miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的分子機制探究一、引言1.1研究背景子宮內膜癌作為一種常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢，每年有近20萬的新增病例，致死率占女性惡性腫瘤的第三位。在中國，隨著人口老齡化以及生活方式的改變，子宮內膜癌的發(fā)病形勢也不容樂觀。早期子宮內膜癌患者通?？梢赃M行手術治療，術后配合全身化療或者局部放療等治療措施，預后一般較好，死亡率偏低，在10-20%左右。然而，晚期子宮內膜癌患者由于癌細胞的遠處轉移，失去最佳治療時間，5年內的死亡率可達70%以上。因此，深入探究子宮內膜癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和策略，具有極其重要的臨床意義。上皮間質轉化（EMT）在子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中扮演著關鍵角色。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，轉化為具有間質細胞特性的過程。在這一過程中，上皮細胞的極性喪失，細胞間黏附性減弱，運動能力增強，同時細胞表型發(fā)生改變，上皮標志物如E-cadherin表達減少，間質標志物如N-cadherin、vimentin表達增加。EMT使得腫瘤細胞能夠脫離原發(fā)灶，侵入周圍組織并進入血液循環(huán)，從而促進腫瘤的轉移。研究表明，EMT與子宮內膜癌的局部復發(fā)及遠處轉移密切相關，是影響患者預后的主要因素之一。因此，深入研究EMT的調控機制，對于阻斷子宮內膜癌的轉移途徑、改善患者預后具有重要意義。MicroRNAs（miRNAs）作為一類內源性的非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對結合，在轉錄后水平調控基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。miR-200c作為miRNA家族的重要成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用。已有研究表明，miR-200c在多種腫瘤中表達下調，且其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉移能力及患者預后密切相關。在子宮內膜癌中，miR-200c的低表達與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，提示其可能在抑制子宮內膜癌細胞的EMT過程中發(fā)揮關鍵作用。BMI-1基因，即B細胞特異性莫洛尼白血病毒插入位點1基因，是多梳蛋白家族的重要成員。BMI-1基因在多種腫瘤中高表達，通過調控細胞周期、干細胞自我更新和凋亡等過程，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，BMI-1基因在子宮內膜癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的分期、分級及預后相關。進一步研究表明，BMI-1基因可通過調節(jié)相關信號通路，促進子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲。越來越多的證據(jù)表明，miR-200c與BMI-1基因之間存在著密切的調控關系。miR-200c能夠直接靶向BMI-1基因的mRNA，抑制其表達，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。在子宮內膜癌中，miR-200c是否通過靶向BMI-1基因來抑制癌細胞的EMT過程，目前尚不完全清楚。深入研究這一調控機制，不僅有助于揭示子宮內膜癌的發(fā)病機制，還可能為子宮內膜癌的治療提供新的靶點和策略。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的分子機制，具體研究目的如下：明確miR-200c與BMI-1基因在子宮內膜癌中的表達關系：通過檢測miR-200c和BMI-1基因在子宮內膜癌組織及細胞系中的表達水平，分析兩者表達的相關性，為后續(xù)研究提供基礎。驗證miR-200c對BMI-1基因的靶向調控作用：運用雙熒光素酶報告基因實驗、RNA免疫沉淀實驗等技術，驗證miR-200c是否直接靶向BMI-1基因的mRNA，以及這種靶向作用對BMI-1基因表達的影響。探究miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞EMT的影響：通過細胞功能實驗，如Transwell實驗、劃痕實驗等，觀察過表達或抑制miR-200c以及干擾BMI-1基因表達后，子宮內膜癌細胞遷移、侵襲能力的變化；同時檢測EMT相關標志物（如E-cadherin、N-cadherin、vimentin等）的表達變化，明確miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞EMT的調控作用。揭示miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞EMT的分子機制：研究miR-200c靶向BMI-1基因后，對相關信號通路（如PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等）的影響，進一步闡明miR-200c抑制子宮內膜癌細胞EMT的潛在分子機制。本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值：理論意義：本研究有助于深入了解miR-200c和BMI-1基因在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制，豐富對子宮內膜癌分子生物學的認識，為進一步揭示腫瘤轉移的分子機制提供新的理論依據(jù)。同時，通過研究miR-200c與BMI-1基因之間的相互作用及對EMT的調控，拓展了對miRNA與靶基因相互作用網(wǎng)絡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的理解，為腫瘤研究領域提供新的研究思路和方向。臨床應用價值：明確miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞EMT的機制，可能為子宮內膜癌的診斷、治療和預后評估提供新的生物標志物和治療靶點。一方面，miR-200c和BMI-1基因的表達水平可能作為子宮內膜癌早期診斷和預后評估的指標，幫助醫(yī)生更準確地判斷患者的病情和預后，制定個性化的治療方案；另一方面，以miR-200c或BMI-1基因為靶點，開發(fā)新的治療策略，如miRNA模擬物、反義寡核苷酸或小分子抑制劑等，有望為子宮內膜癌患者提供更有效的治療手段，改善患者的預后，提高患者的生活質量。二、相關理論基礎2.1子宮內膜癌概述子宮內膜癌是發(fā)生在子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率僅次于宮頸癌，位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。近年來，隨著人口老齡化加劇以及生活方式的改變，子宮內膜癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（WHO-IARC）發(fā)布的最新全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增子宮內膜癌病例約41.7萬例，死亡病例約9.7萬例。在西方發(fā)達國家，子宮內膜癌的發(fā)病率已躍居婦科惡性腫瘤的首位。根據(jù)腫瘤的生物學行為和發(fā)病機制，子宮內膜癌可分為兩種類型：I型子宮內膜癌，又稱雌激素依賴型，約占80%，多發(fā)生于絕經(jīng)前或圍絕經(jīng)期女性，與長期無孕激素拮抗的雌激素刺激相關，常伴有子宮內膜增生，腫瘤分化較好，預后相對較好；II型子宮內膜癌，又稱非雌激素依賴型，約占20%，多發(fā)生于絕經(jīng)后女性，與雌激素無明顯關系，常無子宮內膜增生，腫瘤分化較差，侵襲性強，預后相對較差。常見的病理類型包括子宮內膜樣腺癌、漿液性癌、透明細胞癌等，其中子宮內膜樣腺癌最為常見，約占75%-80%。子宮內膜癌的主要癥狀包括異常陰道出血，尤其是絕經(jīng)后陰道出血，還可表現(xiàn)為陰道排液、腹痛、腹部包塊等。隨著病情進展，癌細胞可侵犯周圍組織和器官，發(fā)生淋巴結轉移及遠處轉移，嚴重威脅患者的生命健康。對于早期子宮內膜癌患者，手術是主要的治療方法，根據(jù)病情可選擇全子宮切除術、雙側附件切除術等，術后根據(jù)高危因素決定是否進行輔助放療、化療或激素治療；對于晚期或復發(fā)的子宮內膜癌患者，治療則較為復雜，多采用綜合治療，包括手術、放療、化療、靶向治療及激素治療等，但總體預后較差。盡管目前的治療手段在一定程度上提高了患者的生存率，但仍有部分患者會出現(xiàn)復發(fā)和轉移，嚴重影響患者的生活質量和生存預后。因此，深入研究子宮內膜癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于改善患者的預后具有重要意義。2.2上皮間質轉化（EMT）2.2.1EMT的概念與過程上皮間質轉化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，逐漸失去上皮細胞的特性，獲得間質細胞特性的過程。這一概念最早由Greenberg和Hay于1982年提出，它打破了傳統(tǒng)觀念中上皮細胞和間質細胞之間不能相互轉化的認知，揭示了細胞在特定環(huán)境下能夠跨越同源細胞界限進行轉化的現(xiàn)象。在EMT過程中，上皮細胞的形態(tài)發(fā)生顯著改變。上皮細胞通常呈極性排列，細胞間緊密連接，具有典型的鵝卵石樣外觀。然而，在經(jīng)歷EMT時，上皮細胞的極性喪失，細胞間連接變得松散，細胞形態(tài)逐漸從扁平狀轉變?yōu)樗笮位蚣忓N樣，細胞間隙增寬，部分細胞還可從細胞膜伸出偽足，這些形態(tài)變化使得細胞的運動能力明顯增強。與此同時，細胞的分子標志物也發(fā)生明顯變化。上皮細胞的標志性分子，如E-cadherin（上皮鈣黏蛋白）、β-catenin（β-連環(huán)蛋白）等表達顯著減少。E-cadherin是一種鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，其通過與β-catenin和γ-catenin結合，再與α-catenin相連，形成連環(huán)蛋白復合體，進而連接到肌動蛋白細胞骨架上，維持細胞間黏附的穩(wěn)定性。當E-cadherin表達減少時，細胞間的黏附力下降，使得細胞更容易脫離上皮組織，為細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。而間質細胞的標志物，如N-cadherin（神經(jīng)鈣黏蛋白）、vimentin（波形蛋白）等表達則明顯升高。N-cadherin常見于神經(jīng)外胚層和中胚層，它不僅能促使癌組織從原發(fā)部位脫離，還能促進腫瘤細胞與內皮或基質成分黏附，與E-cadherin的作用相反。vimentin是一種中間絲蛋白，廣泛存在于間充質細胞中，在EMT過程中，其異常高表達與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關。這種上皮標志物與間質標志物表達的轉換，被稱為“cadherinswitch”，是EMT過程的重要特征之一。此外，EMT還涉及細胞內信號通路的復雜調控。多種信號通路，如TGF-β（轉化生長因子-β）、Wnt/β-catenin、Notch、EGF（表皮生長因子）、HGF（肝細胞生長因子）等，在EMT過程中相互作用、協(xié)同調節(jié)。其中，TGF-β信號通路是誘導EMT的關鍵通路之一，它可以通過激活下游的Smad蛋白，進而調控一系列EMT相關轉錄因子的表達，如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2等，這些轉錄因子能夠直接結合到E-cadherin基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉錄，從而促進EMT的發(fā)生。Wnt/β-catenin信號通路也在EMT中發(fā)揮重要作用，當該信號通路被激活時，β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，促進細胞的增殖、遷移和EMT過程。2.2.2EMT在子宮內膜癌中的作用EMT在子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中扮演著至關重要的角色，對子宮內膜癌細胞的侵襲、轉移和耐藥性等生物學行為產生深遠影響。促進癌細胞侵襲和轉移：在子宮內膜癌中，EMT賦予癌細胞更強的侵襲和轉移能力。通過EMT過程，癌細胞失去上皮細胞的極性和緊密連接，獲得間質細胞的特性，使其能夠突破基底膜，侵入周圍組織。研究表明，在子宮內膜癌組織中，E-cadherin的低表達與腫瘤的侵襲深度和淋巴結轉移密切相關，而N-cadherin和vimentin的高表達則與腫瘤的轉移能力呈正相關。當子宮內膜癌細胞發(fā)生EMT時，細胞間黏附力減弱，運動能力增強，能夠更容易地穿過細胞外基質，進入血液循環(huán)，并在遠處器官定植，形成轉移灶。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內膜癌的動物模型中，誘導癌細胞發(fā)生EMT后，腫瘤的轉移率顯著增加；而抑制EMT過程，則可以有效減少腫瘤的轉移。增強癌細胞耐藥性：EMT還與子宮內膜癌細胞的耐藥性密切相關。發(fā)生EMT的癌細胞往往對化療藥物和放療產生抵抗，導致治療效果不佳。這是因為EMT過程使癌細胞的生物學特性發(fā)生改變，包括細胞增殖減緩、DNA損傷修復能力增強、藥物外排泵表達增加等，這些變化使得癌細胞能夠逃避化療藥物和放療的殺傷作用。有研究報道，在對子宮內膜癌患者進行化療時，EMT相關標志物高表達的患者對化療藥物的敏感性明顯降低，預后較差。此外，EMT還可以通過激活相關信號通路，上調抗凋亡蛋白的表達，抑制癌細胞的凋亡，進一步增強癌細胞的耐藥性。參與腫瘤干細胞特性維持：腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化能力的細胞亞群，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移中起著關鍵作用。越來越多的研究表明，EMT與腫瘤干細胞特性的維持密切相關。在子宮內膜癌中，發(fā)生EMT的癌細胞可能獲得腫瘤干細胞的特性，表現(xiàn)為表達干細胞標志物如Oct-4、Nanog、Sox2等，具有更強的自我更新和分化能力。這些具有腫瘤干細胞特性的癌細胞能夠抵抗化療和放療，成為腫瘤復發(fā)和轉移的根源。例如，有研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，誘導子宮內膜癌細胞發(fā)生EMT后，細胞中腫瘤干細胞標志物的表達明顯升高，且這些細胞在裸鼠體內形成腫瘤的能力增強。2.3MicroRNA與基因調控2.3.1MicroRNA的基本特性MicroRNA（miRNA）是一類長度約為21-23個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。其結構短小精悍，卻在基因表達調控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。miRNA由基因組DNA轉錄而來，最初轉錄生成的是具有帽子結構和多聚腺苷酸尾巴的初級轉錄本（pri-miRNA）。pri-miRNA在細胞核內被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8識別并切割，形成長度約為70-100個核苷酸的莖環(huán)結構的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA隨后被轉運蛋白Exportin-5轉運至細胞質中，在核酸酶Dicer的作用下，進一步切割成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會與AGO蛋白等結合，形成RNA誘導沉默復合體（RISC），而另一條鏈則被降解。miRNA主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對結合，在轉錄后水平調控基因的表達。當miRNA與靶mRNA完全互補配對時，RISC中的核酸酶會直接切割靶mRNA，導致其降解；當miRNA與靶mRNA不完全互補配對時，則會抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質的合成。這種調控方式具有高度的特異性和靈活性，一個miRNA可以靶向多個不同的mRNA，同時一個mRNA也可能受到多個miRNA的調控，從而形成復雜的基因調控網(wǎng)絡。例如，在細胞增殖過程中，miR-17-92簇可以通過靶向多個與細胞周期調控相關的基因，如E2F1、CDK6等，促進細胞的增殖；而在細胞凋亡過程中，miR-15a和miR-16-1則可以通過靶向抗凋亡基因BCL2，誘導細胞凋亡。此外，miRNA還參與了細胞分化、發(fā)育、代謝、免疫等多種生物學過程，對維持細胞的正常生理功能和內環(huán)境穩(wěn)定起著至關重要的作用。2.3.2miR-200c的研究現(xiàn)狀miR-200c作為miR-200家族的重要成員，近年來在腫瘤研究領域受到了廣泛關注。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，它們具有相似的種子序列，在基因調控中發(fā)揮著協(xié)同作用。miR-200c在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達，其表達水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關。在乳腺癌中，miR-200c的低表達與腫瘤的侵襲性和轉移能力增強相關。研究表明，miR-200c可以通過靶向ZEB1和ZEB2等轉錄因子，抑制乳腺癌細胞的EMT過程，從而降低癌細胞的遷移和侵襲能力。在肺癌中，miR-200c同樣發(fā)揮著重要的抑癌作用。miR-200c能夠靶向調節(jié)E-cadherin的抑制因子，如Snail、Slug等，恢復E-cadherin的表達，抑制肺癌細胞的EMT和轉移。在結直腸癌中，miR-200c的表達下調可導致腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強。通過上調miR-200c的表達，可以抑制結直腸癌細胞的生長和轉移，其機制可能與靶向BMI-1基因、調控PI3K/AKT信號通路等有關。在子宮內膜癌中，miR-200c的表達變化也備受關注。有研究報道，miR-200c在子宮內膜癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，且其表達水平與腫瘤的分期、分級及淋巴結轉移密切相關。miR-200c表達越低，子宮內膜癌的惡性程度越高，患者的預后越差。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在子宮內膜癌的EMT過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用。miR-200c可以通過直接靶向ZEB1、ZEB2等EMT相關轉錄因子，抑制它們的表達，從而維持E-cadherin的表達水平，抑制子宮內膜癌細胞的EMT過程，減少癌細胞的遷移和侵襲能力。此外，miR-200c還可能通過調控其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路等，間接影響子宮內膜癌細胞的EMT和轉移。然而，目前關于miR-200c在子宮內膜癌中作用機制的研究仍存在許多未知之處，尤其是miR-200c與BMI-1基因之間的相互作用及其對子宮內膜癌細胞EMT的影響，還需要進一步深入探究。2.4BMI-1基因簡介BMI-1基因，全稱B細胞特異性莫洛尼白血病毒插入位點1基因（Bcell-specificMoloneymurineleukemiavirusintegrationsite1），位于人類染色體10p13區(qū)域。其編碼的BMI-1蛋白屬于多梳蛋白家族（Polycombgroupproteins，PcG）的重要成員，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、衰老和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著關鍵作用。BMI-1基因的結構較為復雜，包含多個外顯子和內含子。其編碼的蛋白質由326個氨基酸組成，具有多個功能結構域，包括N端的Ringfinger結構域、C端的螺旋-環(huán)-螺旋結構域以及中間的保守區(qū)域。其中，Ringfinger結構域是BMI-1蛋白發(fā)揮其生物學功能的關鍵結構域之一，它能夠與其他蛋白質相互作用，形成蛋白質復合物，參與基因的轉錄調控。例如，BMI-1蛋白可以通過Ringfinger結構域與RING1A、RING1B等蛋白結合，形成PRC1（Polycombrepressivecomplex1）復合物，該復合物能夠通過對組蛋白H2A的泛素化修飾，抑制基因的轉錄。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，BMI-1基因起著重要的促進作用。它主要通過以下幾個方面來影響腫瘤細胞的生物學行為：調控細胞周期：BMI-1基因能夠通過調節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，促進細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，BMI-1可以直接抑制p16INK4a和p14ARF基因的表達，這兩個基因是重要的細胞周期抑制因子。p16INK4a能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和CDK6結合，抑制其活性，從而阻止細胞從G1期進入S期；p14ARF則可以通過與MDM2結合，解除MDM2對p53的抑制作用，激活p53介導的細胞周期阻滯和凋亡信號通路。當BMI-1抑制p16INK4a和p14ARF的表達時，細胞周期抑制信號被解除，細胞得以持續(xù)增殖，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，在乳腺癌細胞中，敲低BMI-1基因的表達后，p16INK4a和p14ARF的表達水平顯著升高，細胞周期被阻滯在G1期，細胞增殖能力明顯下降。維持干細胞自我更新：BMI-1在干細胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮著關鍵作用。在正常干細胞中，BMI-1能夠維持干細胞的自我更新能力，使其能夠不斷產生新的干細胞。同時，BMI-1還可以抑制干細胞的分化，保持干細胞的未分化狀態(tài)。在腫瘤干細胞中，BMI-1同樣起著重要作用。腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化能力的細胞亞群，它們被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移的根源。BMI-1通過維持腫瘤干細胞的自我更新能力，使得腫瘤干細胞能夠不斷增殖，從而促進腫瘤的生長和轉移。有研究表明，在結直腸癌中，BMI-1高表達的腫瘤干細胞具有更強的自我更新能力和致瘤性，而抑制BMI-1的表達則可以顯著降低腫瘤干細胞的數(shù)量和活性，抑制腫瘤的生長和轉移。抑制細胞凋亡：BMI-1基因還能夠通過抑制細胞凋亡來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。它可以通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，抑制細胞凋亡信號通路的激活。例如，BMI-1可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制細胞凋亡。此外，BMI-1還可以通過與其他信號通路相互作用，間接抑制細胞凋亡。在非小細胞肺癌中，BMI-1通過激活PI3K/AKT信號通路，抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的存活和增殖。當抑制BMI-1的表達時，PI3K/AKT信號通路被抑制，細胞凋亡增加，腫瘤細胞的生長受到抑制。在子宮內膜癌中，BMI-1基因的表達水平明顯升高，且與腫瘤的惡性程度、臨床分期、淋巴結轉移及患者預后密切相關。研究表明，BMI-1高表達的子宮內膜癌患者，其腫瘤細胞的增殖能力更強，侵襲和轉移能力也更高，患者的生存率更低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BMI-1可以通過調節(jié)相關信號通路，如Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等，促進子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲。例如，在子宮內膜癌細胞中，BMI-1可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調c-Myc、CyclinD1等靶基因的表達，促進細胞的增殖和EMT過程；同時，BMI-1還可以通過激活PI3K/AKT信號通路，增強細胞的存活和遷移能力。因此，深入研究BMI-1基因在子宮內膜癌中的作用機制，對于尋找有效的治療靶點和改善患者預后具有重要意義。三、miR-200c與BMI-1基因的關系研究3.1生物信息學預測為初步探究miR-200c與BMI-1基因之間是否存在靶向關系，本研究運用生物信息學預測工具進行深入分析。常用的生物信息學預測工具如TargetScan、miRanda和PicTar等，它們通過對miRNA與靶基因mRNA序列的互補配對情況、熱力學穩(wěn)定性以及結合位點的保守性等多方面因素進行綜合評估，從而預測miRNA的潛在靶基因。在本研究中，首先選用TargetScan工具進行預測。將miR-200c的成熟序列輸入TargetScan數(shù)據(jù)庫，設置物種為人類，數(shù)據(jù)庫版本為最新版本，以確保預測結果的準確性和可靠性。TargetScan算法主要基于miRNA種子序列（miRNA5’端第2-8位核苷酸）與靶基因mRNA3’UTR區(qū)域的互補配對情況來預測靶基因。經(jīng)過嚴格的運算和分析，結果顯示BMI-1基因的mRNA3’UTR區(qū)域存在與miR-200c種子序列互補配對的位點，提示BMI-1基因可能是miR-200c的潛在靶基因。為進一步驗證預測結果的可靠性，采用miRanda工具進行平行預測。miRanda算法不僅考慮了miRNA與靶基因mRNA序列的互補性，還對結合位點的自由能變化進行了計算，以評估結合的穩(wěn)定性。同樣將miR-200c的序列輸入miRanda數(shù)據(jù)庫，設定相應的參數(shù)，包括物種為人類，評分閾值為140，自由能閾值為-20kcal/mol等。預測結果表明，miR-200c與BMI-1基因mRNA3’UTR區(qū)域能夠形成穩(wěn)定的互補雙鏈結構，且結合自由能較低，進一步支持了BMI-1基因是miR-200c潛在靶基因的可能性。此外，利用PicTar工具進行補充預測。PicTar算法整合了多個物種間的保守性信息，通過對不同物種中miRNA與靶基因結合位點的保守性分析，提高了預測的準確性。將miR-200c的序列提交至PicTar數(shù)據(jù)庫，選擇人類物種及相關的保守性數(shù)據(jù)集進行分析。結果顯示，在進化過程中，miR-200c與BMI-1基因mRNA3’UTR區(qū)域的結合位點具有較高的保守性，這也為兩者之間存在靶向關系提供了有力的證據(jù)。綜合上述三種生物信息學預測工具的結果，均提示BMI-1基因是miR-200c的潛在靶基因，且在mRNA3’UTR區(qū)域存在與miR-200c互補配對的位點。然而，生物信息學預測結果僅為初步的理論推測，仍需通過實驗進一步驗證miR-200c與BMI-1基因之間是否存在真實的靶向調控關系。三、miR-200c與BMI-1基因的關系研究3.2實驗驗證3.2.1細胞培養(yǎng)與轉染本研究選用人子宮內膜癌細胞系HEC-1-A和Ishikawa進行實驗。將細胞置于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗。為了研究miR-200c對BMI-1基因的調控作用，將miR-200c模擬物（mimics）、miR-200c模擬物陰性對照（mimicsNC）、miR-200c抑制劑（inhibitor）和miR-200c抑制劑陰性對照（inhibitorNC）轉染至子宮內膜癌細胞中。轉染前一天，將細胞以合適的密度接種于6孔板中，使細胞在轉染時達到50%-70%的匯合度。轉染時，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。具體步驟如下：首先，將20pmol的miR-200cmimics、mimicsNC、miR-200cinhibitor或inhibitorNC分別與5μL的Lipofectamine3000試劑在100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育5分鐘，以形成脂質體-miRNA復合物；然后，將上述復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時；最后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗。此外，為了過表達BMI-1基因，構建了BMI-1基因表達載體（pcDNA3.1-BMI-1），并將其轉染至子宮內膜癌細胞中。轉染方法與miRNA轉染類似，將2μg的pcDNA3.1-BMI-1載體與5μL的Lipofectamine3000試劑在100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育5分鐘，形成脂質體-載體復合物，然后加入到含有細胞的6孔板中，培養(yǎng)條件與miRNA轉染相同。轉染48小時后，通過Westernblot檢測BMI-1蛋白的表達水平，以驗證轉染效果。3.2.2雙熒光素酶報告基因實驗雙熒光素酶報告基因實驗是驗證miRNA與靶基因靶向關系的常用方法。其原理是利用熒光素酶基因作為報告基因，將靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域克隆至熒光素酶基因的下游，構建熒光素酶報告載體。當miRNA與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域互補配對結合時，會影響熒光素酶報告載體的表達，從而通過檢測熒光素酶的活性來判斷miRNA與靶基因之間是否存在靶向關系。在本實驗中，首先根據(jù)BMI-1基因mRNA3’UTR區(qū)域與miR-200c的互補配對序列，設計并合成含有野生型（WT）和突變型（MUT）BMI-1基因3’UTR序列的寡核苷酸片段。將這些片段分別克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告載體中，構建野生型（pmirGLO-BMI-1-WT）和突變型（pmirGLO-BMI-1-MUT）熒光素酶報告載體。然后，將上述兩種報告載體分別與miR-200cmimics或mimicsNC共轉染至HEK293T細胞中。轉染前一天，將HEK293T細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中。轉染時，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。將0.5μg的報告載體和20pmol的miR-200cmimics或mimicsNC分別與2μL的Lipofectamine3000試劑在50μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育5分鐘，形成脂質體-核酸復合物。將復合物加入到含有細胞的24孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時。然后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）檢測熒光素酶活性。具體步驟如下：首先，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細胞兩次；然后，向每孔中加入100μL的被動裂解緩沖液（PLB），室溫孵育15分鐘，使細胞充分裂解；接著，將細胞裂解液轉移至96孔白板中，每孔加入10μL的螢火蟲熒光素酶檢測試劑II（LARII），立即在多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶的活性，記錄讀數(shù)為RLU1；隨后，向每孔中加入10μL的Stop&Glo試劑，再次在多功能酶標儀上檢測海腎熒光素酶的活性，記錄讀數(shù)為RLU2。以海腎熒光素酶的活性作為內參，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（RLU1/RLU2），該比值反映了熒光素酶報告載體的表達水平。實驗結果顯示，與mimicsNC組相比，miR-200cmimics組與野生型pmirGLO-BMI-1-WT共轉染后，螢火蟲熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而miR-200cmimics組與突變型pmirGLO-BMI-1-MUT共轉染后，螢火蟲熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。這表明miR-200c能夠與BMI-1基因mRNA的3’UTR區(qū)域互補配對結合，從而抑制熒光素酶報告載體的表達，證實了miR-200c與BMI-1基因之間存在靶向關系。3.2.3Westernblot檢測蛋白表達為進一步驗證miR-200c對BMI-1蛋白表達的調控作用，采用Westernblot方法檢測轉染miR-200cmimics、inhibitor及相應陰性對照后，子宮內膜癌細胞中BMI-1蛋白的表達水平。轉染48小時后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，然后加入適量的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解液轉移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，使各組蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白預染Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上。采用濕轉法進行轉膜，將PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘，使其活化，然后依次將濾紙、凝膠、PVDF膜和濾紙按照順序放入轉膜裝置中，注意避免氣泡產生。在恒流條件下進行轉膜，電流為300mA，轉膜時間根據(jù)蛋白分子量大小而定，一般為1-2小時。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人BMI-1抗體，1:1000稀釋；兔抗人β-actin抗體，1:5000稀釋）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。第二天，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌三次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋）的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進行顯影。將ECL試劑A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應1-2分鐘。然后將PVDF膜放入化學發(fā)光成像儀中，進行曝光和成像。通過分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算BMI-1蛋白的相對表達量。實驗結果表明，與mimicsNC組相比，miR-200cmimics組中BMI-1蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05）；而與inhibitorNC組相比，miR-200cinhibitor組中BMI-1蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05）。這進一步證實了miR-200c能夠負向調控BMI-1蛋白的表達，與雙熒光素酶報告基因實驗的結果一致。四、miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的影響4.1細胞遷移和侵襲實驗4.1.1Transwell實驗Transwell實驗是檢測細胞遷移和侵襲能力的經(jīng)典方法，其原理是利用Transwell小室，將細胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細胞在趨化因子的作用下，通過小室底部的多孔膜，從一個環(huán)境遷移到另一個環(huán)境。在侵襲實驗中，小室底部的多孔膜預先包被基質膠，細胞需要降解基質膠才能穿過膜，從而模擬體內細胞侵襲的過程。在本研究中，選用孔徑為8μm的Transwell小室進行實驗。實驗前，將Matrigel基質膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，然后取50μl稀釋后的Matrigel基質膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質膠凝固，用于侵襲實驗；對于遷移實驗，則無需鋪Matrigel基質膠。將對數(shù)生長期的子宮內膜癌細胞用胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基洗滌兩次后，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為5×10?個/ml。取100μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，作為趨化因子。每組設置3個復孔，以確保實驗結果的準確性和可靠性。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)24小時（根據(jù)細胞遷移和侵襲能力的不同，培養(yǎng)時間可適當調整）。培養(yǎng)結束后，小心取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室內未遷移或侵襲的細胞。然后將小室放入裝有4%多聚甲醛的孔板中，室溫固定20分鐘。固定結束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌小室兩次，每次5分鐘。接著，將小室放入含有0.1%結晶紫染液的孔板中，室溫染色15分鐘。染色完成后，用PBS洗滌小室多次，直至背景顏色清晰。將小室晾干后，在顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。實驗結果顯示，與對照組（轉染mimicsNC或inhibitorNC的細胞）相比，miR-200cmimics組的子宮內膜癌細胞遷移和侵襲能力明顯降低，穿過膜的細胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）；而miR-200cinhibitor組的細胞遷移和侵襲能力則明顯增強，穿過膜的細胞數(shù)量顯著增加（P<0.05）。這表明過表達miR-200c能夠抑制子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲能力，而抑制miR-200c的表達則會促進細胞的遷移和侵襲。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當干擾BMI-1基因的表達后，miR-200cinhibitor組細胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制，與miR-200cinhibitor+si-NC組相比，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組穿過膜的細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。這提示miR-200c可能通過靶向BMI-1基因來調控子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲能力。4.1.2劃痕實驗劃痕實驗是一種簡單直觀的評估細胞遷移能力的方法，其原理是在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，即劃痕，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域，使劃痕愈合，通過觀察和測量不同時間點劃痕的寬度變化，來評估細胞的遷移能力。在本實驗中，將子宮內膜癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞長滿至融合狀態(tài)（約80%-90%匯合度）時，進行劃痕實驗。首先，用10μl槍頭垂直于孔板底面，在細胞層上均勻地劃兩條直線，形成劃痕。為確保劃痕的一致性和準確性，可在孔板底面預先用直尺和馬克筆標記劃痕位置。劃痕完成后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細胞兩次，以去除劃下的細胞和碎片。然后，加入含不同處理的培養(yǎng)基，包括對照組（mimicsNC或inhibitorNC）、miR-200cmimics組、miR-200cinhibitor組、miR-200cinhibitor+si-NC組和miR-200cinhibitor+si-BMI-1組，每組設置3個復孔。在劃痕后0小時、24小時和48小時，分別用倒置顯微鏡在相同視野下拍照記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件對照片進行分析，測量劃痕在不同時間點的寬度，并計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結果表明，隨著時間的推移，對照組細胞的劃痕逐漸愈合，細胞遷移率逐漸增加。與對照組相比，miR-200cmimics組在24小時和48小時的劃痕寬度明顯大于對照組，細胞遷移率顯著降低（P<0.05），表明過表達miR-200c抑制了子宮內膜癌細胞的遷移能力。相反，miR-200cinhibitor組在24小時和48小時的劃痕寬度明顯小于對照組，細胞遷移率顯著增加（P<0.05），說明抑制miR-200c的表達促進了細胞的遷移。當干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組在24小時和48小時的劃痕寬度明顯大于miR-200cinhibitor+si-NC組，細胞遷移率顯著降低（P<0.05）。這進一步證實了miR-200c通過靶向BMI-1基因來抑制子宮內膜癌細胞的遷移能力。4.2EMT相關標志物檢測4.2.1上皮標志物E-cadherinE-cadherin作為上皮細胞的標志性分子，在維持上皮細胞的極性和細胞間黏附穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關鍵作用。在本研究中，為了探究miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞EMT過程中E-cadherin表達的影響，采用了免疫熒光和Westernblot兩種方法進行檢測。免疫熒光實驗步驟如下：將轉染后的子宮內膜癌細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁生長至適當密度后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，以固定細胞形態(tài)。然后用0.1%TritonX-100通透10分鐘，使抗體能夠進入細胞內與抗原結合。用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的通透劑。接著用5%BSA封閉30分鐘，以減少非特異性結合。將兔抗人E-cadherin抗體（1:200稀釋）滴加在蓋玻片上，4℃孵育過夜，使抗體與E-cadherin抗原充分結合。第二天，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，去除未結合的一抗。將AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋）滴加在蓋玻片上，室溫避光孵育1小時，使二抗與一抗結合。再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，然后用DAPI染核5分鐘，以標記細胞核。最后，用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。免疫熒光結果顯示，對照組細胞中E-cadherin主要分布在細胞膜上，呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光，表明E-cadherin表達正常。而在miR-200cinhibitor組中，E-cadherin的綠色熒光強度明顯減弱，且分布不均勻，提示E-cadherin表達下調。相反，在miR-200cmimics組中，E-cadherin的綠色熒光強度顯著增強，細胞膜上的表達更加清晰，表明E-cadherin表達上調。當干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組中E-cadherin的表達較miR-200cinhibitor+si-NC組明顯恢復，綠色熒光強度增強，細胞膜上的分布更加均勻。同時，采用Westernblot方法對E-cadherin蛋白表達進行定量分析。具體步驟與前文檢測BMI-1蛋白表達的Westernblot步驟相似。結果顯示，與對照組相比，miR-200cinhibitor組中E-cadherin蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05）；而miR-200cmimics組中E-cadherin蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05）。干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組中E-cadherin蛋白的相對表達量較miR-200cinhibitor+si-NC組顯著升高（P<0.05）。綜合免疫熒光和Westernblot的結果，表明miR-200c可以通過靶向BMI-1基因，上調子宮內膜癌細胞中E-cadherin的表達，從而抑制細胞的EMT過程。4.2.2間質標志物Vimentin和N-cadherinVimentin和N-cadherin是間質細胞的重要標志物，在腫瘤細胞的EMT過程中，它們的表達水平通常會顯著升高。為了深入探究miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞EMT過程中Vimentin和N-cadherin表達的影響，本研究采用了免疫熒光和Westernblot技術進行檢測。免疫熒光實驗檢測Vimentin和N-cadherin的步驟與檢測E-cadherin基本相同，僅需將一抗分別替換為兔抗人Vimentin抗體（1:200稀釋）和兔抗人N-cadherin抗體（1:200稀釋）。免疫熒光結果顯示，對照組細胞中Vimentin和N-cadherin的表達相對較低。在miR-200cinhibitor組中，Vimentin和N-cadherin呈現(xiàn)出強烈的紅色熒光（以AlexaFluor594標記的二抗為例），表明這兩種間質標志物的表達顯著上調。而在miR-200cmimics組中，Vimentin和N-cadherin的紅色熒光強度明顯減弱，提示其表達下調。當干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組中Vimentin和N-cadherin的熒光強度較miR-200cinhibitor+si-NC組明顯降低。采用Westernblot方法對Vimentin和N-cadherin蛋白表達進行定量分析。結果顯示，與對照組相比，miR-200cinhibitor組中Vimentin和N-cadherin蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05）；而miR-200cmimics組中Vimentin和N-cadherin蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05）。干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組中Vimentin和N-cadherin蛋白的相對表達量較miR-200cinhibitor+si-NC組顯著降低（P<0.05）。上述結果表明，miR-200c可以通過靶向BMI-1基因，下調子宮內膜癌細胞中Vimentin和N-cadherin的表達，進而抑制細胞的EMT過程。結合上皮標志物E-cadherin的檢測結果，進一步證實了miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞EMT具有顯著的抑制作用。4.3動物實驗驗證4.3.1動物模型建立為進一步驗證miR-200c靶向BMI-1基因對子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的影響，本研究構建了子宮內膜癌動物模型。選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，在SPF級動物房適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。實驗前，將對數(shù)生長期的人子宮內膜癌細胞系HEC-1-A用胰酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/mL。在無菌條件下，將100μL細胞懸液注射到裸鼠的右側腋下皮下。每組接種10只裸鼠，以確保實驗結果的可靠性和統(tǒng)計學意義。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等，每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤體積（V）按照公式V=0.5×長×寬2進行計算。當腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為四組，分別為對照組、miR-200cmimics組、miR-200cinhibitor組和miR-200cinhibitor+si-BMI-1組，每組5只。對照組裸鼠瘤內注射100μL的PBS；miR-200cmimics組瘤內注射100μL含有100nmol/LmiR-200cmimics的脂質體復合物；miR-200cinhibitor組瘤內注射100μL含有100nmol/LmiR-200cinhibitor的脂質體復合物；miR-200cinhibitor+si-BMI-1組瘤內注射100μL含有100nmol/LmiR-200cinhibitor和100nmol/Lsi-BMI-1的脂質體復合物。注射頻率為每3天一次，共注射5次。4.3.2體內實驗觀察指標腫瘤生長情況：在注射后的第3天、第6天、第9天、第12天和第15天，分別測量各組裸鼠腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。結果顯示，與對照組相比，miR-200cmimics組的腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積顯著減?。≒<0.05）；而miR-200cinhibitor組的腫瘤生長則明顯加快，腫瘤體積顯著增大（P<0.05）。當干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組的腫瘤生長速度明顯減緩，腫瘤體積較miR-200cinhibitor組顯著減?。≒<0.05）。這表明過表達miR-200c能夠抑制子宮內膜癌腫瘤的生長，而抑制miR-200c的表達則會促進腫瘤生長，且miR-200c可通過靶向BMI-1基因來調控腫瘤的生長。腫瘤轉移情況：在實驗結束時，將裸鼠處死，解剖取出腫瘤、肺、肝、脾等組織，進行大體觀察和病理檢查。通過蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學變化以及是否有轉移灶形成。結果發(fā)現(xiàn)，對照組和miR-200cinhibitor組的裸鼠肺部和肝臟出現(xiàn)了較多的轉移灶，而miR-200cmimics組的轉移灶明顯減少。miR-200cinhibitor+si-BMI-1組的轉移灶數(shù)量較miR-200cinhibitor組顯著降低。這進一步證實了miR-200c可以抑制子宮內膜癌細胞的轉移，且這種抑制作用與靶向BMI-1基因有關。相關標志物表達檢測：采用免疫組化法檢測腫瘤組織中E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和BMI-1蛋白的表達水平。具體步驟如下：將腫瘤組織制成石蠟切片，脫蠟至水后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，冷卻后用5%BSA封閉30分鐘。分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:200稀釋）、兔抗人Vimentin抗體（1:200稀釋）、兔抗人N-cadherin抗體（1:200稀釋）和兔抗人BMI-1抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。第二天，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:500稀釋），室溫孵育1小時。再次用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，通過分析陽性染色的強度和面積，評估蛋白的表達水平。免疫組化結果顯示，與對照組相比，miR-200cmimics組腫瘤組織中E-cadherin的表達明顯升高，Vimentin和N-cadherin的表達明顯降低，BMI-1的表達也顯著降低；而miR-200cinhibitor組則相反，E-cadherin表達降低，Vimentin和N-cadherin表達升高，BMI-1表達升高。當干擾BMI-1基因表達后，miR-200cinhibitor+si-BMI-1組中E-cadherin的表達較miR-200cinhibitor組明顯恢復，Vimentin和N-cadherin的表達顯著降低，BMI-1的表達也明顯降低。這與細胞實驗的結果一致，表明miR-200c可以通過靶向BMI-1基因，調節(jié)腫瘤組織中EMT相關標志物的表達，從而抑制子宮內膜癌細胞的上皮間質轉化和腫瘤的轉移。五、miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的機制探討5.1磷酸-AKT（Phospho-AKT）信號通路的作用5.1.1信號通路簡介磷酸-AKT（Phospho-AKT，p-AKT）信號通路，也被稱為PI3K/AKT信號通路，是細胞內一條至關重要的信號傳導網(wǎng)絡，在細胞的多種生理和病理過程中發(fā)揮著核心調控作用。該信號通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt，也稱為PKB）以及下游的多種效應分子組成。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，由調節(jié)亞基（如p85）和催化亞基（如p110）構成異二聚體結構。當細胞受到多種胞外信號刺激，如生長因子（如表皮生長因子EGF、胰島素樣生長因子IGF-1等）、細胞因子等與細胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）結合后，PI3K被激活。激活后的PI3K能夠催化細胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化，生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3在細胞膜上大量聚集，作為一種重要的信號分子，招募含有PH結構域的Akt蛋白從細胞質轉移到細胞膜上。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于AGC激酶家族成員，包含PH結構域、催化結構域和調節(jié)結構域。當Akt被招募到細胞膜上后，其Thr308位點首先被磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK1）磷酸化，隨后Ser473位點被mTORC2或其他PI3K相關激酶（如DNA-PK）磷酸化，經(jīng)過這兩步磷酸化修飾，Akt被完全激活，從而獲得激酶活性。激活后的Akt可以磷酸化多種下游靶蛋白，進而調控細胞的多種生物學過程。在細胞增殖方面，Akt通過磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β），使β-catenin在胞漿內大量聚集，進入細胞核并激活與細胞分裂和生長調控相關的基因（如c-Myc、CyclinD1等），促進細胞周期進程，推動細胞從G1期進入S期，從而促進細胞增殖。在細胞存活與凋亡調控方面，Akt磷酸化Bcl-2相關的細胞死亡激動劑（BAD），使其與14-3-3蛋白結合，從而抑制BAD誘導的細胞凋亡；同時，Akt還可以通過磷酸化并激活NF-κB信號通路，促進抗凋亡基因的表達，抑制細胞凋亡，增強細胞的存活能力。在細胞遷移和侵襲過程中，Akt通過調節(jié)細胞骨架重排、細胞外基質降解和血管生成等過程，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。例如，Akt可以磷酸化p21活化激酶1（PAK1），激活的PAK1調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重組，增強細胞的遷移能力；Akt還可以促進血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，為腫瘤細胞的轉移提供營養(yǎng)和氧氣支持。此外，Akt信號通路還參與細胞代謝、自噬、免疫調節(jié)等多種生物學過程，對維持細胞的正常生理功能和內環(huán)境穩(wěn)定起著至關重要的作用。5.1.2miR-200c和BMI-1基因對磷酸-AKT信號通路的影響為深入探究miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的潛在機制，本研究進一步分析了miR-200c和BMI-1基因對磷酸-AKT信號通路的影響。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測轉染miR-200cmimics、miR-200cinhibitor及相應陰性對照后，子宮內膜癌細胞中磷酸化Akt（p-Akt）、總Akt以及下游靶蛋白（如GSK3β、β-catenin、c-Myc、CyclinD1等）的表達水平。實驗結果顯示，與對照組（轉染mimicsNC或inhibitorNC的細胞）相比，miR-200cmimics組中p-Akt的表達水平顯著降低，總Akt的表達水平無明顯變化。這表明過表達miR-200c能夠抑制Akt的磷酸化激活，從而抑制磷酸-AKT信號通路的活性。同時，miR-200cmimics組中GSK3β的磷酸化水平升高，導致其活性受到抑制，進而使得β-catenin在胞漿內的聚集減少，進入細胞核的β-catenin也相應減少，最終導致下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達水平顯著降低。這一系列結果說明，miR-200c通過抑制磷酸-AKT信號通路，阻礙了細胞的增殖和EMT相關基因的表達。相反，在miR-200cinhibitor組中，p-Akt的表達水平顯著升高，GSK3β的磷酸化水平降低，β-catenin在胞漿內大量聚集并進入細胞核，c-Myc和CyclinD1的表達水平顯著升高。這表明抑制miR-200c的表達能夠激活磷酸-AKT信號通路，促進細胞的增殖和EMT相關基因的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當干擾BMI-1基因的表達后，miR-200cinhibitor組中p-Akt的表達水平顯著降低，GSK3β、β-catenin、c-Myc和CyclinD1等下游靶蛋白的表達水平也相應降低。這提示miR-200c可能通過靶向BMI-1基因，間接調控磷酸-AKT信號通路的活性。為了驗證這一推測，構建了BMI-1基因過表達載體，并將其轉染至miR-200cmimics組細胞中。結果顯示，過表達BMI-1基因能夠部分逆轉miR-200c對磷酸-AKT信號通路的抑制作用，p-Akt及其下游靶蛋白的表達水平有所回升。綜上所述，miR-200c可以通過靶向BMI-1基因，抑制磷酸-AKT信號通路的激活，從而下調GSK3β、β-catenin、c-Myc和CyclinD1等下游靶蛋白的表達，最終抑制子宮內膜癌細胞的增殖和上皮間質轉化過程。這一發(fā)現(xiàn)揭示了miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞EMT的重要分子機制，為子宮內膜癌的治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。5.2其他相關信號通路及分子機制除了磷酸-AKT信號通路外，還有其他多條信號通路及分子機制可能參與了miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宮內膜癌細胞EMT的過程，這些通路和分子之間相互作用、協(xié)同調控，共同構成了一個復雜而精細的調控網(wǎng)絡。5.2.1Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用，與EMT的調控密切相關。在正常情況下，細胞內的β-catenin與APC（adenomatouspolyposiscoli）、Axin、GSK3β等蛋白形成復合物，在GSK3β的作用下，β-catenin被磷酸化，隨后被泛素化蛋白酶體降解，從而維持細胞內β-catenin的低水平。當Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合，激活下游的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白抑制GSK3β的活性，使得β-catenin不能被磷酸化和降解，從而在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1、MMPs等，這些基因參與細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT過程。研究表明，BMI-1基因可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進子宮內膜癌細胞的EMT和轉移。BMI-1可能通過與Wnt信號通路中的關鍵分子相互作用，如直接與β-catenin結合，增強β-catenin的穩(wěn)定性和核轉位，從而激活下游靶基因的表達。而miR-200c可能通過靶向BMI-1基因，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，進而抑制子宮內膜癌細胞的EMT。有研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌中，miR-200c通過下調BMI-1的表達，抑制了Wnt/β-catenin信號通路的活性，減少了β-catenin在細胞核內的積累，降低了下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達，從而抑制了腫瘤細胞的增殖和遷移。在子宮內膜癌中，也有類似的報道，miR-200c過表達能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低β-catenin、c-Myc和CyclinD1的表達，進而抑制癌細胞的EMT和轉移。為了驗證miR-200c是否通過靶向BMI-1基因調控Wnt/β-catenin信號通路，可進行相關實驗。通過轉染miR-200cmimics或inhibitor以及BMI-1siRNA，檢測細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子（如β-catenin、c-Myc、CyclinD1等）的表達水平。若miR-200cmimics能夠抑制BMI-1的表達，同時降低β-catenin、c-Myc和CyclinD1的表達，而miR-200cinhibitor則產生相反的結果，且干擾BMI-1基因表達后能模擬miR-200cmimics的作用，進一步證實miR-200c通過靶向BMI-1基因抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制子宮內膜癌細胞的EMT。5.2.2TGF-β信號通路TGF-β信號通路是誘導EMT的關鍵信號通路之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多種細胞因子，它們通過與細胞膜上的TGF-β受體（TβRⅠ和TβRⅡ）結合，激活下游的Smad蛋白信號通路。TβRⅡ具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，當TGF-β與TβRⅡ結合后，TβRⅡ磷酸化并激活TβRⅠ。激活的TβRⅠ進一步磷酸化下游的Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2/3與Smad4結合形成復合物，進入細胞核內與其他轉錄因子相互作用，調控EMT相關基因的表達。TGF-β信號通路通過激活一系列EMT相關轉錄因子，如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2等，抑制上皮標志物E-cadherin的表達，上調間質標志物N-cadherin、vimentin等的表達，從而促進EMT的發(fā)生。研究表明，BMI-1基因可能與TGF-β信號通路存在相互作用，共同調控子宮內膜癌細胞的EMT。BMI-1可能通過調節(jié)TGF-β信號通路中關鍵分子的表達或活性，影響TGF-β信號的傳導。例如，BMI-1可能促進TGF-β受體的表達，增強細胞對TGF-β的敏感性，從而激活TGF-β信號通路，促進EMT。miR-200c可能通過靶向BMI-1基因，間接抑制TGF-β信號通路，從而抑制子宮內膜癌細胞的EMT。有研究報道，在乳腺癌中，miR-200c通過下調BMI-1的表達，抑制了TGF-β誘導的EMT過程。miR-200c過