一株來源于商品牛血清的基因2型牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定及其序列分析摘要本研究旨在從商品牛血清中分離鑒定牛病毒性腹瀉病毒（BVDV），并對其進(jìn)行基因分型及序列分析。通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成功分離出一株病毒，經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光試驗和電鏡觀察等方法鑒定為基因2型BVDV。全基因組序列分析顯示，該毒株與已報道的基因2型BVDV具有較高的同源性，在非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)存在一定的變異。本研究為深入了解BVDV的分子流行病學(xué)特征及防控提供了重要依據(jù)。關(guān)鍵詞牛病毒性腹瀉病毒；基因2型；分離鑒定；序列分析一、引言牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，是引起牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovineviraldiarrhea-mucosaldisease，BVD-MD）的主要病原體。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV具有高度的遺傳多樣性，根據(jù)其基因組序列差異可分為基因1型（BVDV-1）和基因2型（BVDV-2），以及新近發(fā)現(xiàn)的基因3型（BVDV-3）和一些未分類的毒株。其中，BVDV-2型病毒的致病性較強(qiáng)，常引起牛群的急性感染和嚴(yán)重的臨床癥狀。商品牛血清作為生物制品生產(chǎn)中的重要原材料，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到生物制品的質(zhì)量和使用效果。然而，BVDV污染商品牛血清的情況時有發(fā)生，這不僅影響了生物制品的安全性，還可能導(dǎo)致病毒在牛群中的傳播擴(kuò)散。因此，對商品牛血清中BVDV的監(jiān)測和防控具有重要意義。本研究從市售商品牛血清中分離鑒定出一株BVDV，并對其進(jìn)行了全基因組序列分析，旨在為BVDV的分子流行病學(xué)研究和防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。二、材料與方法2.1材料2.1.1商品牛血清市售商品牛血清，購自多家生物制品公司。2.1.2細(xì)胞系MDBK（Madin-Darbybovinekidney）細(xì)胞，由本實驗室保存。該細(xì)胞系對BVDV敏感，常用于病毒的分離培養(yǎng)。2.1.3主要試劑和儀器DMEM（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium）培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNAMarker購自TaKaRa公司；BVDV特異性單克隆抗體購自Abcam公司；羊抗鼠IgG-FITC（fluoresceinisothiocyanate）購自JacksonImmunoResearch公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、倒置顯微鏡（Olympus）、PCR儀（Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、超速離心機(jī)（BeckmanCoulter）、透射電子顯微鏡（JEOL）等。2.2方法2.2.1病毒分離將商品牛血清用DMEM培養(yǎng)基按1:10的比例稀釋，接種于長滿單層MDBK細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。接種后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附1h，然后棄去接種液，用PBS（phosphate-bufferedsaline）沖洗細(xì)胞3次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變（Cytopathiceffect，CPE）情況，若出現(xiàn)典型的CPE，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等，則收集細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，取上清進(jìn)行盲傳。連續(xù)傳代3-5次，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。2.2.2RT-PCR鑒定采用TRIzol試劑提取分離病毒的RNA。具體操作如下：取140μL細(xì)胞培養(yǎng)物上清，加入1mLTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5min。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5min。棄上清，室溫晾干RNA沉淀，加入20μL無RNase水溶解RNA。以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板5μL，RNaseFreedH?O8μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的BVDV保守序列，設(shè)計一對特異性引物，擴(kuò)增BVDV的5'非編碼區(qū)（5'-untranslatedregion，5'-UTR）。引物序列如下：上游引物P1：5'-GACCCAGGACCAGGGTTAC-3'；下游引物P2：5'-CCACCCTCCACACCACAAC-3'。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMixture（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH?O14.3μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶。2.2.3間接免疫熒光試驗（Indirectimmunofluorescenceassay，IFA）將出現(xiàn)CPE的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS沖洗3次，每次5min。加入10%正常羊血清封閉30min，棄去封閉液，不洗。加入BVDV特異性單克隆抗體（1:200稀釋），37℃孵育1h，PBS沖洗3次，每次5min。再加入羊抗鼠IgG-FITC（1:200稀釋），37℃避光孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。最后用甘油-PBS（9:1）封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)特異性綠色熒光。2.2.4電鏡觀察將出現(xiàn)典型CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物收集于離心管中，4℃、3000rpm離心10min，取上清。將上清轉(zhuǎn)移至超速離心管中，4℃、100000rpm離心2h，棄上清，沉淀用少量PBS重懸。取一滴重懸液滴于銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染3min，自然干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)和大小。2.2.5全基因組測序及序列分析將分離鑒定的BVDV毒株送專業(yè)生物公司進(jìn)行全基因組測序。測序完成后，利用DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。首先對全基因組序列進(jìn)行拼接和校正，然后與GenBank中已收錄的不同基因型BVDV毒株的全基因組序列進(jìn)行比對，計算核苷酸同源性和氨基酸同源性。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析該毒株與其他BVDV毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。同時，對該毒株的結(jié)構(gòu)蛋白（如C、E?、E?、E?）和非結(jié)構(gòu)蛋白（如Npro、P7、NS?-3、NS?A、NS?B、NS?A、NS?B）編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，尋找可能存在的變異位點。三、結(jié)果3.1病毒分離結(jié)果將商品牛血清接種于MDBK細(xì)胞后，在第3代培養(yǎng)物中觀察到典型的CPE。細(xì)胞出現(xiàn)變圓、皺縮、脫落等現(xiàn)象，且隨著培養(yǎng)時間的延長，CPE逐漸加重。正常細(xì)胞對照生長良好，無CPE出現(xiàn)。結(jié)果表明，從商品牛血清中成功分離到一株具有細(xì)胞病變效應(yīng)的病毒。3.2RT-PCR鑒定結(jié)果以分離病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約280bp處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的特異性條帶，而正常細(xì)胞對照無擴(kuò)增條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，與GenBank中已報道的BVDV5'-UTR序列具有高度的同源性，進(jìn)一步證實分離到的病毒為BVDV。3.3間接免疫熒光試驗結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察，感染分離病毒的MDBK細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了特異性綠色熒光，而正常細(xì)胞對照無熒光信號。表明該分離病毒能夠與BVDV特異性單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步驗證了分離病毒為BVDV。3.4電鏡觀察結(jié)果在透射電子顯微鏡下觀察到，分離病毒粒子呈球形，直徑約為40-60nm，具有典型的瘟病毒形態(tài)特征。病毒粒子表面有包膜，包膜上有纖突結(jié)構(gòu)。這些形態(tài)學(xué)特征與已報道的BVDV病毒粒子形態(tài)一致。3.5全基因組測序及序列分析結(jié)果3.5.1全基因組序列特征分離毒株的全基因組序列長度為12282nt（nucleotide），包含一個大的開放閱讀框（Openreadingframe，ORF），編碼一個由3898個氨基酸組成的多聚蛋白。該多聚蛋白可被病毒自身編碼的蛋白酶切割成多個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。5'-UTR長度為372nt，3'-UTR長度為214nt。3.5.2同源性分析將分離毒株的全基因組序列與GenBank中已收錄的不同基因型BVDV毒株進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該毒株與基因2型BVDV毒株的核苷酸同源性為85%-92%，與基因1型BVDV毒株的核苷酸同源性為68%-72%，與基因3型BVDV毒株的核苷酸同源性為65%-69%。在氨基酸水平上，該毒株與基因2型BVDV毒株的氨基酸同源性為88%-95%，與基因1型和基因3型BVDV毒株的氨基酸同源性分別為70%-75%和67%-71%。表明該分離毒株屬于基因2型BVDV。3.5.3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析基于全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，該分離毒株與基因2型BVDV的多個毒株聚為一簇，而與基因1型和基因3型BVDV毒株明顯分開。在基因2型BVDV分支中，該分離毒株與一些國內(nèi)報道的基因2型BVDV毒株親緣關(guān)系較近，提示該毒株可能在國內(nèi)牛群中有一定的傳播。3.5.4結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列變異分析對分離毒株的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個變異位點。在結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，E?蛋白編碼區(qū)存在較多的變異位點，這些變異可能影響病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合及免疫逃逸能力。在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，NS?蛋白編碼區(qū)的部分變異位點可能影響病毒的復(fù)制和致病機(jī)制。具體的變異位點及其可能的功能影響需要進(jìn)一步的實驗驗證。四、討論本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR、間接免疫熒光試驗和電鏡觀察等方法，從商品牛血清中成功分離鑒定出一株基因2型BVDV。全基因組序列分析表明，該毒株與已報道的基因2型BVDV具有較高的同源性，但在結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)存在一定的變異。BVDV在牛群中的感染十分普遍，且感染后常呈隱性感染或持續(xù)性感染，不易被察覺。商品牛血清作為生物制品生產(chǎn)的重要原料，若被BVDV污染，可能導(dǎo)致生物制品質(zhì)量下降，甚至引發(fā)牛群的感染和疾病傳播。因此，加強(qiáng)對商品牛血清中BVDV的檢測和監(jiān)控至關(guān)重要。本研究中從市售商品牛血清中分離到BVDV，提示在生物制品生產(chǎn)過程中，應(yīng)嚴(yán)格把控原材料的質(zhì)量，建立完善的BVDV檢測體系，確保生物制品的安全性。基因2型BVDV的致病性較強(qiáng)，常引起牛群的急性感染和嚴(yán)重的臨床癥狀，如腹瀉、黏膜炎癥、流產(chǎn)、死胎等，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究分離的基因2型BVDV毒株在結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)存在的變異，可能會影響病毒的生物學(xué)特性，如毒力、免疫原性和傳播能力等。進(jìn)一步研究這些變異位點對病毒生物學(xué)功能的影響，有助于深入了解BVDV的致病機(jī)制和分子流行病學(xué)特征，為制定有效的防控措施提供理論依據(jù)。此外，本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該分離毒株與一些國內(nèi)報道的基因2型B