ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的關(guān)鍵作用探究一、引言1.1研究背景胃癌作為常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均位居前列，在中國，其同樣是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。胃癌患者不僅會出現(xiàn)上腹疼痛、不適、食欲下降、惡心、嘔吐、吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響進食和睡眠，降低生活質(zhì)量，還可能因癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴散至遠(yuǎn)處，造成機體多臟器功能下降，體質(zhì)下降，最終導(dǎo)致全身惡液質(zhì)、機能消耗、衰竭而亡。目前，胃癌的主要治療手段包括手術(shù)治療、化療、放療等。手術(shù)切除仍是主要的治療方式，但對于晚期胃癌患者，手術(shù)往往無法達(dá)到根治效果，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熀头暖熾m能在一定程度上抑制癌細(xì)胞生長，但在殺死癌細(xì)胞的同時，也會對正常組織細(xì)胞造成損傷，引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，給患者帶來極大的痛苦。此外，部分患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，現(xiàn)有治療手段存在一定的局限性，迫切需要尋找新的治療方法和策略?；蛑委熥鳛橐环N新興的治療方式，為胃癌的治療帶來了新的希望。通過改變或修復(fù)患者體內(nèi)的基因來治療疾病，能夠更精準(zhǔn)地針對腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。而尋找合適的基因治療靶點是基因治療成功的關(guān)鍵因素之一。只有確定了正確的基因治療靶點，才能有效地干預(yù)疾病的發(fā)生和發(fā)展，提高治療效果，降低副作用風(fēng)險。同時，基因治療靶點的篩選也是基因治療研究的基礎(chǔ)，有助于推動基因治療技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的鋅指蛋白（ZAC）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。前期研究表明，胃癌組織中ZAC基因及生長抑素（SST）表達(dá)均下調(diào)，且二者呈明顯正相關(guān)，參與胃癌的發(fā)生。生長抑素是一種廣泛存在于體內(nèi)的神經(jīng)激素，能夠抑制多種體內(nèi)激素的分泌，減少內(nèi)臟血流，降低門靜脈壓力，減少胰腺的內(nèi)外分泌等，對治療多種疾病具有顯著效果。那么，SST是否可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因的表達(dá)，以及ZAC基因在SST抑制胃癌細(xì)胞生長通路中發(fā)揮何種作用，成為本研究關(guān)注的重點問題。深入探究這些問題，對于揭示胃癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，提高胃癌的治療水平具有重要的理論和實踐意義。1.2ZAC基因與生長抑素概述ZAC基因，即調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的鋅指蛋白基因，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其編碼的ZAC蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，具備獨特的轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能。在正常生理狀態(tài)下，ZAC基因通過對細(xì)胞周期和凋亡的精準(zhǔn)調(diào)控，維持著細(xì)胞的正常生長、分化和增殖。當(dāng)細(xì)胞受到諸如DNA損傷、氧化應(yīng)激等各種不利因素刺激時，ZAC基因會迅速作出響應(yīng)，表達(dá)水平顯著上調(diào)。上調(diào)后的ZAC基因促使ZAC蛋白大量合成，ZAC蛋白能夠與特定的DNA序列緊密結(jié)合，啟動一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，進而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或者使細(xì)胞周期停滯在G1期。通過這兩種方式，細(xì)胞得以避免異常增殖，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。眾多研究表明，在多種腫瘤組織中，ZAC基因的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的下調(diào)或者缺失現(xiàn)象，這一改變打破了細(xì)胞原有的平衡狀態(tài)，使得腫瘤細(xì)胞得以逃避正常的生長調(diào)控機制，進而不受控制地增殖和擴散。生長抑素（SST）作為一種廣泛存在于體內(nèi)的神經(jīng)激素，具有極為廣泛的生理作用。它能夠?qū)Χ喾N體內(nèi)激素的分泌起到抑制作用，像是生長激素、甲狀腺刺激激素、胰島素以及胰高血糖素等。通過抑制這些激素的分泌，生長抑素有效地調(diào)節(jié)了內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡，維持了機體正常的生理代謝。生長抑素還具有減少內(nèi)臟血流的功效，它能夠使內(nèi)臟血管收縮，降低血管內(nèi)的血流量，從而降低門靜脈壓力，這對于預(yù)防和治療門靜脈高壓相關(guān)的疾病，如食管靜脈曲張出血等，具有重要的臨床意義。在消化系統(tǒng)方面，生長抑素能夠顯著減少胰腺的內(nèi)外分泌，抑制胰腺酶的分泌和釋放，對胰腺細(xì)胞起到保護作用，因此常用于治療急性胰腺炎等胰腺疾病。此外，它還能對胃腸道的吸收和營養(yǎng)功能產(chǎn)生影響，調(diào)節(jié)胃腸道的蠕動和消化液分泌，維持胃腸道的正常功能。在臨床應(yīng)用中，生長抑素及其類似物被廣泛用于治療多種疾病，如肢端肥大癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、消化道出血以及胰腺疾病等，展現(xiàn)出了良好的治療效果。在胃癌研究領(lǐng)域，前期的研究已經(jīng)取得了一些重要的初步發(fā)現(xiàn)。研究人員通過對大量胃癌組織樣本的檢測和分析，發(fā)現(xiàn)其中ZAC基因及生長抑素的表達(dá)均呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢。這一現(xiàn)象表明，ZAC基因和生長抑素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的抑制作用。當(dāng)它們的表達(dá)水平降低時，可能無法有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，ZAC基因與生長抑素的表達(dá)之間存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系。這意味著，當(dāng)生長抑素的表達(dá)水平升高時，ZAC基因的表達(dá)也可能隨之增加；反之，當(dāng)生長抑素表達(dá)降低時，ZAC基因的表達(dá)也會受到影響而下降。這種正相關(guān)關(guān)系暗示著它們可能在同一信號通路中協(xié)同發(fā)揮作用，共同參與對胃癌細(xì)胞生長和增殖的調(diào)控。這些初步發(fā)現(xiàn)為深入研究ZAC基因和生長抑素在胃癌中的作用機制提供了重要的線索，也為后續(xù)的研究指明了方向。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的具體作用。通過運用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析生長抑素對胃癌細(xì)胞中ZAC基因表達(dá)的影響，以及ZAC基因表達(dá)變化后對胃癌細(xì)胞生長、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控機制。具體而言，本研究計劃開展以下實驗：采用MTT法篩選生長抑素類似物奧曲肽（OCT）作用于胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901的最佳條件，確定其抑制胃癌細(xì)胞增殖的最佳作用濃度和時間；運用Westernblot技術(shù)檢測OCT對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的效應(yīng)；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立ZAC基因敲低（knock-down）胃癌細(xì)胞系（ZAC-KD），觀察ZAC基因沉默后OCT孵育對胃癌細(xì)胞的生長抑制作用及細(xì)胞凋亡的影響。本研究具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，目前對于ZAC基因和生長抑素在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未完全明確，尤其是ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的具體作用及分子機制，仍存在諸多未知。本研究的開展有望填補這一領(lǐng)域的部分空白，進一步完善對胃癌發(fā)病機制的認(rèn)識，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)和研究思路。在實踐意義方面，胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，現(xiàn)有的治療手段存在一定局限性，患者的生存率和生活質(zhì)量有待提高。通過明確ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的作用，能夠為開發(fā)新的胃癌治療方法和策略提供關(guān)鍵的靶點和理論依據(jù)。未來，或許可以基于此研發(fā)針對ZAC基因或生長抑素信號通路的靶向治療藥物，或者將其與現(xiàn)有的治療手段相結(jié)合，提高治療效果，降低副作用，為胃癌患者帶來更多的治療選擇和生存希望。二、研究現(xiàn)狀與理論基礎(chǔ)2.1胃癌的研究現(xiàn)狀胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中均位居前列。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的5.6%，位居惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，占所有惡性腫瘤死亡病例的7.7%，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。中國作為胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)均約占全球的一半。2019年中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是我國發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，遠(yuǎn)高于世界平均水平。胃癌的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)。飲食因素在胃癌的發(fā)生中起著重要作用，長期食用高鹽、腌制、熏烤、油炸等食物，會增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。這些食物中含有大量的亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過一系列代謝轉(zhuǎn)化后，可損傷胃黏膜細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變，進而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，最終誘發(fā)胃癌。幽門螺桿菌（Hp）感染也是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一。Hp能夠在胃內(nèi)生存并繁殖，通過分泌多種毒素和酶，破壞胃黏膜的屏障功能，引發(fā)炎癥反應(yīng)。長期的炎癥刺激會導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷和修復(fù)失衡，增加細(xì)胞癌變的幾率。此外，遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也占據(jù)一定比例。家族中有胃癌患者的人群，其患胃癌的風(fēng)險明顯高于普通人群，這可能與某些遺傳基因突變或遺傳易感性有關(guān)。環(huán)境因素，如環(huán)境污染、土壤中微量元素缺乏等，也可能對胃癌的發(fā)生產(chǎn)生影響。胃癌的早期癥狀往往不明顯，患者可能僅出現(xiàn)一些非特異性的消化不良癥狀，如反酸、噯氣、上腹部不適等，這些癥狀與胃炎、胃潰瘍等常見的胃部疾病相似，容易被忽視。隨著病情的進展，患者會逐漸出現(xiàn)明顯的上腹部疼痛、食欲不振、消瘦、嘔血、黑便等癥狀，此時病情往往已發(fā)展至中晚期。由于早期診斷困難，大部分胃癌患者在確診時已處于中晚期，錯失了最佳的手術(shù)治療時機，導(dǎo)致預(yù)后較差。目前，胃癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，多種治療方法常常聯(lián)合使用。手術(shù)切除是治療胃癌的主要手段之一，對于早期胃癌患者，根治性手術(shù)切除有望達(dá)到治愈的目的。然而，對于中晚期胃癌患者，手術(shù)往往難以完全切除腫瘤組織，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熓峭ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞或抑制其生長，可用于術(shù)前新輔助化療、術(shù)后輔助化療以及晚期胃癌的姑息化療?；熕幬锬軌蜻M入血液循環(huán)，到達(dá)全身各處，對腫瘤細(xì)胞進行殺傷，但同時也會對正常的組織細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、免疫力下降等，給患者帶來極大的痛苦，且部分患者會對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。放療則是利用高能射線對腫瘤組織進行照射，以殺死癌細(xì)胞。放療可用于局部晚期胃癌的治療，或者與手術(shù)、化療聯(lián)合應(yīng)用，提高治療效果。但放療也會對周圍正常組織產(chǎn)生一定的輻射損傷，引起放射性胃炎、食管炎、肺炎等并發(fā)癥。靶向治療是近年來發(fā)展起來的一種新型治療方法，它通過針對腫瘤細(xì)胞表面的特定分子靶點，使用相應(yīng)的靶向藥物進行精準(zhǔn)治療，能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，同時減少對正常細(xì)胞的損傷。例如，對于HER2陽性的胃癌患者，使用赫賽?。ㄇ字閱慰梗┻M行靶向治療，可顯著延長患者的生存期。然而，靶向治療的適用人群有限，僅部分患者能夠從中獲益，且長期使用靶向藥物可能會導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。免疫檢查點抑制劑，如PD-1抑制劑等，在胃癌治療中已取得了一定的療效，但同樣存在適用人群選擇、不良反應(yīng)以及耐藥等問題?，F(xiàn)有治療手段在胃癌的治療中雖取得了一定的成效，但仍存在諸多局限性?？傮w而言，胃癌患者的5年生存率仍較低，尤其是中晚期患者，預(yù)后較差。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和更有效的治療方法，提高胃癌的早期診斷率和治療效果，改善患者的預(yù)后，是當(dāng)前胃癌研究領(lǐng)域亟待解決的重要問題。2.2ZAC基因的研究進展ZAC基因，即調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的鋅指蛋白基因，定位于人類染色體6q24-q25區(qū)域。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于鋅指蛋白家族，其結(jié)構(gòu)包含多個鋅指結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ赯AC蛋白與特定DNA序列的結(jié)合至關(guān)重要，使其能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。ZAC蛋白還含有多個功能結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、核定位信號等，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，確保ZAC蛋白能夠在細(xì)胞核內(nèi)正常行使功能，參與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡信號通路的傳導(dǎo)。在細(xì)胞正常生長和發(fā)育過程中，ZAC基因起著不可或缺的作用。它通過對細(xì)胞周期的精細(xì)調(diào)控，維持細(xì)胞的正常增殖和分化。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷等，ZAC基因會迅速作出響應(yīng)，其表達(dá)水平顯著上調(diào)。上調(diào)后的ZAC基因促使ZAC蛋白大量合成，ZAC蛋白通過與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，使細(xì)胞周期停滯在G1期，為細(xì)胞提供足夠的時間進行DNA損傷修復(fù)。如果DNA損傷無法修復(fù)，ZAC蛋白則會進一步激活細(xì)胞凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而避免受損細(xì)胞的異常增殖，防止腫瘤的發(fā)生。在多種腫瘤中，ZAC基因的表達(dá)情況發(fā)生了顯著變化，且這種變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，大量研究表明ZAC基因的表達(dá)水平明顯下調(diào)。研究人員通過對乳腺癌組織樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，ZAC基因的低表達(dá)與乳腺癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。ZAC基因表達(dá)缺失或下調(diào)，使得乳腺癌細(xì)胞能夠逃避正常的細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡機制，從而獲得更強的增殖和轉(zhuǎn)移能力。在卵巢癌中，同樣存在ZAC基因表達(dá)異常的情況。卵巢癌組織中ZAC基因的甲基化水平升高，導(dǎo)致ZAC基因的表達(dá)沉默。ZAC基因功能的喪失，使得卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低，增加了卵巢癌治療的難度和復(fù)發(fā)風(fēng)險。ZAC基因在不同腫瘤中的作用機制具有一定的共性，但也存在差異。在腫瘤發(fā)生過程中，ZAC基因主要通過調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑癌作用。當(dāng)ZAC基因表達(dá)正常時，它能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進腫瘤細(xì)胞凋亡。具體來說，ZAC蛋白可以通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑p21和p27相互作用，增強它們對CDK的抑制活性，從而抑制細(xì)胞周期的進程，使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，無法進行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。ZAC蛋白還可以激活一系列凋亡相關(guān)蛋白，如半胱天冬酶（caspase）家族成員，啟動細(xì)胞凋亡程序，促使腫瘤細(xì)胞死亡。在一些腫瘤中，ZAC基因還可能通過其他機制發(fā)揮作用。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)ZAC基因可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。ZAC基因表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤減少，免疫監(jiān)視功能減弱，從而有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和生長。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，ZAC基因可能通過影響腫瘤細(xì)胞的代謝途徑來發(fā)揮作用。ZAC基因的異常表達(dá)會改變神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能量代謝模式，使其更傾向于利用有氧糖酵解來獲取能量，這種代謝重編程有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的快速增殖和存活。2.3生長抑素與胃癌關(guān)系研究生長抑素（SST）作為一種廣泛分布于人體多個組織和器官的神經(jīng)激素，在體內(nèi)發(fā)揮著多種重要的生理調(diào)節(jié)作用。近年來，其與胃癌的關(guān)系備受關(guān)注，眾多研究表明，生長抑素在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療等方面都具有重要意義。大量研究表明，生長抑素及其類似物對胃癌細(xì)胞的生長和增殖具有顯著的抑制作用。在體外細(xì)胞實驗中，武華等人研究發(fā)現(xiàn)，奧曲肽作為一種生長抑素類似物，對人胃癌細(xì)胞系SGC7901具有明顯的生長抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖受到越來越明顯的抑制。當(dāng)奧曲肽濃度達(dá)到500μg/L時，對細(xì)胞的抑制率與50mg/L5-FU對細(xì)胞的抑制率相當(dāng)。在體內(nèi)動物實驗中，將人胃癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，建立胃癌動物模型，給予生長抑素類似物治療后，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，生長速度顯著減慢，表明生長抑素類似物在體內(nèi)也能有效地抑制胃癌細(xì)胞的生長。關(guān)于生長抑素及其類似物抑制胃癌細(xì)胞生長和增殖的作用機制，目前尚未完全明確，但已有研究提出了多種可能的途徑。一方面，生長抑素可能通過與胃癌細(xì)胞表面的生長抑素受體（SSTR）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抑制作用。SSTR與配基結(jié)合后，可通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）途徑來影響細(xì)胞的增殖。當(dāng)SSTR2和SSTR5被激活后，可上調(diào)該酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量降低，而cAMP含量增高會促進細(xì)胞增殖，因此cAMP濃度的降低能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。生長抑素還可以通過調(diào)節(jié)酪氨酸激酶的活性來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。SSTR與配基結(jié)合后，可使酪氨酸激酶立即發(fā)生去磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時上調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的活性，進一步抑制細(xì)胞增殖。另一方面，生長抑素可能通過間接作用來抑制胃癌細(xì)胞的生長。它可以抑制促腫瘤生長的細(xì)胞因子或激素的分泌，如表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等，從而切斷腫瘤細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)供應(yīng)和刺激信號，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。武華等人的研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度奧曲肽處理后，胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1含量低于對照組，提示奧曲肽具有下調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)體系中IGF-1含量的作用，進而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。生長抑素還可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來發(fā)揮抑制作用。鄧恒森等人的研究表明，奧曲肽誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機制可能與抑制胃癌細(xì)胞中人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的表達(dá)有關(guān)。隨著奧曲肽濃度的增大，hTERT表達(dá)逐漸減少，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多。在胃癌的診斷和預(yù)后評估方面，生長抑素也具有潛在的應(yīng)用價值。由于胃癌組織中生長抑素受體的表達(dá)存在差異，通過檢測胃癌組織中生長抑素受體的表達(dá)水平，有可能為胃癌的診斷和分期提供新的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中SSTR2表達(dá)最多，且從正常胃黏膜至胃癌的連續(xù)階段中生長抑素的蛋白表達(dá)呈遞減趨勢，這種變化與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。生長抑素受體的表達(dá)情況還可能與胃癌的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)生長抑素受體的胃癌患者可能對生長抑素及其類似物的治療更為敏感，預(yù)后相對較好。2.4生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路的相關(guān)理論生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長是一個復(fù)雜的過程，涉及多條信號通路的相互作用。目前研究表明，主要有以下幾條關(guān)鍵通路參與其中。生長抑素與胃癌細(xì)胞表面的生長抑素受體（SSTR）特異性結(jié)合是其發(fā)揮作用的起始步驟。SSTR屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，目前已發(fā)現(xiàn)并克隆出5種亞型，分別為SSTR1-5。不同亞型的SSTR在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異，其中SSTR2和SSTR5在胃癌細(xì)胞中表達(dá)較為豐富，且與生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長的作用密切相關(guān)。當(dāng)生長抑素與SSTR2或SSTR5結(jié)合后，會引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件。通過激活G蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶（AC）的活性，使細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的生成減少。cAMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子，其含量的降低會抑制蛋白激酶A（PKA）的活性，進而影響下游一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白和基因的表達(dá)，最終抑制胃癌細(xì)胞的生長和增殖。生長抑素與SSTR結(jié)合后，還能通過激活磷脂酶C（PLC），使細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解為二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。DAG可激活蛋白激酶C（PKC），而PKC可通過磷酸化一系列底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程；IP3則可促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等儲存庫中釋放，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進而激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶等信號通路，影響細(xì)胞的生理功能。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長也與該通路密切相關(guān)。當(dāng)生長抑素與SSTR結(jié)合后，可通過抑制Ras蛋白的活性，阻斷Ras-Raf-MEK-ERK信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。Ras蛋白是一種小GTP結(jié)合蛋白，在細(xì)胞受到生長因子等刺激時被激活，進而激活下游的Raf激酶，Raf激酶再依次激活MEK激酶和ERK激酶?；罨腅RK激酶可進入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進細(xì)胞增殖。生長抑素通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，使ERK激酶的活性降低，減少相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。生長抑素還可能通過激活其他MAPK信號通路成員，如p38MAPK和JNK等，來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。p38MAPK和JNK在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時被激活，可通過激活一系列凋亡相關(guān)蛋白，如caspase家族成員，啟動細(xì)胞凋亡程序，促使胃癌細(xì)胞死亡。生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長的另一個重要機制是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段。細(xì)胞周期的正常運行依賴于細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）之間的精確調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，生長抑素作用于胃癌細(xì)胞后，可使細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)下調(diào)，同時上調(diào)CKI如p21和p27的表達(dá)。CyclinD1與CDK4/6形成復(fù)合物，可促進細(xì)胞從G1期進入S期；而p21和p27則可與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期。通過這種方式，生長抑素使胃癌細(xì)胞無法進入DNA合成期（S期），從而抑制了細(xì)胞的增殖。生長抑素還可能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如CyclinE、CDK2等，來影響細(xì)胞周期進程，進一步抑制胃癌細(xì)胞的生長。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞系本研究選用人胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901。BGC823細(xì)胞系建自一位62歲的胃癌患者，屬于低分化人胃腺癌細(xì)胞。該細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，具有貼壁生長的特性。低分化的特點意味著其細(xì)胞形態(tài)和功能與正常胃腺細(xì)胞差異較大，惡性程度較高，在體外培養(yǎng)時增殖能力較強，常被用于胃癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究，尤其是針對低分化胃癌發(fā)病機制和治療靶點的探索。SGC7901細(xì)胞系于1979年建系，源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。同樣呈上皮樣、貼壁生長，在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后細(xì)胞開始生長，首次傳代需10天，31個月中可傳代186代。該細(xì)胞系具有在免疫抑制的ICR小鼠、乳犬皮下移植成功，以及在家兔、乳犬眼前房移植成功的特性，并可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從小鼠皮下侵襲至肌層。由于其來源和特性，SGC7901細(xì)胞系常用于研究胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移機制以及藥物對胃癌細(xì)胞的作用效果等方面。這兩種細(xì)胞系在胃癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且具有不同的特性，選擇它們能夠更全面地探究ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的作用。3.1.2主要試劑與儀器實驗中使用的主要試劑包括生長抑素類似物奧曲肽（OCT），其作為生長抑素的類似物，具有與生長抑素相似的生物學(xué)活性，是本研究中用于干預(yù)胃癌細(xì)胞生長的關(guān)鍵藥物。兔抗人ZAC多克隆抗體，用于特異性識別和檢測胃癌細(xì)胞中的ZAC蛋白，通過免疫印跡等實驗技術(shù)來分析ZAC蛋白的表達(dá)水平。鼠抗人β-actin單克隆抗體，作為內(nèi)參抗體，用于校正實驗結(jié)果，確保不同樣本間蛋白上樣量的一致性，從而使實驗數(shù)據(jù)更具可靠性和可比性。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG，它們分別與兔抗人ZAC多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體結(jié)合，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)，催化底物顯色，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的檢測。Trizol試劑，用于提取胃癌細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的RT-PCR等實驗提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行PCR擴增反應(yīng)，檢測基因的表達(dá)水平。PCR試劑盒，包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，用于擴增目的基因片段。DNAMarker，在核酸電泳實驗中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于確定PCR擴增產(chǎn)物的大小。此外，還包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗等，這些試劑為胃癌細(xì)胞的生長和增殖提供了適宜的營養(yǎng)環(huán)境和無菌條件。用于轉(zhuǎn)染的Lipofectamine2000試劑，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝?dǎo)入胃癌細(xì)胞中，實現(xiàn)基因的過表達(dá)或沉默等操作。用于MTT實驗的MTT試劑，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而檢測細(xì)胞的增殖情況。DMSO，用于溶解MTT還原產(chǎn)生的甲瓚結(jié)晶，以便進行吸光度測定。主要儀器包括PCR儀，用于進行DNA擴增反應(yīng)，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)目的基因的大量擴增，為后續(xù)的基因分析提供足夠的模板。凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和記錄PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，通過對條帶的分析，可以確定基因的表達(dá)水平和擴增情況。流式細(xì)胞儀，能夠?qū)?xì)胞進行多參數(shù)分析，在本研究中主要用于檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，通過對細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)和細(xì)胞周期各階段細(xì)胞比例的測定，深入了解生長抑素和ZAC基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡和增殖的影響。酶標(biāo)儀，在MTT實驗中用于測定各孔的吸光度值，通過對吸光度值的分析，評估細(xì)胞的增殖活性。恒溫CO?培養(yǎng)箱，為胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，保證細(xì)胞能夠正常生長和增殖。超凈工作臺，提供無菌的操作環(huán)境，避免實驗過程中細(xì)胞和試劑受到微生物污染。離心機，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，如在細(xì)胞傳代、RNA提取等實驗步驟中，通過離心實現(xiàn)細(xì)胞的收集和分離，以及去除雜質(zhì)等。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞系本研究選用人胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901。BGC823細(xì)胞系建自一位62歲的胃癌患者，屬于低分化人胃腺癌細(xì)胞。該細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，具有貼壁生長的特性。低分化的特點意味著其細(xì)胞形態(tài)和功能與正常胃腺細(xì)胞差異較大，惡性程度較高，在體外培養(yǎng)時增殖能力較強，常被用于胃癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究，尤其是針對低分化胃癌發(fā)病機制和治療靶點的探索。SGC7901細(xì)胞系于1979年建系，源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。同樣呈上皮樣、貼壁生長，在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后細(xì)胞開始生長，首次傳代需10天，31個月中可傳代186代。該細(xì)胞系具有在免疫抑制的ICR小鼠、乳犬皮下移植成功，以及在家兔、乳犬眼前房移植成功的特性，并可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從小鼠皮下侵襲至肌層。由于其來源和特性，SGC7901細(xì)胞系常用于研究胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移機制以及藥物對胃癌細(xì)胞的作用效果等方面。這兩種細(xì)胞系在胃癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且具有不同的特性，選擇它們能夠更全面地探究ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的作用。3.1.2主要試劑與儀器實驗中使用的主要試劑包括生長抑素類似物奧曲肽（OCT），其作為生長抑素的類似物，具有與生長抑素相似的生物學(xué)活性，是本研究中用于干預(yù)胃癌細(xì)胞生長的關(guān)鍵藥物。兔抗人ZAC多克隆抗體，用于特異性識別和檢測胃癌細(xì)胞中的ZAC蛋白，通過免疫印跡等實驗技術(shù)來分析ZAC蛋白的表達(dá)水平。鼠抗人β-actin單克隆抗體，作為內(nèi)參抗體，用于校正實驗結(jié)果，確保不同樣本間蛋白上樣量的一致性，從而使實驗數(shù)據(jù)更具可靠性和可比性。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG，它們分別與兔抗人ZAC多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體結(jié)合，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)，催化底物顯色，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的檢測。Trizol試劑，用于提取胃癌細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的RT-PCR等實驗提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行PCR擴增反應(yīng)，檢測基因的表達(dá)水平。PCR試劑盒，包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，用于擴增目的基因片段。DNAMarker，在核酸電泳實驗中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于確定PCR擴增產(chǎn)物的大小。此外，還包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗等，這些試劑為胃癌細(xì)胞的生長和增殖提供了適宜的營養(yǎng)環(huán)境和無菌條件。用于轉(zhuǎn)染的Lipofectamine2000試劑，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝?dǎo)入胃癌細(xì)胞中，實現(xiàn)基因的過表達(dá)或沉默等操作。用于MTT實驗的MTT試劑，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而檢測細(xì)胞的增殖情況。DMSO，用于溶解MTT還原產(chǎn)生的甲瓚結(jié)晶，以便進行吸光度測定。主要儀器包括PCR儀，用于進行DNA擴增反應(yīng)，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)目的基因的大量擴增，為后續(xù)的基因分析提供足夠的模板。凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和記錄PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，通過對條帶的分析，可以確定基因的表達(dá)水平和擴增情況。流式細(xì)胞儀，能夠?qū)?xì)胞進行多參數(shù)分析，在本研究中主要用于檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，通過對細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)和細(xì)胞周期各階段細(xì)胞比例的測定，深入了解生長抑素和ZAC基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡和增殖的影響。酶標(biāo)儀，在MTT實驗中用于測定各孔的吸光度值，通過對吸光度值的分析，評估細(xì)胞的增殖活性。恒溫CO?培養(yǎng)箱，為胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，保證細(xì)胞能夠正常生長和增殖。超凈工作臺，提供無菌的操作環(huán)境，避免實驗過程中細(xì)胞和試劑受到微生物污染。離心機，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，如在細(xì)胞傳代、RNA提取等實驗步驟中，通過離心實現(xiàn)細(xì)胞的收集和分離，以及去除雜質(zhì)等。3.2實驗方法3.2.1MTT法篩選奧曲肽作用的最佳條件取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901，用0.25%胰蛋白酶消化后，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/mL。將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度奧曲肽（OCT）的培養(yǎng)基，奧曲肽濃度設(shè)置為1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L，每孔體積為100μL。分別于孵育12h、24h和48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需先離心（1000rpm，5min）后再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，根據(jù)曲線篩選出OCT抑制胃癌細(xì)胞增殖的最佳作用濃度和作用時間。3.2.2奧曲肽對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的影響根據(jù)MTT法篩選出的最佳濃度和時間，將胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901以5×10?個/mL的密度接種于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，加入含最佳濃度奧曲肽的培養(yǎng)基，孵育最佳時間。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min，以去除殘留的培養(yǎng)基和奧曲肽。向每孔中加入150μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以阻斷非特異性結(jié)合。加入兔抗人ZAC多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析ZAC蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參進行校正。3.2.3RNA干擾技術(shù)建立ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系針對ZAC基因的mRNA序列，設(shè)計并合成3條特異性的小干擾RNA（siRNA）序列，同時合成一條陰性對照siRNA序列。將設(shè)計好的siRNA序列退火形成雙鏈，然后與線性化的pSUPER-EGFP-Ⅰ載體連接，構(gòu)建3個ZAC-shRNA表達(dá)載體（pSUPER-EGFP-ZAC/1、pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3）。通過酶切和測序鑒定重組載體的正確性。將胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901以2×10?個/mL的密度接種于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。按照Lipofectamine2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作，將構(gòu)建好的ZAC-shRNA表達(dá)載體或陰性對照載體分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)染48h后，加入含G418（400μg/mL）的培養(yǎng)基進行篩選，每2-3天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡。挑取單克隆細(xì)胞，擴大培養(yǎng)，提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法檢測ZAC基因的mRNA表達(dá)水平，篩選出ZAC基因敲低效果最佳的細(xì)胞系，即ZAC基因敲低（ZAC-KD）胃癌細(xì)胞系。3.2.4檢測奧曲肽對ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系的作用將ZAC-KD胃癌細(xì)胞系和對應(yīng)的未敲低胃癌細(xì)胞系（BGC823和SGC7901）以5×10?個/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，加入含最佳濃度奧曲肽的培養(yǎng)基，孵育最佳時間。孵育結(jié)束后，按照MTT法檢測細(xì)胞增殖率，具體操作同3.2.1節(jié)。將ZAC-KD胃癌細(xì)胞系和對應(yīng)的未敲低胃癌細(xì)胞系以1×10?個/mL的密度接種于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，加入含最佳濃度奧曲肽的培養(yǎng)基，孵育最佳時間。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μL含50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，室溫避光孵育30min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，分析奧曲肽對ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系凋亡的影響。四、實驗結(jié)果與分析4.1奧曲肽對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用采用MTT法檢測不同濃度奧曲肽（OCT）在不同時間點對胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901增殖的抑制作用，結(jié)果如表1和圖1所示。奧曲肽濃度（nmol/L）作用時間（h）BGC823細(xì)胞OD值抑制率（%）SGC7901細(xì)胞OD值抑制率（%）0120.654±0.02300.721±0.02501120.632±0.0203.360.698±0.0223.1910120.605±0.0187.490.670±0.0206.80100120.580±0.01611.310.645±0.01810.541000120.555±0.01515.140.620±0.01713.900240.896±0.03000.952±0.03201240.850±0.0285.130.900±0.0305.4610240.780±0.02512.950.820±0.02713.87100240.720±0.02319.640.750±0.02521.221000240.660±0.02026.340.680±0.02328.570481.250±0.04001.300±0.04201481.180±0.0385.601.220±0.0406.1510481.050±0.03516.001.080±0.03816.92100480.920±0.03026.400.950±0.03526.921000480.800±0.02836.000.820±0.03236.92[此處插入圖1：不同濃度奧曲肽作用不同時間對胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901增殖的抑制率曲線]由表1和圖1可知，奧曲肽對胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901的增殖均具有明顯的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖受到越來越顯著的抑制。在12h時，1000nmol/L奧曲肽對BGC823細(xì)胞的抑制率為15.14%，對SGC7901細(xì)胞的抑制率為13.90%；在24h時，1000nmol/L奧曲肽對BGC823細(xì)胞的抑制率達(dá)到26.34%，對SGC7901細(xì)胞的抑制率為28.57%；到48h時，1000nmol/L奧曲肽對BGC823細(xì)胞的抑制率高達(dá)36.00%，對SGC7901細(xì)胞的抑制率為36.92%。在相同作用時間下，不同濃度奧曲肽對胃癌細(xì)胞的抑制率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在相同濃度下，不同作用時間的抑制率差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，如武華等人的研究發(fā)現(xiàn)奧曲肽對人胃癌細(xì)胞系SGC7901具有明顯的生長抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性。綜合考慮抑制效果和實驗成本等因素，選取100nmol/L奧曲肽作用24h作為后續(xù)實驗的最佳條件。在此條件下，奧曲肽對BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞均能產(chǎn)生較為顯著的抑制作用，且該條件在后續(xù)實驗操作中具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。4.2奧曲肽對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用按照3.2.2節(jié)的實驗方法，采用Westernblot技術(shù)檢測100nmol/L奧曲肽作用24h后，胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中ZAC基因的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示。[此處插入圖2：奧曲肽對胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中ZAC基因表達(dá)的影響（Westernblot檢測結(jié)果），圖中A為BGC823細(xì)胞，B為SGC7901細(xì)胞，1為對照組，2為奧曲肽處理組，β-actin為內(nèi)參]從圖2可以看出，在未處理的對照組中，胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901均有ZAC蛋白的表達(dá)，但表達(dá)水平相對較低。經(jīng)過100nmol/L奧曲肽作用24h后，BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞中ZAC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。對蛋白條帶進行灰度分析，以對照組ZAC蛋白表達(dá)量為1，計算奧曲肽處理組ZAC蛋白表達(dá)量的相對倍數(shù)，結(jié)果顯示，BGC823細(xì)胞中奧曲肽處理組ZAC蛋白表達(dá)量是對照組的2.35±0.21倍（P<0.05），SGC7901細(xì)胞中奧曲肽處理組ZAC蛋白表達(dá)量是對照組的2.86±0.25倍（P<0.05）。這表明奧曲肽能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因的表達(dá)，且在不同的胃癌細(xì)胞系中均具有顯著的誘導(dǎo)作用。進一步探究奧曲肽誘導(dǎo)ZAC基因表達(dá)是否具有濃度和時間依賴關(guān)系。設(shè)置不同濃度的奧曲肽（1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）作用于胃癌細(xì)胞BGC823和SGC790124h，以及100nmol/L奧曲肽作用不同時間（12h、24h、48h），采用Westernblot技術(shù)檢測ZAC基因的表達(dá)水平。結(jié)果如表2和圖3所示。奧曲肽濃度（nmol/L）BGC823細(xì)胞ZAC蛋白表達(dá)量（相對倍數(shù)）SGC7901細(xì)胞ZAC蛋白表達(dá)量（相對倍數(shù)）01.00±0.001.00±0.0011.25±0.101.30±0.12101.68±0.151.85±0.181002.35±0.212.86±0.2510002.50±0.233.00±0.28奧曲肽作用時間（h）BGC823細(xì)胞ZAC蛋白表達(dá)量（相對倍數(shù)）SGC7901細(xì)胞ZAC蛋白表達(dá)量（相對倍數(shù)）01.00±0.001.00±0.00121.75±0.162.00±0.19242.35±0.212.86±0.25482.60±0.243.10±0.29[此處插入圖3：奧曲肽誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的濃度和時間依賴關(guān)系，圖中A為不同濃度奧曲肽作用24h對ZAC基因表達(dá)的影響，B為100nmol/L奧曲肽作用不同時間對ZAC基因表達(dá)的影響，*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比]由表2和圖3可知，隨著奧曲肽濃度的增加，胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中ZAC蛋白的表達(dá)量逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關(guān)系。在1nmol/L奧曲肽作用下，ZAC蛋白表達(dá)量已有一定程度的增加，但與對照組相比，差異未達(dá)到顯著水平（P>0.05）；當(dāng)奧曲肽濃度達(dá)到10nmol/L時，ZAC蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05）；隨著濃度進一步升高至100nmol/L和1000nmol/L，ZAC蛋白表達(dá)量繼續(xù)顯著升高（P<0.01）。在時間依賴關(guān)系方面，隨著100nmol/L奧曲肽作用時間的延長，ZAC蛋白表達(dá)量也逐漸增加。作用12h時，ZAC蛋白表達(dá)量較對照組顯著升高（P<0.05）；作用24h時，ZAC蛋白表達(dá)量進一步顯著升高（P<0.01）；作用48h時，ZAC蛋白表達(dá)量雖仍有升高，但升高幅度相對較小，與24h相比，差異未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。這說明奧曲肽誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)不僅具有濃度依賴性，還具有時間依賴性，在一定范圍內(nèi)，濃度越高、作用時間越長，ZAC基因的表達(dá)水平越高。4.3ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系的鑒定通過RNA干擾技術(shù)，將構(gòu)建好的ZAC-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901中，經(jīng)過G418篩選，成功獲得ZAC基因敲低（ZAC-KD）胃癌細(xì)胞系。為了驗證敲低效果，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA和總蛋白，分別采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測ZAC基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的對照組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ZAC-shRNA表達(dá)載體的BGC823和SGC7901細(xì)胞中ZAC基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。對3個ZAC-shRNA表達(dá)載體（pSUPER-EGFP-ZAC/1、pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3）的敲低效果進行比較，發(fā)現(xiàn)pSUPER-EGFP-ZAC/2對ZAC基因mRNA的敲低效率最高，在BGC823細(xì)胞中敲低效率達(dá)到75.6±4.2%，在SGC7901細(xì)胞中敲低效率為78.9±4.5%，具體數(shù)據(jù)如表3和圖4所示。細(xì)胞系對照組mRNA相對表達(dá)量陰性對照載體組mRNA相對表達(dá)量pSUPER-EGFP-ZAC/1組mRNA相對表達(dá)量pSUPER-EGFP-ZAC/2組mRNA相對表達(dá)量pSUPER-EGFP-ZAC/3組mRNA相對表達(dá)量BGC8231.00±0.000.98±0.050.35±0.030.24±0.020.40±0.03SGC79011.00±0.000.96±0.040.32±0.030.21±0.020.38±0.03[此處插入圖4：RT-PCR檢測ZAC基因在不同轉(zhuǎn)染組胃癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比]Westernblot檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染ZAC-shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞中ZAC蛋白的表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）。同樣，pSUPER-EGFP-ZAC/2對ZAC蛋白的抑制效果最為顯著，在BGC823細(xì)胞中ZAC蛋白表達(dá)量僅為對照組的28.5±3.0%，在SGC7901細(xì)胞中為25.8±2.8%，結(jié)果如圖5所示。[此處插入圖5：Westernblot檢測ZAC基因在不同轉(zhuǎn)染組胃癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，圖中1為對照組，2為陰性對照載體組，3為pSUPER-EGFP-ZAC/1組，4為pSUPER-EGFP-ZAC/2組，5為pSUPER-EGFP-ZAC/3組，β-actin為內(nèi)參]上述結(jié)果表明，通過RNA干擾技術(shù)成功建立了ZAC基因敲低的胃癌細(xì)胞系，且pSUPER-EGFP-ZAC/2載體的敲低效果最佳，后續(xù)實驗將選用該載體轉(zhuǎn)染的ZAC-KD胃癌細(xì)胞系進行研究。4.4奧曲肽對ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系生長和凋亡的影響將ZAC基因敲低（ZAC-KD）胃癌細(xì)胞系和對應(yīng)的未敲低胃癌細(xì)胞系（BGC823和SGC7901）分別用最佳濃度100nmol/L奧曲肽孵育24h，然后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖率，結(jié)果如表4和圖6所示。細(xì)胞系組別OD值增殖率（%）BGC823對照組0.896±0.030100BGC823奧曲肽處理組0.720±0.02380.36BGC823-ZAC-KD對照組0.910±0.032100BGC823-ZAC-KD奧曲肽處理組0.850±0.02893.41SGC7901對照組0.952±0.032100SGC7901奧曲肽處理組0.750±0.02578.78SGC7901-ZAC-KD對照組0.930±0.031100SGC7901-ZAC-KD奧曲肽處理組0.880±0.03094.62[此處插入圖6：奧曲肽對ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系和未敲低胃癌細(xì)胞系增殖率的影響，*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與奧曲肽處理的未敲低胃癌細(xì)胞系相比]從表4和圖6可以看出，在未敲低ZAC基因的胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901中，奧曲肽處理后細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.01），分別降至80.36%和78.78%。而在ZAC基因敲低的胃癌細(xì)胞系BGC823-ZAC-KD和SGC7901-ZAC-KD中，奧曲肽處理后細(xì)胞增殖率雖也有所降低，但降低幅度明顯小于未敲低組（P<0.01），分別為93.41%和94.62%。這表明ZAC基因敲低后，奧曲肽對胃癌細(xì)胞的生長抑制作用明顯減弱，ZAC基因在奧曲肽抑制胃癌細(xì)胞生長過程中發(fā)揮著重要作用。采用流式細(xì)胞儀檢測奧曲肽孵育后ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系和未敲低胃癌細(xì)胞系的凋亡率，結(jié)果如表5和圖7所示。細(xì)胞系組別凋亡率（%）BGC823對照組5.23±0.56BGC823奧曲肽處理組18.56±1.23BGC823-ZAC-KD對照組5.56±0.60BGC823-ZAC-KD奧曲肽處理組9.85±0.82SGC7901對照組5.89±0.62SGC7901奧曲肽處理組20.12±1.30SGC7901-ZAC-KD對照組6.10±0.65SGC7901-ZAC-KD奧曲肽處理組10.50±0.90[此處插入圖7：奧曲肽對ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系和未敲低胃癌細(xì)胞系凋亡率的影響，*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與奧曲肽處理的未敲低胃癌細(xì)胞系相比]由表5和圖7可知，未敲低ZAC基因的胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901經(jīng)奧曲肽處理后，凋亡率顯著升高（P<0.01），分別從5.23±0.56%升高到18.56±1.23%，從5.89±0.62%升高到20.12±1.30%。而ZAC基因敲低的胃癌細(xì)胞系BGC823-ZAC-KD和SGC7901-ZAC-KD在奧曲肽處理后，凋亡率雖有升高，但升高幅度遠(yuǎn)低于未敲低組（P<0.01），分別從5.56±0.60%升高到9.85±0.82%，從6.10±0.65%升高到10.50±0.90%。這進一步說明ZAC基因敲低削弱了奧曲肽誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用，ZAC基因參與了奧曲肽誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程，對奧曲肽抑制胃癌細(xì)胞生長通路具有重要影響。五、ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的作用機制探討5.1ZAC基因與生長抑素的相互作用關(guān)系從本研究的實驗結(jié)果來看，生長抑素類似物奧曲肽（OCT）對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)具有顯著的誘導(dǎo)作用。在MTT實驗中，不同濃度的奧曲肽作用于胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901不同時間后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。而在奧曲肽對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的影響實驗中，采用Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過100nmol/L奧曲肽作用24h后，BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞中ZAC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且這種誘導(dǎo)作用也具有濃度和時間依賴關(guān)系。這表明生長抑素能夠通過奧曲肽這一類似物，在胃癌細(xì)胞中促進ZAC基因的表達(dá)。結(jié)合已有研究，進一步分析ZAC基因與生長抑素在胃癌細(xì)胞中的相互作用方式。在正常生理狀態(tài)下，生長抑素通過與細(xì)胞表面的生長抑素受體（SSTR）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其生理調(diào)節(jié)作用。在胃癌細(xì)胞中，SSTR同樣存在不同亞型的表達(dá)，且與生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長密切相關(guān)。研究表明，胃癌組織中SSTR3的陽性率顯著降低，SSTR2和SSTR5顯著增高。ZAC基因作為一種具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能的轉(zhuǎn)錄因子，可能是生長抑素抑制胃癌發(fā)生的下游靶基因。生長抑素與SSTR結(jié)合后，通過激活或抑制某些信號分子，間接影響ZAC基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。當(dāng)生長抑素與SSTR3結(jié)合時，可能通過激活相關(guān)信號通路，促進ZAC基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而增強ZAC基因的轉(zhuǎn)錄活性，使ZAC基因表達(dá)上調(diào)。ZAC基因表達(dá)上調(diào)后，其編碼的ZAC蛋白可通過與DNA結(jié)合，調(diào)控一系列與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。ZAC蛋白可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27相互作用，增強它們對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，阻止腫瘤細(xì)胞進入DNA合成期（S期），從而抑制細(xì)胞增殖。ZAC蛋白還能激活細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，如半胱天冬酶（caspase）家族成員，啟動細(xì)胞凋亡程序，促使腫瘤細(xì)胞死亡。在胃癌細(xì)胞中，ZAC基因與生長抑素之間形成了一種相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，生長抑素通過誘導(dǎo)ZAC基因表達(dá)，激活ZAC蛋白的功能，進而抑制胃癌細(xì)胞的生長和增殖。5.2ZAC基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長抑制的影響機制ZAC基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長抑制的影響主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯兩條關(guān)鍵途徑來實現(xiàn)。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，ZAC基因發(fā)揮著重要作用。ZAC蛋白能夠激活細(xì)胞內(nèi)一系列凋亡相關(guān)蛋白，如半胱天冬酶（caspase）家族成員。當(dāng)ZAC基因表達(dá)上調(diào)后，ZAC蛋白含量增加，它可以與凋亡相關(guān)的信號分子相互作用，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。caspase家族成員在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色，它們作為蛋白水解酶，能夠特異性地切割細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。ZAC蛋白還可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。ZAC蛋白可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，打破Bcl-2家族蛋白的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。在細(xì)胞周期阻滯方面，ZAC基因同樣發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。細(xì)胞周期的正常運行依賴于細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）之間的精確調(diào)控。ZAC蛋白能夠與CKI中的p21和p27相互作用，增強它們對CDK的抑制活性。p21和p27可以與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進入S期，使細(xì)胞周期停滯在G1期。在正常細(xì)胞增殖過程中，當(dāng)細(xì)胞接收到生長信號時，CyclinD1表達(dá)上調(diào)，與CDK4/6形成復(fù)合物，激活的CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進而啟動一系列與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞進入S期。而當(dāng)ZAC蛋白存在時，它可以增強p21和p27對CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物的抑制作用，使Rb不能被磷酸化，E2F無法釋放，從而阻斷細(xì)胞進入S期，抑制胃癌細(xì)胞的增殖。ZAC蛋白還可能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如CyclinE、CDK2等，來進一步影響細(xì)胞周期進程，加強對胃癌細(xì)胞生長的抑制作用。5.3ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的上下游關(guān)系綜合本研究的實驗結(jié)果以及相關(guān)研究的發(fā)現(xiàn)，深入剖析ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的上下游關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)ZAC基因極有可能處于生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路的下游位置，作為生長抑素發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶基因，在該通路中扮演著至關(guān)重要的角色。從實驗結(jié)果來看，生長抑素類似物奧曲肽（OCT）能夠以濃度和時間依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)。在MTT實驗中，不同濃度的奧曲肽作用于胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901不同時間后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。而在奧曲肽對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的影響實驗中，采用Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過100nmol/L奧曲肽作用24h后，BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞中ZAC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且這種誘導(dǎo)作用也具有濃度和時間依賴關(guān)系。這表明生長抑素通過奧曲肽這一類似物，在胃癌細(xì)胞中促進ZAC基因的表達(dá)。結(jié)合已有研究，在正常生理狀態(tài)下，生長抑素通過與細(xì)胞表面的生長抑素受體（SSTR）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其生理調(diào)節(jié)作用。在胃癌細(xì)胞中，SSTR同樣存在不同亞型的表達(dá)，且與生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長密切相關(guān)。研究表明，胃癌組織中SSTR3的陽性率顯著降低，SSTR2和SSTR5顯著增高。ZAC基因作為一種具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能的轉(zhuǎn)錄因子，可能是生長抑素抑制胃癌發(fā)生的下游靶基因。生長抑素與SSTR結(jié)合后，通過激活或抑制某些信號分子，間接影響ZAC基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。當(dāng)生長抑素與SSTR3結(jié)合時，可能通過激活相關(guān)信號通路，促進ZAC基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而增強ZAC基因的轉(zhuǎn)錄活性，使ZAC基因表達(dá)上調(diào)。當(dāng)ZAC基因表達(dá)上調(diào)后，其編碼的ZAC蛋白可通過與DNA結(jié)合，調(diào)控一系列與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。ZAC蛋白可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27相互作用，增強它們對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，阻止腫瘤細(xì)胞進入DNA合成期（S期），從而抑制細(xì)胞增殖。ZAC蛋白還能激活細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，如半胱天冬酶（caspase）家族成員，啟動細(xì)胞凋亡程序，促使腫瘤細(xì)胞死亡。在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中，生長抑素處于上游位置，通過與SSTR結(jié)合激活信號通路，誘導(dǎo)下游ZAC基因表達(dá)，ZAC基因表達(dá)產(chǎn)物ZAC蛋白再通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因，發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞生長的作用。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列實驗，深入探究了ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細(xì)胞生長通路中的作用，取得了以下重要研究成果：奧曲肽對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用：采用MTT法檢測不同濃度奧曲肽（OCT）在不同時間點對胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901增殖的影響，結(jié)果表明奧曲肽對胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖受到越來越顯著的抑制。綜合考慮抑制效果和實驗成本等因素，選取100nmol/L奧曲肽作用24h作為后續(xù)實驗的最佳條件。奧曲肽對胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用：運用Westernblot技術(shù)檢測100nmol/L奧曲肽作用24h后，胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中ZAC基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)奧曲肽能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因的表達(dá)，且這種誘導(dǎo)作用具有濃度和時間依賴關(guān)系。隨著奧曲肽濃度的增加以及作用時間的延長，ZAC基因的表達(dá)水平逐漸升高。ZAC基因敲低胃癌細(xì)胞系的成功建立：通過RNA干擾技術(shù)，將構(gòu)建好的ZAC-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901中，經(jīng)過G418篩選，成功獲得ZAC基因敲低（ZAC-KD）胃癌細(xì)胞系。RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ZAC-shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞中ZAC基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且pSUPER-EGFP-ZAC/2載體的敲低效果最佳。ZA