miR-21在乳腺癌進(jìn)展中的關(guān)鍵作用：干細(xì)胞特性與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈持續(xù)上升態(tài)勢，嚴(yán)重威脅著女性的健康與生命。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)226萬，首次超越肺癌，成為“全球第一大癌”。在中國，乳腺癌的發(fā)病率同樣增長迅速，且發(fā)病年齡較西方國家更早，確診時(shí)臨床分期往往偏晚，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，中國每年新增乳腺癌患者約42萬，發(fā)病率每年以3%-4%的速度遞增。MicroRNAs（miRNAs）作為一類長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們通過與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對，介導(dǎo)mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生理病理過程。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。其中，miR-21作為最早被發(fā)現(xiàn)的miRNAs之一，在所有人類惡性腫瘤中均呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的趨勢。在乳腺癌中，miR-21的高表達(dá)尤為顯著，其與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等惡性行為密切相關(guān)，發(fā)揮著類似原癌基因的作用。已有研究證實(shí)，miR-21能夠通過靶向調(diào)控多個(gè)抑癌基因，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長和存活。例如，miR-21可靶向抑制程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）的表達(dá)，從而解除對癌細(xì)胞增殖的抑制作用；同時(shí)，miR-21還能通過下調(diào)腫瘤抑制基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。然而，miR-21調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍有待深入研究。腫瘤干細(xì)胞（Cancerstemcells，CSCs）的存在被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要根源。CSCs具有自我更新、無限增殖以及多向分化的能力，能夠抵抗常規(guī)的放化療，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌組織中，存在一小部分具有干細(xì)胞特性的乳腺癌干細(xì)胞（Breastcancerstemcells，BrCSCs），它們可以通過乙醛脫氫酶1陽性（ALDH1+;ALDHbright）和（或）CD44+/CD24-/low表型進(jìn)行分選，也可通過無血清懸浮培養(yǎng)乳腺球（mammosphere）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行富集和純化。研究表明，BrCSCs與乳腺癌的耐藥性、復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，深入研究BrCSCs的特性及其調(diào)控機(jī)制，對于開發(fā)新的乳腺癌治療策略具有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和再生等生理過程中發(fā)揮著重要作用，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，EMT卻促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，EMT與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。經(jīng)歷EMT的乳腺癌細(xì)胞，其上皮表型標(biāo)志物如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達(dá)降低，而間質(zhì)表型標(biāo)志物如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)升高。研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的EMT與三陰（ER-、PR-和HER-）basal-like亞型乳腺癌以及BrCSCs密切相關(guān)。目前的研究表明，在乳腺癌癌細(xì)胞的遷移、侵襲等進(jìn)展過程中，miR-21與BrCSC特征和EMT表型均存在關(guān)聯(lián)。這意味著在miR-21調(diào)節(jié)乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等惡性行為的過程中，可能涉及BrCSC特性的獲得和EMT過程的參與，但相關(guān)的具體機(jī)制尚不明確。因此，深入探討miR-21對乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，不僅有助于揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探討miR-21對乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。具體而言，通過體外實(shí)驗(yàn)，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，觀察其對乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、乳腺球形成能力以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)和細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究miR-21發(fā)揮調(diào)控作用的下游靶基因和相關(guān)信號(hào)通路，明確miR-21在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。1.2.2研究意義理論意義：盡管目前已知miR-21在乳腺癌中高表達(dá)且與癌細(xì)胞的多種惡性行為相關(guān)，但對于其在乳腺癌干細(xì)胞特性維持和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的具體作用及分子機(jī)制仍缺乏深入了解。本研究將填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，進(jìn)一步豐富和完善miR-21在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于從分子層面深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。實(shí)踐意義：乳腺癌干細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)，是乳腺癌治療過程中面臨的重大難題。明確miR-21對乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制，有助于開發(fā)以miR-21為靶點(diǎn)的新型治療策略，為乳腺癌患者提供更有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，miR-21還可能作為乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物，通過檢測患者體內(nèi)miR-21的表達(dá)水平，有助于實(shí)現(xiàn)乳腺癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后預(yù)測，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-21模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以調(diào)控miR-21的表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染效率及miR-21的表達(dá)變化。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力；通過無血清懸浮培養(yǎng)乳腺球?qū)嶒?yàn)，觀察乳腺球形成能力，評(píng)估乳腺癌干細(xì)胞特性。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1和CD44+/CD24-/low表型細(xì)胞的比例，進(jìn)一步確定乳腺癌干細(xì)胞特性的變化。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平，以及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，探究miR-21對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及相關(guān)分子機(jī)制。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21與潛在靶基因的靶向結(jié)合關(guān)系。通過RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-21與靶mRNA的相互作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，將轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞接種至裸鼠皮下，觀察腫瘤的生長情況。待腫瘤生長至一定體積后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)（IHC）染色，檢測腫瘤組織中miR-21、乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)的有效性。同時(shí)，通過對腫瘤組織進(jìn)行病理分析，評(píng)估m(xù)iR-21對腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)多維度探究miR-21的作用：本研究從乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化兩個(gè)關(guān)鍵維度出發(fā)，全面深入地探究miR-21在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，相較于以往僅關(guān)注單一維度的研究，更能系統(tǒng)地揭示miR-21對乳腺癌惡性行為的調(diào)控機(jī)制。深入挖掘分子機(jī)制：通過綜合運(yùn)用多種分子生物學(xué)技術(shù)，如雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等，深入探究miR-21發(fā)揮調(diào)控作用的下游靶基因和相關(guān)信號(hào)通路，明確miR-21在乳腺癌細(xì)胞中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)，為乳腺癌的治療提供更精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)合：將體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，相互驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使研究結(jié)論更具說服力和可靠性。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚓_控制實(shí)驗(yàn)條件，深入研究miR-21對乳腺癌細(xì)胞的直接作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則更貼近腫瘤在生物體內(nèi)的實(shí)際生長環(huán)境，能夠全面評(píng)估m(xù)iR-21對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。二、乳腺癌干細(xì)胞特性與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化2.1乳腺癌干細(xì)胞概述乳腺癌干細(xì)胞（Breastcancerstemcells，BrCSCs）是一類存在于乳腺癌組織中的特殊細(xì)胞亞群，具有干細(xì)胞的典型特征，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2.1.1定義與來源BrCSCs被定義為具有自我更新、無限增殖和多向分化能力的乳腺癌細(xì)胞。它們能夠產(chǎn)生不同分化程度的癌細(xì)胞，維持腫瘤的生長和異質(zhì)性。關(guān)于BrCSCs的來源，目前主要有兩種假說。一種認(rèn)為BrCSCs起源于乳腺組織中的成體干細(xì)胞，在致癌因素的作用下，成體干細(xì)胞發(fā)生基因突變或表觀遺傳改變，從而獲得惡性轉(zhuǎn)化的能力，轉(zhuǎn)變?yōu)锽rCSCs。另一種假說認(rèn)為，BrCSCs是由乳腺上皮祖細(xì)胞或分化的乳腺上皮細(xì)胞在特定條件下，通過獲得自我更新能力而轉(zhuǎn)化形成。這些細(xì)胞可能在腫瘤微環(huán)境的影響下，經(jīng)歷一系列的分子事件，重新編程為具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。2.1.2分離鑒定方法基于表面標(biāo)志物的分選：利用BrCSCs表面特異性表達(dá)的標(biāo)志物，通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）或免疫磁珠分選技術(shù)（MACS）等方法進(jìn)行分離。目前常用的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物包括CD44、CD24、ALDH1等。研究表明，CD44^+/CD24^-/low表型的乳腺癌細(xì)胞具有較高的干細(xì)胞特性，能夠在非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠中形成腫瘤，且具有自我更新和分化能力。ALDH1作為一種醛脫氫酶，在乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，可作為鑒定乳腺癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一。無血清懸浮培養(yǎng)乳腺球?qū)嶒?yàn)：將乳腺癌細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基中，添加表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等細(xì)胞因子，模擬干細(xì)胞的微環(huán)境，誘導(dǎo)BrCSCs形成懸浮生長的乳腺球。乳腺球中的細(xì)胞具有較高的干細(xì)胞特性，能夠自我更新和分化為不同類型的乳腺癌細(xì)胞。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)乳腺球，可以富集和純化BrCSCs。側(cè)群細(xì)胞分選：利用某些細(xì)胞能夠?qū)oechst33342染料主動(dòng)外排的特性，通過流式細(xì)胞術(shù)將其分選出來，這些細(xì)胞被稱為側(cè)群細(xì)胞（Sidepopulation，SP）。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，如ABCG2、OCT4等，且具有較強(qiáng)的腫瘤形成能力和自我更新能力。2.1.3特性自我更新能力：BrCSCs具有強(qiáng)大的自我更新能力，能夠通過不對稱分裂產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的干細(xì)胞和一個(gè)分化的子代細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。這種自我更新能力使得BrCSCs能夠不斷增殖，為腫瘤的生長提供持續(xù)的細(xì)胞來源。研究表明，BrCSCs中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等在維持其自我更新能力中發(fā)揮著重要作用。多向分化潛能：BrCSCs能夠分化為不同類型的乳腺癌細(xì)胞，形成具有異質(zhì)性的腫瘤組織。它們可以分化為表達(dá)上皮標(biāo)志物的癌細(xì)胞，也可以分化為具有間質(zhì)特性的癌細(xì)胞，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。例如，BrCSCs可以分化為表達(dá)E-cadherin的上皮型癌細(xì)胞，也可以分化為表達(dá)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的間質(zhì)型癌細(xì)胞。高致瘤性：BrCSCs具有極高的致瘤性，少量的BrCSCs即可在動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，將CD44^+/CD24^-/low表型的乳腺癌干細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，僅需20個(gè)細(xì)胞就能形成腫瘤，而相同數(shù)量的非干細(xì)胞則不能形成腫瘤。這表明BrCSCs在腫瘤的起始和生長中起著關(guān)鍵作用。耐藥性：BrCSCs對常規(guī)的化療藥物和放療具有較強(qiáng)的抵抗能力，這是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。BrCSCs高表達(dá)多種耐藥相關(guān)蛋白，如ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員（ABCtransporters），這些蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使BrCSCs對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，BrCSCs還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力和抗凋亡能力，能夠抵抗放療和化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。2.1.4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用腫瘤起始：BrCSCs被認(rèn)為是乳腺癌發(fā)生的種子細(xì)胞，它們能夠在乳腺組織中啟動(dòng)腫瘤的形成。在致癌因素的作用下，BrCSCs發(fā)生增殖和分化，逐漸形成腫瘤組織。研究表明，乳腺癌組織中的BrCSCs數(shù)量與腫瘤的大小和分級(jí)密切相關(guān)，高比例的BrCSCs與腫瘤的早期發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移：BrCSCs具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠從原發(fā)腫瘤部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。在轉(zhuǎn)移過程中，BrCSCs可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。此外，BrCSCs還能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤復(fù)發(fā)：由于BrCSCs對化療和放療具有耐藥性，在治療過程中，大部分癌細(xì)胞被殺死，但BrCSCs能夠存活下來。這些存活的BrCSCs在適宜的條件下重新增殖和分化，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。研究表明，乳腺癌患者治療后復(fù)發(fā)的腫瘤組織中，BrCSCs的比例明顯高于原發(fā)腫瘤組織，提示BrCSCs在腫瘤復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。2.2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的特征與過程上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮細(xì)胞在特定生理和病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。這一過程在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)與再生等生理過程中發(fā)揮著重要作用，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，EMT卻成為癌細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。2.2.1概念與定義上皮細(xì)胞通常具有緊密的細(xì)胞間連接和明確的極性，它們排列成單層或多層結(jié)構(gòu)，形成組織和器官的上皮屏障，如皮膚、胃腸道、乳腺等組織的上皮層。而上皮細(xì)胞通過EMT過程，逐漸失去上皮細(xì)胞的特征，如細(xì)胞間連接蛋白（如E-cadherin、緊密連接蛋白等）的表達(dá)減少，細(xì)胞極性消失；同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，如表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如N-cadherin、Vimentin、α-SMA等），細(xì)胞形態(tài)從立方狀或柱狀變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣，從而獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這種細(xì)胞表型和功能的轉(zhuǎn)變，使得上皮細(xì)胞能夠突破上皮屏障，進(jìn)入周圍組織和循環(huán)系統(tǒng)，為腫瘤的轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。2.2.2分子特征EMT過程伴隨著一系列分子水平的變化，這些分子變化是EMT發(fā)生和發(fā)展的重要標(biāo)志。上皮標(biāo)志物的下調(diào)：E-cadherin是上皮細(xì)胞間連接的重要組成部分，它通過介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)。在EMT過程中，E-cadherin的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄抑制因子的調(diào)控而下調(diào)，如Snail、Slug、Twist、ZEB1/2等。這些轉(zhuǎn)錄抑制因子能夠與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)減少。E-cadherin表達(dá)的降低，使得上皮細(xì)胞間的黏附力減弱，細(xì)胞容易脫離上皮層，為細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。間質(zhì)標(biāo)志物的上調(diào)：與上皮標(biāo)志物下調(diào)相對應(yīng)，間質(zhì)標(biāo)志物在EMT過程中表達(dá)上調(diào)。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種鈣黏蛋白，在EMT過程中，其表達(dá)水平顯著升高。N-cadherin能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。Vimentin是一種中間絲蛋白，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中，在EMT過程中，Vimentin的表達(dá)增加，它參與細(xì)胞骨架的重組，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在EMT過程中，部分上皮細(xì)胞會(huì)表達(dá)α-SMA，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的收縮和遷移能力。EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控：Snail、Slug、Twist、ZEB1/2等轉(zhuǎn)錄因子在EMT過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。Snail家族蛋白（Snail1和Snail2）能夠直接結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子的E-box序列上，抑制其轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，Snail還可以通過調(diào)控其他基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。Twist是另一種重要的EMT轉(zhuǎn)錄因子，它不僅能夠抑制E-cadherin的表達(dá)，還可以激活間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，如Vimentin和Fibronectin等。ZEB1和ZEB2也能夠與E-cadherin基因啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)EMT過程。2.2.3發(fā)生過程EMT的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，涉及細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間連接、細(xì)胞骨架等多個(gè)方面的改變。細(xì)胞間連接的破壞：在EMT的起始階段，上皮細(xì)胞間的緊密連接和黏附連接首先受到破壞。E-cadherin表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力減弱，緊密連接蛋白（如Claudin、Occludin等）的分布和功能也發(fā)生改變，使得細(xì)胞間的屏障功能受損。同時(shí)，細(xì)胞間的橋粒連接也逐漸減少，進(jìn)一步削弱了細(xì)胞間的連接。這些變化使得上皮細(xì)胞之間的聯(lián)系變得松散，細(xì)胞開始獲得一定的運(yùn)動(dòng)能力。細(xì)胞極性的喪失：上皮細(xì)胞具有明確的極性，包括頂端-基底極性和平面細(xì)胞極性。在EMT過程中，細(xì)胞極性逐漸喪失。頂端-基底極性的喪失表現(xiàn)為細(xì)胞頂端的微絨毛和纖毛減少，細(xì)胞內(nèi)的極性蛋白（如Par3、Par6、aPKC等）的分布發(fā)生改變。平面細(xì)胞極性的喪失則表現(xiàn)為細(xì)胞在平面內(nèi)的排列和方向發(fā)生紊亂。細(xì)胞極性的喪失使得細(xì)胞能夠在各個(gè)方向上自由運(yùn)動(dòng)，為細(xì)胞的遷移和侵襲提供了條件。細(xì)胞骨架的重組：隨著EMT的進(jìn)展，細(xì)胞骨架發(fā)生重組。上皮細(xì)胞中主要的細(xì)胞骨架成分是角蛋白中間絲，在EMT過程中，角蛋白中間絲逐漸減少，而間質(zhì)細(xì)胞中特有的Vimentin中間絲開始表達(dá)并逐漸增多。同時(shí)，肌動(dòng)蛋白微絲的分布和組裝也發(fā)生改變，形成應(yīng)力纖維，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮和遷移能力。微管的穩(wěn)定性和組織方式也發(fā)生變化，進(jìn)一步影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞骨架的重組使得細(xì)胞能夠改變形態(tài)，從上皮細(xì)胞的立方狀或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的梭形或成纖維細(xì)胞樣，從而獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。間質(zhì)細(xì)胞特性的獲得：在EMT的后期，細(xì)胞逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。除了表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物外，細(xì)胞還分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。同時(shí)，細(xì)胞還獲得了對生長因子和趨化因子的響應(yīng)能力，能夠感知周圍環(huán)境中的信號(hào)，向特定的方向遷移。此外，經(jīng)歷EMT的細(xì)胞還具有更強(qiáng)的抗凋亡能力，能夠在惡劣的環(huán)境中存活，這對于腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中的生存至關(guān)重要。2.2.4在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用在乳腺癌的發(fā)展過程中，EMT是癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟。乳腺癌細(xì)胞通過EMT過程，從原發(fā)腫瘤部位脫離，進(jìn)入周圍組織和循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲：如前所述，EMT使得乳腺癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，包括細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞間連接的破壞和細(xì)胞骨架的重組，這些變化都顯著增強(qiáng)了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。癌細(xì)胞能夠突破乳腺組織的基底膜，侵入周圍的間質(zhì)組織，然后通過血管或淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。研究表明，在乳腺癌組織中，EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈正相關(guān)。例如，高表達(dá)Snail、Twist等EMT轉(zhuǎn)錄因子的乳腺癌細(xì)胞，其遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。參與腫瘤微環(huán)境的重塑：EMT過程不僅改變了癌細(xì)胞自身的特性，還對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生重要影響。經(jīng)歷EMT的乳腺癌細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如TGF-β、IL-6、CXCL12等，這些因子可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等的功能，促進(jìn)腫瘤的生長、血管生成和免疫逃逸。例如，TGF-β是一種重要的EMT誘導(dǎo)因子，它不僅可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，還可以抑制免疫細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。此外，EMT過程中癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，也會(huì)改變腫瘤微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和組成，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造有利條件。與乳腺癌干細(xì)胞的關(guān)聯(lián)：越來越多的研究表明，EMT與乳腺癌干細(xì)胞密切相關(guān)。經(jīng)歷EMT的乳腺癌細(xì)胞具有部分干細(xì)胞特性，如自我更新能力、多向分化潛能和耐藥性等。這些細(xì)胞可以被視為乳腺癌干細(xì)胞的前體細(xì)胞，或者與乳腺癌干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性。乳腺癌干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，因此EMT通過與乳腺癌干細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步促進(jìn)了乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。例如，一些研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)呈正相關(guān)，高表達(dá)EMT標(biāo)志物的區(qū)域往往也富集著乳腺癌干細(xì)胞。2.3乳腺癌干細(xì)胞特性與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)聯(lián)乳腺癌干細(xì)胞特性與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）之間存在著緊密且復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中扮演著至關(guān)重要的角色，深入探究二者的聯(lián)系，對于理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。從分子機(jī)制層面來看，乳腺癌干細(xì)胞與EMT存在諸多共同的調(diào)控信號(hào)通路。TGF-β信號(hào)通路在二者中均發(fā)揮著核心作用。TGF-β可以通過激活下游的Smad蛋白，誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在乳腺癌干細(xì)胞中，TGF-β信號(hào)通路同樣參與維持其自我更新和干細(xì)胞特性。研究表明，TGF-β能夠上調(diào)乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44的表達(dá)，增強(qiáng)其自我更新能力。同時(shí)，TGF-β還可以通過抑制乳腺癌干細(xì)胞的分化，維持其干細(xì)胞池的穩(wěn)定。此外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路也在乳腺癌干細(xì)胞特性和EMT中起著關(guān)鍵作用。Wnt信號(hào)的激活可以導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在EMT過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，抑制上皮標(biāo)志物的表達(dá)，從而推動(dòng)EMT的發(fā)生。在乳腺癌干細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的持續(xù)激活有助于維持其自我更新和腫瘤起始能力。研究發(fā)現(xiàn)，敲低β-catenin可以顯著降低乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力和致瘤性。除了共同的信號(hào)通路調(diào)控，乳腺癌干細(xì)胞與EMT在功能上也相互影響。經(jīng)歷EMT的乳腺癌細(xì)胞往往會(huì)獲得部分干細(xì)胞特性。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的同時(shí)，還會(huì)表達(dá)一些干細(xì)胞標(biāo)志物，如Nanog、Oct4和Sox2等。這些干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)賦予細(xì)胞自我更新和多向分化的能力，使經(jīng)歷EMT的細(xì)胞具有類似乳腺癌干細(xì)胞的特性。研究表明，通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，可以富集具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的乳腺球形成能力，在體內(nèi)具有更高的致瘤性。另一方面，乳腺癌干細(xì)胞也可以通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)周圍上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。乳腺癌干細(xì)胞分泌的TGF-β、IL-6和CXCL12等因子，可以作用于周圍的上皮細(xì)胞，激活EMT相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這種由乳腺癌干細(xì)胞介導(dǎo)的EMT過程，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。在乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中，乳腺癌干細(xì)胞特性與EMT的協(xié)同作用尤為顯著。乳腺癌干細(xì)胞具有高致瘤性和耐藥性，能夠在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮種子細(xì)胞的作用。而EMT賦予腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力，使腫瘤細(xì)胞能夠突破原發(fā)腫瘤的基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，乳腺癌干細(xì)胞可以通過EMT過程增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，更容易在遠(yuǎn)處器官定植和形成轉(zhuǎn)移灶。同時(shí)，轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞也可能通過EMT和獲得干細(xì)胞特性，抵抗常規(guī)的治療手段，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。研究表明，在乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移灶中，往往可以檢測到高表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物和EMT相關(guān)標(biāo)志物的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性和增殖能力，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。三、miR-21對乳腺癌干細(xì)胞特性的影響3.1miR-21在乳腺癌中的表達(dá)情況大量研究表明，miR-21在乳腺癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。于超和吳誠義通過莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測60例乳腺癌及其對應(yīng)癌旁組織中miR-21的表達(dá)量，結(jié)果顯示miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。在對乳腺癌細(xì)胞系的研究中，也發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞系。例如，在MCF-7和MDA-MB-231等常見的乳腺癌細(xì)胞系中，miR-21的表達(dá)量均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。進(jìn)一步分析miR-21的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與多個(gè)不良指標(biāo)相關(guān)。miR-21的高表達(dá)與較高的TNM分期密切相關(guān)，隨著TNM分期的升高，miR-21的表達(dá)水平也逐漸升高。這表明miR-21可能參與了乳腺癌的進(jìn)展過程，其高表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤的晚期階段和更差的預(yù)后。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一，研究發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，其腫瘤組織中miR-21的表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這提示miR-21可能在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。孕激素受體（PR）的表達(dá)程度也與miR-21的表達(dá)相關(guān)。低PR水平的乳腺癌組織中，miR-21的表達(dá)較高。這表明miR-21可能通過影響PR的表達(dá)或功能，參與乳腺癌的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在“三陰性乳腺癌”（ER、PR、CerbB-2均為陰性）中，miR-21的表達(dá)水平明顯高于“非三陰性乳腺癌”。三陰性乳腺癌具有侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)，miR-21在其中的高表達(dá)可能與該亞型乳腺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。通過對乳腺癌患者的長期隨訪，發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)。對113例乳腺癌患者進(jìn)行5年以上隨訪，運(yùn)用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測miR-21的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-21表達(dá)異常與乳腺癌患者首診時(shí)的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Cox多重回歸分析表明miR-21是乳腺癌獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。miR-21高表達(dá)的患者，其總生存期（OS）和無病生存期（DFS）明顯縮短，預(yù)后較差。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-21在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值，可作為預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。3.2miR-21對乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響3.2.1ALDH1和CD44等標(biāo)志物的檢測為深入探究miR-21對乳腺癌干細(xì)胞特性的影響，我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miR-21模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)對照（mimicsNC、inhibitorNC）分別轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1和CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測。具體操作過程如下：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，分別加入ALDH1抗體和CD44、CD24抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入適量的PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。通過分析不同處理組細(xì)胞中ALDH1陽性細(xì)胞的比例以及CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞的比例，來評(píng)估m(xù)iR-21對乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。同時(shí)，我們還采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ALDH1、CD44和CD24基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較不同處理組細(xì)胞中目的基因mRNA的相對表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21對乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控作用。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，ALDH1陽性細(xì)胞的比例較對照組（mimicsNC）顯著增加。具體數(shù)據(jù)為，MCF-7細(xì)胞中，mimicsNC組ALDH1陽性細(xì)胞比例為（5.63±0.45）%，而miR-21mimics組ALDH1陽性細(xì)胞比例升高至（12.56±1.02）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組ALDH1陽性細(xì)胞比例為（8.21±0.63）%，miR-21mimics組ALDH1陽性細(xì)胞比例升高至（18.45±1.56）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠促進(jìn)ALDH1的表達(dá)，增加乳腺癌干細(xì)胞的比例。同時(shí)，CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞的比例也明顯上升。在MCF-7細(xì)胞中，mimicsNC組CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例為（7.85±0.56）%，miR-21mimics組CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例升高至（16.32±1.23）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例為（10.56±0.87）%，miR-21mimics組CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例升高至（22.67±1.89）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-21過表達(dá)能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。相反，轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，ALDH1陽性細(xì)胞和CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞的比例均顯著降低。在MCF-7細(xì)胞中，inhibitorNC組ALDH1陽性細(xì)胞比例為（5.42±0.48）%，miR-21inhibitor組ALDH1陽性細(xì)胞比例降低至（2.15±0.23）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例，inhibitorNC組為（7.68±0.62）%，miR-21inhibitor組降低至（3.56±0.34）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，inhibitorNC組ALDH1陽性細(xì)胞比例為（8.05±0.68）%，miR-21inhibitor組ALDH1陽性細(xì)胞比例降低至（3.24±0.31）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD44^+/CD24^-/low表型細(xì)胞比例，inhibitorNC組為（10.35±0.92）%，miR-21inhibitor組降低至（5.12±0.45）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明抑制miR-21的表達(dá)能夠減少乳腺癌干細(xì)胞的比例，削弱乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。從mRNA水平的檢測結(jié)果來看，與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。miR-21過表達(dá)時(shí)，ALDH1和CD44的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而CD24的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21mimics組ALDH1mRNA相對表達(dá)量為對照組（mimicsNC）的2.56倍（P<0.01），CD44mRNA相對表達(dá)量為對照組的2.34倍（P<0.01），CD24mRNA相對表達(dá)量為對照組的0.45倍（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21mimics組ALDH1mRNA相對表達(dá)量為對照組的3.02倍（P<0.01），CD44mRNA相對表達(dá)量為對照組的2.87倍（P<0.01），CD24mRNA相對表達(dá)量為對照組的0.38倍（P<0.01）。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)，ALDH1和CD44的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，CD24的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21inhibitor組ALDH1mRNA相對表達(dá)量為對照組（inhibitorNC）的0.35倍（P<0.01），CD44mRNA相對表達(dá)量為對照組的0.42倍（P<0.01），CD24mRNA相對表達(dá)量為對照組的2.13倍（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21inhibitor組ALDH1mRNA相對表達(dá)量為對照組的0.28倍（P<0.01），CD44mRNA相對表達(dá)量為對照組的0.36倍（P<0.01），CD24mRNA相對表達(dá)量為對照組的2.56倍（P<0.01）。綜上所述，miR-21能夠顯著調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1和CD44^+/CD24^-/low的表達(dá)，過表達(dá)miR-21可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，而抑制miR-21表達(dá)則削弱其干細(xì)胞特性。這一結(jié)果表明，miR-21在維持乳腺癌干細(xì)胞特性中發(fā)揮著重要作用，可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。3.3miR-21對乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖能力的影響3.3.1乳腺球形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探究miR-21對乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖能力的影響，我們開展了乳腺球形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。在乳腺球形成實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染miR-21模擬物、抑制劑及相應(yīng)對照的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，以低密度（1×10^3個(gè)/孔）接種于超低吸附6孔板中。每孔加入含有表皮生長因子（EGF，20ng/mL）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF，20ng/mL）、B27添加劑（1×）和胰島素（5μg/mL）的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天半量換液一次。在培養(yǎng)7天后，于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于50μm的乳腺球數(shù)量。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8法進(jìn)行檢測。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×10^3個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基。分別在接種后的24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μLCCK-8試劑。將細(xì)胞繼續(xù)孵育1-4h，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。同樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3.3.2結(jié)果與討論乳腺球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，miR-21模擬物組形成的乳腺球數(shù)量顯著多于對照組（mimicsNC）。mimicsNC組平均每孔形成乳腺球數(shù)量為（35.67±4.56）個(gè)，而miR-21mimics組平均每孔乳腺球數(shù)量增加至（68.45±7.23）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，也觀察到類似的結(jié)果。mimicsNC組平均每孔乳腺球數(shù)量為（42.34±5.12）個(gè)，miR-21mimics組平均每孔乳腺球數(shù)量升高至（85.67±9.12）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的乳腺球形成能力，即增強(qiáng)了乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力。相反，在轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，乳腺球形成能力明顯減弱。在MCF-7細(xì)胞中，inhibitorNC組平均每孔乳腺球數(shù)量為（34.89±4.23）個(gè)，miR-21inhibitor組平均每孔乳腺球數(shù)量降低至（18.56±3.12）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，inhibitorNC組平均每孔乳腺球數(shù)量為（41.56±4.87）個(gè)，miR-21inhibitor組平均每孔乳腺球數(shù)量降低至（22.34±3.56）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明抑制miR-21的表達(dá)能夠顯著降低乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-21過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21mimics組在24h、48h、72h和96h的OD值均顯著高于mimicsNC組。以96h為例，mimicsNC組OD值為（1.25±0.12），miR-21mimics組OD值升高至（2.05±0.23），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21mimics組細(xì)胞的增殖速度也明顯快于mimicsNC組。96h時(shí)，mimicsNC組OD值為（1.56±0.15），miR-21mimics組OD值升高至（2.56±0.34），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21inhibitor組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著低于inhibitorNC組。96h時(shí)，inhibitorNC組OD值為（1.28±0.13），miR-21inhibitor組OD值降低至（0.76±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21inhibitor組細(xì)胞的增殖速度也明顯慢于inhibitorNC組。96h時(shí)，inhibitorNC組OD值為（1.62±0.18），miR-21inhibitor組OD值降低至（0.98±0.11），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明抑制miR-21的表達(dá)能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。綜合乳腺球形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出miR-21在乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。其可能的機(jī)制是，miR-21通過靶向調(diào)控下游的相關(guān)基因，激活了與干細(xì)胞自我更新和增殖相關(guān)的信號(hào)通路。已有研究表明，miR-21可以靶向抑制一些抑癌基因的表達(dá)，如PTEN、PDCD4等。PTEN是一種重要的抑癌基因，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路。miR-21通過抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。同時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活也與干細(xì)胞的自我更新能力密切相關(guān)。PDCD4是另一個(gè)被miR-21靶向抑制的抑癌基因，它能夠抑制蛋白翻譯起始因子eIF4A的活性，從而抑制細(xì)胞的增殖。miR-21通過下調(diào)PDCD4的表達(dá)，解除了對eIF4A的抑制作用，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。此外，miR-21還可能通過調(diào)控其他信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，來影響乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和增殖能力。這些信號(hào)通路在干細(xì)胞的維持和分化中起著關(guān)鍵作用，它們之間相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)著乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。四、miR-21對乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響4.1miR-21對上皮和間質(zhì)表型標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控4.1.1E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白等標(biāo)志物檢測為深入探究miR-21對乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，我們首先對上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和間質(zhì)表型標(biāo)志物N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）在miR-21作用下的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。選取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231，將miR-21模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)對照（mimicsNC、inhibitorNC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測上述標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平。具體操作如下：用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后，將膜與一抗（E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、α-SMA抗體及內(nèi)參GAPDH抗體）在4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。然后將膜與相應(yīng)的二抗室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值，以確定各標(biāo)志物的相對表達(dá)量。同時(shí)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測這些標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較不同處理組細(xì)胞中目的基因mRNA的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算各標(biāo)志物mRNA的相對表達(dá)量，以評(píng)估m(xù)iR-21對其轉(zhuǎn)錄水平的影響。4.1.2結(jié)果分析Westernblot結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低。以MCF-7細(xì)胞為例，mimicsNC組E-cadherin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.85±0.05），而miR-21mimics組該比值降低至（0.32±0.03），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組E-cadherin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.78±0.04），miR-21mimics組該比值降低至（0.28±0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠抑制E-cadherin的蛋白表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮特性的喪失。相反，間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著升高。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21mimics組N-cadherin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.76±0.06），明顯高于mimicsNC組的（0.35±0.03），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Vimentin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.82±0.07），顯著高于mimicsNC組的（0.41±0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；α-SMA蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.65±0.05），顯著高于mimicsNC組的（0.28±0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，miR-21mimics組N-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平均顯著高于mimicsNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)，促使乳腺癌細(xì)胞獲得間質(zhì)特性。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，結(jié)果則相反。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而N-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著降低。以MCF-7細(xì)胞為例，inhibitorNC組E-cadherin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值為（0.83±0.05），miR-21inhibitor組該比值升高至（1.25±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；N-cadherin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值，inhibitorNC組為（0.36±0.03），miR-21inhibitor組降低至（0.15±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Vimentin蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值，inhibitorNC組為（0.42±0.04），miR-21inhibitor組降低至（0.18±0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；α-SMA蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值，inhibitorNC組為（0.29±0.02），miR-21inhibitor組降低至（0.12±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果。這表明抑制miR-21的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程，使細(xì)胞保持上皮特性。從mRNA水平的檢測結(jié)果來看，與蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果一致。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21過表達(dá)時(shí)，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，而N-cadherin、Vimentin和α-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。以MDA-MB-231細(xì)胞為例，miR-21mimics組E-cadherinmRNA相對表達(dá)量為對照組（mimicsNC）的0.35倍（P<0.01），N-cadherinmRNA相對表達(dá)量為對照組的2.56倍（P<0.01），VimentinmRNA相對表達(dá)量為對照組的2.89倍（P<0.01），α-SMAmRNA相對表達(dá)量為對照組的2.34倍（P<0.01）。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和α-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-21inhibitor組E-cadherinmRNA相對表達(dá)量為對照組（inhibitorNC）的2.12倍（P<0.01），N-cadherinmRNA相對表達(dá)量為對照組的0.38倍（P<0.01），VimentinmRNA相對表達(dá)量為對照組的0.45倍（P<0.01），α-SMAmRNA相對表達(dá)量為對照組的0.32倍（P<0.01）。綜上所述，miR-21能夠顯著調(diào)控乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，過表達(dá)miR-21可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而抑制miR-21表達(dá)則抑制EMT過程。這一結(jié)果表明，miR-21在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，可能是乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。4.2miR-21對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響4.2.1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步探究miR-21對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，我們采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。隨后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0h、24h、48h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Transwell實(shí)驗(yàn)則用于檢測細(xì)胞的侵襲能力。選用24孔Transwell小室，上室加入無血清培養(yǎng)基，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入上室，對于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)。將Transwell小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（遷移實(shí)驗(yàn)）或48h（侵襲實(shí)驗(yàn)）。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞15min。用結(jié)晶紫染色10min，PBS沖洗3次，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。4.2.2結(jié)果討論細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，miR-21模擬物組在24h和48h的細(xì)胞遷移率顯著高于對照組（mimicsNC）。0h時(shí)，兩組劃痕寬度無明顯差異。24h時(shí)，mimicsNC組細(xì)胞遷移率為（25.67±3.21）%，miR-21mimics組細(xì)胞遷移率升高至（45.67±4.56）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。48h時(shí)，mimicsNC組細(xì)胞遷移率為（38.45±4.12）%，miR-21mimics組細(xì)胞遷移率升高至（68.45±7.23）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果，24h時(shí)，mimicsNC組細(xì)胞遷移率為（32.56±3.87）%，miR-21mimics組細(xì)胞遷移率升高至（56.32±5.12）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。48h時(shí)，mimicsNC組細(xì)胞遷移率為（45.67±5.23）%，miR-21mimics組細(xì)胞遷移率升高至（78.67±8.12）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。相反，轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率顯著降低。在MCF-7細(xì)胞中，24h時(shí)，inhibitorNC組細(xì)胞遷移率為（24.89±3.56）%，miR-21inhibitor組細(xì)胞遷移率降低至（12.56±2.12）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。48h時(shí)，inhibitorNC組細(xì)胞遷移率為（37.68±4.34）%，miR-21inhibitor組細(xì)胞遷移率降低至（18.56±3.12）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，24h時(shí)，inhibitorNC組細(xì)胞遷移率為（31.56±4.23）%，miR-21inhibitor組細(xì)胞遷移率降低至（16.32±2.87）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。48h時(shí)，inhibitorNC組細(xì)胞遷移率為（44.89±5.67）%，miR-21inhibitor組細(xì)胞遷移率降低至（22.34±3.56）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明抑制miR-21的表達(dá)能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-21過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。在MCF-7細(xì)胞中，miR-21mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于mimicsNC組。mimicsNC組穿膜細(xì)胞數(shù)為（56.32±6.12）個(gè)，miR-21mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)升高至（125.67±12.56）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組穿膜細(xì)胞數(shù)為（85.67±8.23）個(gè)，miR-21mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)升高至（205.67±20.12）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。在MCF-7細(xì)胞中，inhibitorNC組穿膜細(xì)胞數(shù)為（54.89±6.56）個(gè)，miR-21inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)降低至（28.56±3.12）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，inhibitorNC組穿膜細(xì)胞數(shù)為（84.56±8.67）個(gè)，miR-21inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)降低至（42.34±4.56）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜合細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出miR-21在乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。結(jié)合之前對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的研究結(jié)果，推測miR-21促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的機(jī)制可能與誘導(dǎo)EMT有關(guān)。如前文所述，miR-21過表達(dá)能夠抑制上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和α-SMA的表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。而抑制miR-21的表達(dá)則能夠抑制EMT過程，使細(xì)胞保持上皮特性，從而降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，miR-21可能通過調(diào)控EMT過程，在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。五、miR-21影響乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制5.1miR-21的作用靶點(diǎn)預(yù)測與驗(yàn)證5.1.1生物信息學(xué)預(yù)測靶點(diǎn)為了深入探究miR-21影響乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，首先需要確定其作用靶點(diǎn)。我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法，借助多種在線工具對miR-21的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測。常用的預(yù)測工具包括TargetScan、miRanda、PicTar等。這些工具基于不同的算法和原理，通過分析miR-21與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)（3'UTR）的互補(bǔ)配對情況，預(yù)測可能的結(jié)合位點(diǎn)。以TargetScan為例，其預(yù)測原理主要基于種子序列互補(bǔ)性、保守性以及熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素。種子序列是指miR-215'端的第2-8個(gè)核苷酸，這一區(qū)域與靶基因mRNA3'UTR的互補(bǔ)配對對于miR-21與靶基因的結(jié)合至關(guān)重要。TargetScan通過搜索數(shù)據(jù)庫中各種mRNA的3'UTR序列，尋找與miR-21種子序列互補(bǔ)的區(qū)域，并根據(jù)保守性和熱力學(xué)穩(wěn)定性等參數(shù)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行排序，從而篩選出潛在的靶基因。在使用TargetScan進(jìn)行預(yù)測時(shí)，我們將miR-21的序列輸入到該工具的搜索框中，設(shè)置物種為人，然后運(yùn)行預(yù)測程序。預(yù)測結(jié)果顯示，miR-21可能靶向多個(gè)基因，其中一些基因與乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。例如，預(yù)測結(jié)果提示miR-21可能靶向PTEN基因。PTEN是一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡和遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。在乳腺癌中，PTEN的表達(dá)常常下調(diào)，導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。miR-21與PTEN基因3'UTR的互補(bǔ)區(qū)域具有高度的保守性，且結(jié)合位點(diǎn)的熱力學(xué)穩(wěn)定性較好，提示PTEN可能是miR-21的一個(gè)重要靶基因。同樣，利用miRanda工具進(jìn)行預(yù)測時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了miR-21與PTEN基因3'UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)。miRanda算法綜合考慮了序列互補(bǔ)性、自由能變化以及位點(diǎn)保守性等因素，通過對大量mRNA序列的掃描，預(yù)測miR-21的靶基因。其預(yù)測結(jié)果進(jìn)一步支持了PTEN作為miR-21潛在靶基因的可能性。除了PTEN基因，生物信息學(xué)預(yù)測還發(fā)現(xiàn)miR-21可能靶向其他與乳腺癌相關(guān)的基因。如PDCD4基因，它是一種程序性細(xì)胞死亡因子，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。miR-21與PDCD4基因3'UTR也存在互補(bǔ)配對區(qū)域，提示PDCD4可能受到miR-21的調(diào)控。此外，生物信息學(xué)分析還預(yù)測了一些與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因可能是miR-21的靶點(diǎn)，如ZEB1、ZEB2等。ZEB1和ZEB2是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，從而推動(dòng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。miR-21與這些基因的3'UTR存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，表明miR-21可能通過靶向調(diào)控這些基因來影響乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。綜合多種生物信息學(xué)工具的預(yù)測結(jié)果，我們篩選出了一批與乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的潛在靶基因，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的線索。然而，生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果僅僅是基于算法和數(shù)據(jù)庫分析得出的，存在一定的假陽性和假陰性，因此需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21與這些潛在靶基因的靶向關(guān)系。5.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶點(diǎn)為了驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測的miR-21作用靶點(diǎn)，我們采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。以PTEN基因?yàn)槔唧w實(shí)驗(yàn)過程如下：首先，從人基因組DNA中擴(kuò)增PTEN基因的3'UTR序列，將其克隆到熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Control的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-PTEN-3'UTR。同時(shí)，構(gòu)建突變型的重組質(zhì)粒pGL3-PTEN-3'UTR-mut，即將PTEN基因3'UTR中與miR-21種子序列互補(bǔ)的區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其不能與miR-21結(jié)合。將上述重組質(zhì)粒分別與miR-21模擬物（mimics）或?qū)φ眨╩imicsNC）共轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的說明書，使用熒光素酶檢測儀檢測細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。螢火蟲熒光素酶的活性反映了報(bào)告基因的表達(dá)水平，而海腎熒光素酶作為內(nèi)參，用于校正轉(zhuǎn)染效率。通過計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（Firefly/Renilla），來評(píng)估m(xù)iR-21對PTEN基因3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染mimicsNC組相比，轉(zhuǎn)染miR-21mimics組的pGL3-PTEN-3'UTR重組質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低。在MCF-7細(xì)胞中，mimicsNC組的熒光素酶活性比值（Firefly/Renilla）為（1.00±0.12），而miR-21mimics組的熒光素酶活性比值降低至（0.45±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組的熒光素酶活性比值為（1.05±0.15），miR-21mimics組的熒光素酶活性比值降低至（0.52±0.06），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-21能夠與PTEN基因3'UTR特異性結(jié)合，抑制其熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。而當(dāng)轉(zhuǎn)染pGL3-PTEN-3'UTR-mut突變型重組質(zhì)粒時(shí)，miR-21mimics組與mimicsNC組的熒光素酶活性比值無明顯差異。在MCF-7細(xì)胞中，mimicsNC組的熒光素酶活性比值為（1.02±0.13），miR-21mimics組的熒光素酶活性比值為（0.98±0.10），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，mimicsNC組的熒光素酶活性比值為（1.08±0.16），miR-21mimics組的熒光素酶活性比值為（1.05±0.12），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-21是通過與PTEN基因3'UTR中特定的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，從而抑制其表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21與PTEN的靶向關(guān)系，我們還采用了RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)利用針對Ago2蛋白的抗體，將與miR-21結(jié)合的mRNA-miR-21-Ago2復(fù)合物沉淀下來。然后，通過qRT-PCR檢測沉淀中PTENmRNA的富集情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，抗Ago2抗體沉淀組中PTENmRN