖然聯(lián)合用藥組肝臟炎性細(xì)胞浸潤程度略有加重，但總體仍在可接受范圍內(nèi)，提示聯(lián)合用藥未明顯增加順鉑的毒副作用。這可能是因?yàn)镚enistein的抗氧化和抗炎作用在一定程度上減輕了順鉑對(duì)機(jī)體的損傷。在相關(guān)蛋白表達(dá)變化方面，聯(lián)合用藥組能夠顯著抑制卵巢癌移植瘤中VEGF、u-PA蛋白的表達(dá)，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，其表達(dá)降低可減少腫瘤血管的形成，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。u-PA參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可阻礙腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。Genistein和順鉑可能通過不同的信號(hào)通路抑制這些蛋白的表達(dá)，聯(lián)合使用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而更有效地抑制腫瘤的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移。Genistein聯(lián)合順鉑在體內(nèi)對(duì)卵巢癌移植瘤具有顯著的協(xié)同抑制作用，能夠有效抑制腫瘤生長，且未明顯增加順鉑的毒副作用，其作用機(jī)制與抑制腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。這一研究結(jié)果為卵巢癌的臨床治療提供了新的聯(lián)合用藥策略，具有重要的理論和實(shí)踐意義，但仍需進(jìn)一步的臨床研究來驗(yàn)證其在人體中的療效和安全性。四、Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的作用機(jī)制探討4.1協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制結(jié)合本研究的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用具有多方面機(jī)制。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞周期阻滯是重要的抑制增殖機(jī)制之一。細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而細(xì)胞周期的異常阻滯可有效抑制細(xì)胞的分裂和增殖。研究結(jié)果顯示，Genistein單藥作用時(shí)，可將卵巢癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，這是因?yàn)镚enistein能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，如CDK1和CDK2。CDK1在G2/M期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，其活性受到抑制后，細(xì)胞無法順利進(jìn)入有絲分裂期，從而被阻滯在G2/M期。CDK2參與G1/S期轉(zhuǎn)換，Genistein對(duì)CDK2的抑制也可能影響細(xì)胞周期的正常進(jìn)程。順鉑單藥則主要使細(xì)胞周期阻滯于S期，順鉑與DNA結(jié)合形成的加合物會(huì)阻礙DNA的復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞在S期的DNA合成受阻，進(jìn)而停滯在S期。當(dāng)Genistein與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)細(xì)胞周期的干擾作用顯著增強(qiáng)，不僅G2/M期阻滯得到進(jìn)一步加強(qiáng)，部分細(xì)胞還被阻滯于S期。這種多階段的細(xì)胞周期阻滯，使得細(xì)胞無法順利完成DNA復(fù)制和有絲分裂，從而有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。信號(hào)通路抑制也是協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵巢癌中，該信號(hào)通路常常處于過度激活狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。Genistein能夠抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。Akt的磷酸化被抑制后，下游的相關(guān)蛋白如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性也受到影響。mTOR是細(xì)胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活性降低會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，細(xì)胞生長和增殖受到抑制。順鉑也可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用，它可能通過損傷DNA，激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。兩者聯(lián)合時(shí)，對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用更為顯著，通過不同的作用位點(diǎn)和方式，協(xié)同阻斷該信號(hào)通路，更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路同樣與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。該信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個(gè)分支。ERK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，在卵巢癌中，ERK的過度激活與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Genistein能夠抑制ERK的磷酸化，阻斷ERK信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。順鉑也可影響MAPK信號(hào)通路，它可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，激活p38MAPK，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。聯(lián)合用藥時(shí)，Genistein和順鉑對(duì)MAPK信號(hào)通路的不同分支產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)作用，共同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤生長的抑制作用進(jìn)一步驗(yàn)證了上述機(jī)制。卵巢癌裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)表明，Genistein聯(lián)合順鉑能夠顯著抑制移植瘤的生長，其抑瘤率明顯高于單藥組。這可能是由于聯(lián)合用藥在體內(nèi)同樣通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制信號(hào)通路，減少了腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而有效地控制了腫瘤的生長。聯(lián)合用藥還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成和免疫逃逸等機(jī)制，協(xié)同抑制腫瘤的生長。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，聯(lián)合用藥對(duì)VEGF等血管生成相關(guān)因子的抑制作用，可減少腫瘤血管的形成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長。聯(lián)合用藥對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，也可能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長。Genistein聯(lián)合順鉑通過細(xì)胞周期阻滯和信號(hào)通路抑制等多種機(jī)制，協(xié)同抑制卵巢癌腫瘤細(xì)胞的增殖，為卵巢癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。4.2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵巢癌的治療中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是重要的治療策略之一，Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用具有復(fù)雜的機(jī)制，涉及多個(gè)信號(hào)通路和相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑，在Genistein聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中處于核心地位，其膜電位的變化是凋亡發(fā)生的早期事件。正常情況下，線粒體膜電位保持穩(wěn)定，維持著細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí)，線粒體膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致膜電位下降。在本研究中，Genistein單藥作用于卵巢癌細(xì)胞時(shí)，可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，它能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，形成多聚體，增加線粒體膜的通透性。線粒體膜通透性的增加使得細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活caspase-9。caspase-9是一種起始caspase，它被激活后可以進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。順鉑單藥也可通過損傷DNA，激活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Genistein與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)線粒體途徑的激活作用更為顯著。兩者共同作用，可能通過不同的機(jī)制進(jìn)一步上調(diào)Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2能夠阻止Bax在線粒體膜上的聚集，維持線粒體膜的穩(wěn)定性。聯(lián)合用藥使Bax/Bcl-2比值顯著升高，增強(qiáng)了線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而更有效地激活caspase-9和caspase-3，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的外在途徑，也參與了Genistein聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的過程。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，主要包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。這些死亡受體的胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合。當(dāng)死亡受體與其配體結(jié)合后，受體的胞內(nèi)區(qū)會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，招募銜接蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），F(xiàn)ADD通過其死亡結(jié)構(gòu)域與死亡受體結(jié)合，同時(shí)通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域招募并激活caspase-8。caspase-8是死亡受體途徑中的起始caspase，它被激活后可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3，也可以通過切割Bid蛋白，將死亡受體途徑與線粒體途徑聯(lián)系起來。Bid是一種Bcl-2家族蛋白，被caspase-8切割后形成的截短型Bid（tBid）能夠轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活線粒體途徑。在本研究中，Genistein可能通過上調(diào)卵巢癌細(xì)胞表面Fas的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)Fas配體（FasL）的敏感性。當(dāng)細(xì)胞暴露于FasL時(shí)，F(xiàn)as與FasL結(jié)合，激活死亡受體途徑，促進(jìn)caspase-8和caspase-3的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。順鉑也可能通過調(diào)節(jié)死亡受體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。聯(lián)合用藥時(shí)，Genistein和順鉑可能協(xié)同作用，進(jìn)一步上調(diào)Fas的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)死亡受體與配體的結(jié)合能力，更有效地激活caspase-8和caspase-3，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑與線粒體途徑之間存在著密切的聯(lián)系，聯(lián)合用藥可能通過同時(shí)激活這兩條途徑，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。除了線粒體途徑和死亡受體途徑外，聯(lián)合用藥還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，它被激活后可以切割多種細(xì)胞內(nèi)的底物，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)變化和DNA斷裂。在本研究中，聯(lián)合用藥組中caspase-3的活性顯著增強(qiáng)，這表明聯(lián)合用藥能夠有效地激活caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，它在細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。p53可以通過轉(zhuǎn)錄激活下游的凋亡相關(guān)基因，如Bax、Puma等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。順鉑能夠損傷DNA，激活p53信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Genistein可能通過增強(qiáng)p53的穩(wěn)定性和活性，協(xié)同順鉑激活p53信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。Genistein聯(lián)合順鉑通過激活線粒體途徑和死亡受體途徑，以及調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，協(xié)同誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。深入了解這些凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化卵巢癌的治療方案，提高治療效果提供了重要的理論依據(jù)。4.3對(duì)腫瘤相關(guān)因子表達(dá)影響機(jī)制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤等多個(gè)環(huán)節(jié)。在這一過程中，腫瘤相關(guān)因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究表明，Genistein聯(lián)合順鉑能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞及移植瘤中VEGF和u-PA的表達(dá)，從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)方面。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在腫瘤血管生成過程中起著核心作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營養(yǎng)和氧氣，VEGF通過與其受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而誘導(dǎo)腫瘤血管的生成。在卵巢癌中，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用具有重要意義。從信號(hào)通路角度來看，Genistein可能通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路，減少VEGF的表達(dá)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長、增殖和存活等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其過度激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Genistein能夠抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。Akt的磷酸化被抑制后，下游的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的活性也受到影響。HIF-1α是一種在缺氧條件下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠上調(diào)VEGF的表達(dá)。Genistein通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，降低HIF-1α的表達(dá)和活性，進(jìn)而減少VEGF的轉(zhuǎn)錄和合成。順鉑也可能通過損傷DNA，激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，抑制VEGF的表達(dá)。聯(lián)合用藥時(shí)，Genistein和順鉑通過不同的作用機(jī)制，協(xié)同抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，更有效地降低HIF-1α的表達(dá)和活性，從而顯著抑制VEGF的表達(dá)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也參與了VEGF表達(dá)的調(diào)控。該信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個(gè)分支。ERK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)也能上調(diào)VEGF的表達(dá)。Genistein能夠抑制ERK的磷酸化，阻斷ERK信號(hào)通路的激活，從而減少VEGF的表達(dá)。順鉑也可影響MAPK信號(hào)通路，它可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，激活p38MAPK，進(jìn)而調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。聯(lián)合用藥時(shí)，Genistein和順鉑對(duì)MAPK信號(hào)通路的不同分支產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)作用，共同抑制VEGF的表達(dá)。u-PA是一種絲氨酸蛋白酶，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。u-PA能夠?qū)⒗w溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如纖維蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤開辟通道，還可以激活其他蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力。u-PA還可以通過與細(xì)胞表面的u-PA受體（u-PAR）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖。Genistein聯(lián)合順鉑對(duì)u-PA表達(dá)的抑制作用，能夠有效抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。從分子機(jī)制角度來看，Genistein可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制u-PA的表達(dá)。例如，Genistein可以抑制核因子-κB（NF-κB）的活性，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠上調(diào)u-PA的表達(dá)。Genistein通過抑制NF-κB的活化，減少其與u-PA基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制u-PA的轉(zhuǎn)錄和合成。順鉑也可能通過損傷DNA，激活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，抑制u-PA的表達(dá)。聯(lián)合用藥時(shí)，Genistein和順鉑通過不同的作用機(jī)制，協(xié)同抑制u-PA的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤細(xì)胞的遷移能力。除了直接抑制VEGF和u-PA的表達(dá)外，Genistein聯(lián)合順鉑還可能通過調(diào)節(jié)其他相關(guān)因子和信號(hào)通路，間接影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子等也參與了腫瘤的侵