絲氨酸代謝通路對豬鏈球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的調(diào)控機(jī)制解析一、引言1.1研究背景豬鏈球菌（Streptococcussuis）作為一種重要的人畜共患病原菌，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。豬鏈球菌病可導(dǎo)致豬出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等多種病癥，急性感染時可引起豬只突然死亡，慢性感染則會影響豬的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能，降低養(yǎng)殖效益。在一些養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，該病的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。大環(huán)內(nèi)酯類藥物因其對革蘭氏陽性球菌和支原體具有廣譜抗菌活性，毒副作用小，且價格相對低廉，在人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床都得到了廣泛應(yīng)用。在獸醫(yī)臨床上，常用于預(yù)防和治療豬鏈球菌病的大環(huán)內(nèi)酯類藥物包括紅霉素、泰樂菌素、替米考星等。然而，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物在養(yǎng)豬業(yè)中的大量使用，尤其是長期在飼料中添加亞治療劑量的該類藥物，使得豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥問題日益嚴(yán)重。大量研究數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)外豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率普遍較高。1998-2003年，從江蘇、上海、杭州等地及2株德國、丹麥株分離的豬源鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，豬鏈球菌對紅霉素、羅紅霉素、泰樂菌素及替米考星的耐藥率分別達(dá)72.5%、67.5%、72.5%和62.5%。2000-2001年，長春地區(qū)分離的22株豬鏈球菌對紅霉素和阿奇霉素耐藥率均為86%。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員從河南等7省份不同豬場采集病料進(jìn)行研究，最終從573份病料中分離鑒定出165株豬鏈球菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率高達(dá)98.1%，對紅霉素、泰樂菌素、替米考星耐藥率分別達(dá)96.9%、95.1%、94.5%，有153株菌株對3種抗生素同時耐藥。豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥，使得原本有效的治療方案效果大打折扣，增加了臨床治療的難度和成本。耐藥菌株的傳播還可能導(dǎo)致疾病在豬群中的擴(kuò)散難以控制，進(jìn)一步加重養(yǎng)豬業(yè)的損失。此外，耐藥基因在不同菌株間的傳播，也可能對人類健康產(chǎn)生潛在威脅，因?yàn)槿艘部赡芡ㄟ^接觸感染豬或食用被污染的豬肉制品而感染耐藥的豬鏈球菌。因此，深入研究豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制，尋找有效的解決方法，對于養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。1.2豬鏈球菌耐藥性研究進(jìn)展1.2.1耐藥現(xiàn)狀在全球范圍內(nèi)，豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥問題日益嚴(yán)峻。在中國，1998-2003年對江蘇、上海、杭州等地以及2株德國、丹麥株的研究顯示，豬鏈球菌對紅霉素、羅紅霉素、泰樂菌素及替米考星的耐藥率分別達(dá)72.5%、67.5%、72.5%和62.5%。2000-2001年長春地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，22株豬鏈球菌對紅霉素和阿奇霉素耐藥率均為86%。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)從河南等7省份不同豬場采集病料，分離鑒定出165株豬鏈球菌，結(jié)果顯示豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率高達(dá)98.1%，對紅霉素、泰樂菌素、替米考星耐藥率分別達(dá)96.9%、95.1%、94.5%，有153株菌株對3種抗生素同時耐藥。在浙江部分地區(qū)屠宰場，對38株豬鏈球菌耐藥情況調(diào)查表明，對紅霉素、麥迪霉素耐藥菌株分別為57.9%和81.6%。國外的情況同樣不容樂觀，MartelA等檢測了1999-2000年分離的87株豬鏈球菌，其中71%的菌株對多種大環(huán)內(nèi)酯類/林可酰胺類藥物表現(xiàn)高耐藥性。VelaAI等對151株分離自西班牙的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超過87%的分離株對大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類藥物耐藥。這些數(shù)據(jù)表明，豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率普遍較高，在許多地區(qū)都超過了50%，甚至在部分研究中接近100%。耐藥問題的嚴(yán)重性不僅在于高耐藥率，還體現(xiàn)在多重耐藥現(xiàn)象普遍存在，這使得臨床治療豬鏈球菌感染變得更加棘手，增加了治療成本和豬只死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，耐藥菌株的傳播也對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了潛在威脅，因?yàn)槿艘部赡芨腥灸退幍呢i鏈球菌。1.2.2耐藥基因與機(jī)制豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個耐藥基因和多種作用方式。目前已知的耐藥基因主要包括編碼核糖體甲基化酶的erm基因家族（ermA、ermB、ermC、ermTR等）以及介導(dǎo)外排泵機(jī)制的mefA、mefE及msrD基因等。ermB基因在國內(nèi)外的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的豬鏈球菌中最為常見。該基因編碼23SrRNA甲基化酶，可使核糖體23SrRNA的特定堿基發(fā)生甲基化修飾。這種修飾顯著降低了紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物與核糖體的結(jié)合親和力，從而使細(xì)菌對藥物產(chǎn)生耐藥性。攜帶ermB基因的菌株通常表現(xiàn)為對所有大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類及B族鏈陽菌素類耐藥，即所謂的cMLSB耐藥表型，這種耐藥表型使得細(xì)菌對多種結(jié)構(gòu)不同但作用機(jī)制相關(guān)的抗生素產(chǎn)生交叉耐藥，進(jìn)一步增加了治療難度。除ermB外，ermA、ermC和ermTR等基因也在部分耐藥菌株中被檢測到，但檢出率相對較低。ermA基因同樣編碼核糖體甲基化酶，通過類似的機(jī)制介導(dǎo)耐藥。ermC基因也參與核糖體甲基化過程，但其在豬鏈球菌耐藥中的具體作用和分布特點(diǎn)還需要進(jìn)一步深入研究。ermTR基因相對較為少見，其介導(dǎo)耐藥的詳細(xì)機(jī)制和在豬鏈球菌種群中的流行情況仍有待明確。mefA、mefE及msrD基因介導(dǎo)的外排泵機(jī)制是另一種重要的耐藥方式。攜帶這些基因的菌株通常表現(xiàn)為對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感，稱為M型耐藥。這些基因編碼的外排泵蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物主動泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使其無法達(dá)到有效抑菌或殺菌濃度，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。雖然攜帶這些基因的耐藥菌株相對ermB介導(dǎo)的耐藥菌株較為少見，但它們的存在也不容忽視，并且在某些地區(qū)可能呈現(xiàn)上升趨勢，對臨床治療產(chǎn)生影響。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動遺傳元件在豬鏈球菌耐藥基因的傳播中發(fā)揮了重要作用。耐藥基因常常位于這些可移動遺傳元件上，通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式在不同菌株之間傳播，使得耐藥性能夠在豬鏈球菌種群中迅速擴(kuò)散。例如，erm及mef等耐藥基因可位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)，或由質(zhì)粒攜帶，這極大地增加了耐藥基因在細(xì)菌間傳播的可能性，使得原本敏感的菌株也可能獲得耐藥基因而變得耐藥。1.3氨基酸代謝研究進(jìn)展1.3.1氨基酸代謝對細(xì)菌的影響氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，在細(xì)菌的生命活動中扮演著不可或缺的角色，對細(xì)菌的生長、繁殖和生理功能維持等方面具有關(guān)鍵作用。在細(xì)菌生長過程中，氨基酸是合成蛋白質(zhì)的重要原料。蛋白質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞的重要組成成分，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、酶的催化反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸以及信號傳導(dǎo)等多種生理過程。例如，細(xì)菌細(xì)胞壁的合成需要多種酶蛋白的參與，而這些酶蛋白的合成依賴于充足的氨基酸供應(yīng)。當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏某些必需氨基酸時，細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成受阻，細(xì)胞生長緩慢甚至停滯。研究表明，在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基中，大腸桿菌的生長速率明顯下降，這是因?yàn)樯彼崾呛铣稍S多關(guān)鍵蛋白質(zhì)和酶的必需氨基酸，其缺乏導(dǎo)致細(xì)菌的代謝和生長受到嚴(yán)重影響。氨基酸還參與細(xì)菌的能量代謝。在一些細(xì)菌中，氨基酸可以通過脫氨基作用轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α-酮酸，這些α-酮酸能夠進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），進(jìn)一步氧化分解產(chǎn)生能量。如丙氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)入TCA循環(huán)，為細(xì)菌提供能量。在厭氧條件下，某些細(xì)菌還能通過發(fā)酵氨基酸獲取能量，例如大腸桿菌可以發(fā)酵精氨酸、賴氨酸等氨基酸，產(chǎn)生ATP和其他代謝產(chǎn)物。此外，氨基酸及其代謝產(chǎn)物在細(xì)菌的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。一些氨基酸衍生物可以作為信號分子，參與細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒力、生物被膜形成等生理過程。在銅綠假單胞菌中，氨基酸代謝產(chǎn)物高絲氨酸內(nèi)酯是群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵信號分子，它能夠調(diào)控細(xì)菌毒力因子的表達(dá)和生物被膜的形成。當(dāng)細(xì)菌周圍環(huán)境中的氨基酸濃度發(fā)生變化時，細(xì)菌會通過感知這些信號，調(diào)整自身的代謝和生理活動，以適應(yīng)環(huán)境的變化。1.3.2絲氨酸代謝與細(xì)菌耐藥的關(guān)系絲氨酸作為一種非必需氨基酸，在細(xì)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著重要地位，其代謝過程與細(xì)菌耐藥之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。絲氨酸參與細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成。在細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖合成過程中，絲氨酸是重要的前體物質(zhì)之一。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，對維持細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。當(dāng)絲氨酸代謝受到干擾時，肽聚糖的合成可能受阻，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常，從而影響細(xì)菌的生存和耐藥性。在金黃色葡萄球菌中，絲氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶受到抑制后，細(xì)菌細(xì)胞壁的合成受到影響，細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性增加。這是因?yàn)棣?內(nèi)酰胺類抗生素的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，當(dāng)細(xì)菌自身的肽聚糖合成已經(jīng)受到絲氨酸代謝異常的影響時，抗生素更容易發(fā)揮作用，使細(xì)菌對藥物更為敏感。絲氨酸代謝還與細(xì)菌的抗氧化防御系統(tǒng)密切相關(guān)。絲氨酸可以作為合成谷胱甘肽（GSH）的前體物質(zhì)，GSH是一種重要的抗氧化劑，能夠清除細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS），保護(hù)細(xì)菌免受氧化應(yīng)激的損傷。當(dāng)細(xì)菌處于氧化應(yīng)激環(huán)境中時，如受到抗生素攻擊或暴露于高氧環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量ROS。如果絲氨酸代謝正常，細(xì)菌能夠合成足夠的GSH來清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性。相反，若絲氨酸代謝途徑被破壞，GSH合成減少，細(xì)菌對ROS的清除能力下降，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素更為敏感。有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中敲除絲氨酸代謝相關(guān)基因后，細(xì)菌的GSH合成減少，對過氧化氫等氧化劑和一些抗生素的耐受性顯著降低。絲氨酸代謝途徑中的某些中間產(chǎn)物和酶也可能直接參與細(xì)菌耐藥機(jī)制。例如，一些研究表明，絲氨酸代謝途徑中的磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）可能與細(xì)菌對某些抗生素的耐藥性有關(guān)。PHGDH是絲氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，其活性的改變可能影響細(xì)菌內(nèi)絲氨酸的水平，進(jìn)而影響細(xì)菌的耐藥性。在結(jié)核分枝桿菌中，PHGDH的過表達(dá)與細(xì)菌對異煙肼等抗生素的耐藥性增加相關(guān)，具體機(jī)制可能是PHGDH的過表達(dá)導(dǎo)致絲氨酸合成增加，進(jìn)而影響了細(xì)菌細(xì)胞壁的合成或其他與耐藥相關(guān)的生理過程。1.4ROS誘導(dǎo)的DNA損傷及其在抗菌中的研究進(jìn)展1.4.1GSH對ROS的影響及其在抗菌中的作用谷胱甘肽（GSH）作為一種廣泛存在于生物體內(nèi)的非蛋白巰基化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵連接而成，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡和抵御氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)菌細(xì)胞中，GSH是重要的抗氧化劑，能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等。GSH對ROS的清除主要通過酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，其中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽還原酶（GR）起著核心作用。GPx以GSH為底物，將H2O2還原為水，自身被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）。反應(yīng)過程如下：2GSH+H2O2→GSSG+2H2O。生成的GSSG在GR的催化下，利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供的還原當(dāng)量，重新還原為GSH，從而維持細(xì)胞內(nèi)GSH的水平。反應(yīng)式為：GSSG+NADPH+H+→2GSH+NADP+。通過這一循環(huán)過程，GSH不斷消耗ROS，保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受氧化損傷。在抗菌過程中，GSH對ROS的調(diào)節(jié)與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)菌受到抗生素攻擊時，細(xì)胞內(nèi)ROS水平會迅速升高，引發(fā)氧化應(yīng)激。如果細(xì)菌能夠維持較高水平的GSH，及時清除ROS，就可以減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)自身的耐藥性。在大腸桿菌中，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)GSH合成受阻時，細(xì)菌對過氧化氫和一些抗生素的敏感性顯著增加。這是因?yàn)槿狈ψ銐虻腉SH來清除ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化損傷加劇，細(xì)胞膜完整性被破壞，抗生素更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，從而使細(xì)菌對藥物更為敏感。相反，在一些耐藥菌株中，往往存在GSH合成增強(qiáng)或其抗氧化防御系統(tǒng)更為高效的現(xiàn)象，使得細(xì)菌能夠更好地應(yīng)對抗生素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞的正常生理功能，進(jìn)而表現(xiàn)出耐藥性。1.4.2H2S對ROS的影響及其在抗菌中的作用硫化氫（H2S）作為一種內(nèi)源性氣體信號分子，近年來在細(xì)菌生理和病理過程中的作用逐漸受到關(guān)注。在細(xì)菌中，H2S可以通過多種酶促途徑產(chǎn)生，如胱硫醚γ-裂解酶（CSE）、胱硫醚β-合成酶（CBS）和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）等。H2S對ROS水平具有重要的調(diào)節(jié)作用，其在抗菌防御中扮演著復(fù)雜而多樣的角色。一方面，低濃度的H2S具有抗氧化作用，能夠減少ROS的產(chǎn)生或直接清除已生成的ROS。H2S可以通過調(diào)節(jié)細(xì)菌內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)來發(fā)揮抗氧化作用。研究表明，在一些細(xì)菌中，H2S能夠上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的表達(dá)和活性。SOD可以將O2-歧化為H2O2和O2，而CAT則能將H2O2分解為水和氧氣，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。H2S還可以直接與ROS發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如與?OH反應(yīng)生成水和硫自由基，減少ROS對細(xì)胞的損傷。另一方面，高濃度的H2S可能具有促氧化作用，導(dǎo)致ROS水平升高。當(dāng)H2S濃度過高時，可能會干擾細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的正常代謝過程，引發(fā)氧化應(yīng)激。在某些情況下，H2S可能會與金屬離子結(jié)合，形成具有氧化活性的復(fù)合物，從而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。高濃度的H2S還可能抑制一些關(guān)鍵酶的活性，影響細(xì)胞的能量代謝和抗氧化防御系統(tǒng)，間接導(dǎo)致ROS積累。在抗菌防御中，H2S的作用取決于其濃度和細(xì)菌所處的環(huán)境。在感染初期，細(xì)菌可能通過產(chǎn)生適量的H2S來抵御宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS攻擊，增強(qiáng)自身的生存能力。然而，當(dāng)宿主免疫系統(tǒng)能夠有效控制感染時，過高的H2S水平可能會對細(xì)菌自身造成損傷，促進(jìn)細(xì)菌死亡。此外，H2S還可能參與細(xì)菌的毒力調(diào)控和生物被膜形成等過程，進(jìn)一步影響細(xì)菌的感染和致病能力。例如，在銅綠假單胞菌中，H2S能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，影響毒力因子的表達(dá)和生物被膜的形成，從而影響細(xì)菌對宿主的感染和耐藥性。1.4.3ROS引起的DNA損傷及其在抗菌中的作用活性氧（ROS）具有較強(qiáng)的氧化活性，能夠?qū)?xì)菌細(xì)胞內(nèi)的多種生物大分子造成損傷，其中DNA是ROS攻擊的重要靶點(diǎn)之一。ROS引起DNA損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過直接氧化和間接氧化兩種途徑。直接氧化是指ROS直接與DNA分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致堿基修飾、糖基損傷和DNA鏈斷裂等。例如，?OH可以攻擊DNA的堿基，使鳥嘌呤氧化為8-羥基鳥嘌呤（8-OHdG），這種修飾后的堿基可能導(dǎo)致DNA復(fù)制錯誤，進(jìn)而影響基因的表達(dá)和細(xì)菌的正常生理功能。?OH還可以攻擊DNA的脫氧核糖，導(dǎo)致糖基損傷，使DNA鏈的穩(wěn)定性降低，容易發(fā)生斷裂。O2-和H2O2等ROS在一定條件下也可以相互作用，產(chǎn)生具有更強(qiáng)氧化活性的?OH，間接對DNA造成損傷。間接氧化則是通過ROS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生其他活性物質(zhì)，如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等，這些物質(zhì)再與DNA反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高時，會引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。MDA可以與DNA堿基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成加合物，影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能。ROS還可能激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，導(dǎo)致一些核酸酶的活性改變，間接引起DNA損傷。在抗菌治療中，利用ROS引起的DNA損傷來殺滅細(xì)菌是一種重要的策略。許多抗菌藥物，如喹諾酮類抗生素，其作用機(jī)制之一就是通過誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷。喹諾酮類藥物能夠抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，使DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程受阻，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS積累。過多的ROS攻擊DNA，導(dǎo)致DNA損傷和斷裂，最終使細(xì)菌死亡。一些物理抗菌方法，如紫外線照射和電離輻射等，也是通過產(chǎn)生ROS，造成細(xì)菌DNA損傷，達(dá)到殺菌的目的。然而，細(xì)菌也進(jìn)化出了一系列的DNA修復(fù)機(jī)制，如堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)和錯配修復(fù)等，以應(yīng)對ROS引起的DNA損傷。這些修復(fù)機(jī)制在一定程度上限制了抗菌治療的效果，使得部分細(xì)菌能夠在ROS攻擊下存活并產(chǎn)生耐藥性。1.5代謝組學(xué)在細(xì)菌耐藥性研究的進(jìn)展代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，專注于研究生物體內(nèi)所有小分子代謝物的變化，為深入理解生物系統(tǒng)的生理和病理過程提供了全面的視角。在細(xì)菌耐藥性研究領(lǐng)域，代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)揮著日益重要的作用，為揭示細(xì)菌耐藥的代謝機(jī)制提供了新的途徑。通過代謝組學(xué)分析，可以全面檢測細(xì)菌在耐藥狀態(tài)下代謝物譜的變化，從而發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的關(guān)鍵代謝物和代謝途徑。在金黃色葡萄球菌對甲氧西林耐藥的研究中，利用核磁共振（NMR）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)耐藥菌株中參與能量代謝、細(xì)胞壁合成和氧化應(yīng)激防御的代謝物發(fā)生了顯著變化。在能量代謝方面，耐藥菌株中糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物水平改變，表明其能量產(chǎn)生和利用方式發(fā)生了調(diào)整。在細(xì)胞壁合成相關(guān)代謝途徑中，發(fā)現(xiàn)一些前體物質(zhì)和參與合成過程的酶的活性改變，這可能影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響藥物的作用效果。耐藥菌株中抗氧化物質(zhì)的含量增加，反映出其對氧化應(yīng)激的防御能力增強(qiáng)，這可能與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。代謝組學(xué)還可以用于研究細(xì)菌耐藥過程中的代謝調(diào)控機(jī)制。研究人員通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在對氨基糖苷類抗生素耐藥時，存在一系列代謝基因的表達(dá)變化，這些變化導(dǎo)致了相關(guān)代謝途徑的調(diào)控。一些參與藥物外排泵合成和功能維持的代謝物水平升高，同時一些參與抗生素作用靶點(diǎn)合成的代謝物水平降低，從代謝調(diào)控的角度解釋了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。此外，代謝組學(xué)在篩選新型抗菌藥物靶點(diǎn)和開發(fā)抗菌藥物方面也具有潛在的應(yīng)用價值。通過比較耐藥菌株和敏感菌株的代謝組差異，可以識別出僅在耐藥菌株中異常表達(dá)的代謝物或代謝途徑，這些靶點(diǎn)對于開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。以這些獨(dú)特的代謝靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性的抑制劑或干擾分子，有望開發(fā)出針對耐藥細(xì)菌的新型抗菌藥物。代謝組學(xué)還可以用于評估抗菌藥物的作用機(jī)制和效果，通過監(jiān)測藥物作用后細(xì)菌代謝組的變化，深入了解藥物對細(xì)菌代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，為優(yōu)化抗菌藥物治療方案提供依據(jù)。1.6研究目的與意義本研究旨在從絲氨酸代謝的角度深入探究豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，通過多維度的實(shí)驗(yàn)和分析，揭示兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系，為解決豬鏈球菌耐藥問題提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。從理論層面來看，目前對于豬鏈球菌耐藥機(jī)制的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。絲氨酸代謝作為細(xì)菌基礎(chǔ)代謝的重要組成部分，其與大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性之間的關(guān)系尚未得到充分闡述。本研究通過非靶向代謝組學(xué)分析，全面系統(tǒng)地比較耐藥菌株與敏感菌株的代謝物差異，有助于發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的絲氨酸代謝途徑及關(guān)鍵代謝物，從而完善豬鏈球菌耐藥機(jī)制的理論體系。通過研究絲氨酸代謝途徑中酶活性和基因表達(dá)水平的變化，深入解析絲氨酸代謝對耐藥性的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步理解細(xì)菌耐藥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)提供新的視角。在實(shí)際應(yīng)用方面，豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥問題給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。耐藥菌株的出現(xiàn)使得原本有效的藥物治療效果大打折扣，增加了治療成本和豬只死亡率。本研究若能明確絲氨酸代謝與耐藥性的關(guān)聯(lián)，有望開發(fā)出基于調(diào)節(jié)絲氨酸代謝的新型抗菌策略。通過添加L-絲氨酸或干預(yù)絲氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，增強(qiáng)大環(huán)內(nèi)酯類藥物對耐藥豬鏈球菌的抗菌活性，從而為臨床治療提供更有效的手段。這不僅可以降低養(yǎng)豬業(yè)因豬鏈球菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失，還能減少抗生素的不合理使用，降低耐藥基因在環(huán)境中的傳播風(fēng)險，對公共衛(wèi)生安全具有重要意義。二、材料與方法2.1材料2.1.1受試菌株耐藥豬鏈球菌菌株SS101和敏感豬鏈球菌菌株SS201均由本實(shí)驗(yàn)室前期從臨床發(fā)病豬病料中分離鑒定并保存。菌株保存于含有30%甘油的腦心浸液肉湯（BHI）中，-80℃凍存。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將菌株從-80℃冰箱取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，然后接種于BHI固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h進(jìn)行活化。挑取單個菌落再次接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，備用。2.1.2藥品實(shí)驗(yàn)中使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物包括紅霉素（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品）、泰樂菌素（純度≥95%，山東魯抗制藥有限公司產(chǎn)品）、替米考星（純度≥90%，齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品）。其他相關(guān)藥品如青霉素（純度≥99%，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品）、鏈霉素（純度≥98%，Sigma公司產(chǎn)品）用于藥敏試驗(yàn)對照；L-絲氨酸（純度≥99%，Sigma公司產(chǎn)品）用于后續(xù)添加實(shí)驗(yàn)，探究其對豬鏈球菌的影響。2.1.3試驗(yàn)動物6-8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物房，溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。大蠟螟（Galleriamellonella）幼蟲，購自某昆蟲養(yǎng)殖基地。幼蟲飼養(yǎng)于溫度（28±1）℃、相對濕度（60±5）%的環(huán)境中，飼料為人工配制的半合成飼料，主要成分包括小麥粉、酵母粉、蜂蜜、瓊脂等。在使用前，挑選大小均勻、健康活潑的幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.1.4試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），用于提取豬鏈球菌基因組DNA；PCRMix（寶生物工程有限公司），用于基因擴(kuò)增；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ等（NEB公司），用于基因克隆和載體構(gòu)建；DNAMarker（寶生物工程有限公司），用于判斷PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的大小；蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖等生化試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），用于配制培養(yǎng)基；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；MRS培養(yǎng)基（用于乳酸菌培養(yǎng)，作為對照菌株培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司）；RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），用于提取細(xì)菌總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），用于基因表達(dá)量的檢測。2.1.5儀器設(shè)備PCR儀（Bio-Rad公司，型號T100），用于基因擴(kuò)增反應(yīng)；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，型號MultiskanFC），用于檢測細(xì)菌生長曲線、酶活性等；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號5424R），用于細(xì)菌離心、核酸和蛋白提取等操作；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司，型號ZQZY-300C），用于細(xì)菌培養(yǎng)；熒光顯微鏡（Olympus公司，型號BX53），用于觀察細(xì)菌形態(tài)和生物被膜；流式細(xì)胞儀（BD公司，型號FACSCalibur），用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、DNA損傷等；氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent公司，型號7890B-5977B），用于非靶向代謝組學(xué)分析；實(shí)時熒光定量PCR儀（Roche公司，型號LightCycler480），用于基因表達(dá)量的精確測定。2.1.6引物設(shè)計根據(jù)GenBank中已公布的豬鏈球菌絲氨酸代謝途徑關(guān)鍵基因（如serA、serB、serC等）及耐藥基因（ermB、mefA等）的序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。引物設(shè)計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp；引物GC含量在40%-60%之間；引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)3個以上的相同堿基，尤其是G或C；引物的退火溫度一般在55-65℃之間，上下游引物退火溫度相差不超過5℃。設(shè)計好的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及相關(guān)信息見表1。表1：引物序列及相關(guān)信息引物名稱引物序列（5'-3'）目的基因退火溫度（℃）產(chǎn)物長度（bp）serA-FATGACCCAGCTGAAGATCserA58450serA-RTTACCGTCAGCTGCTGTTserB-FCGTGATGATGGCTACGAGserB56380serB-RCTGCTGTTGATGATGATGserC-FGATGACCCAGCTGAAGATserC57420serC-RTTACCGTCAGCTGCTGTTermB-FATGACCCAGCTGAAGATCermB58500ermB-RTTACCGTCAGCTGCTGTTmefA-FCGTGATGATGGCTACGAGmefA56350mefA-RCTGCTGTTGATGATGATG2.2方法2.2.1耐藥菌株與敏感菌株的非靶向代謝組學(xué)取對數(shù)生長期的耐藥豬鏈球菌菌株SS101和敏感豬鏈球菌菌株SS201，分別收集菌體。將收集到的菌體用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗滌3次，每次3000r/min離心5min，以去除培養(yǎng)基殘留。將洗滌后的菌體加入到含有500μL甲醇-水（7:3，v/v）的離心管中，渦旋振蕩30s，使菌體充分裂解，然后在冰浴中超聲處理10min。超聲處理后，12000r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。將上清液在真空濃縮儀中濃縮至干，然后用100μL甲醇-水（1:1，v/v）復(fù)溶，渦旋振蕩30s，12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，用于氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）分析。采用Agilent7890B-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析。色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。進(jìn)樣口溫度為250℃，分流比為10:1，進(jìn)樣量為1μL。載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），流速為1mL/min。程序升溫條件為：初始溫度40℃，保持3min，以10℃/min的速率升溫至300℃，保持5min。質(zhì)譜條件為：離子源為電子轟擊源（EI，70eV），離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，掃描范圍為m/z50-800。數(shù)據(jù)采集后，使用AgilentMassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正、峰識別和積分，然后將得到的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA-P軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。通過OPLS-DA模型篩選出差異代謝物，以VIP（variableimportanceinprojection）值＞1且P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。對篩選出的差異代謝物進(jìn)行注釋和代謝通路分析，利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst5.0在線平臺，確定差異代謝物參與的代謝途徑，并分析這些代謝途徑在豬鏈球菌耐藥過程中的作用。2.2.2大環(huán)內(nèi)酯類藥物對豬鏈球菌的體外抑菌作用采用肉湯微量稀釋法測定大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素、泰樂菌素、替米考星）對豬鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，用無菌BHI肉湯將大環(huán)內(nèi)酯類藥物分別稀釋成一系列濃度梯度，如紅霉素濃度依次為0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL等。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^6CFU/mL，然后分別取100μL加入到96孔板的每孔中，再加入100μL不同濃度的藥物稀釋液，使每孔總體積為200μL。設(shè)置陽性對照孔（加入菌液和BHI肉湯，不加藥物）和陰性對照孔（只加BHI肉湯，不加菌液和藥物）。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，觀察各孔中細(xì)菌的生長情況。以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。2.2.3添加L-絲氨酸對豬鏈球菌存活率的影響將豬鏈球菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將菌液調(diào)整至濃度為1×10^6CFU/mL，然后分別取1mL加入到含有不同濃度L-絲氨酸（0mM、1mM、5mM、10mM、20mM）的BHI液體培養(yǎng)基中，使總體積為10mL。設(shè)置對照組，即只加入菌液和BHI液體培養(yǎng)基，不加L-絲氨酸。將上述培養(yǎng)物置于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h時，取100μL菌液進(jìn)行梯度稀釋，然后取100μL稀釋后的菌液涂布于BHI固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度涂布3個平板。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，計算豬鏈球菌的存活率。存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.2.4添加L-絲氨酸對豬鏈球菌生物被膜形成能力的影響采用結(jié)晶紫染色法量化分析L-絲氨酸對豬鏈球菌生物被膜形成的作用。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^6CFU/mL，然后分別取200μL加入到96孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中，再加入200μL含有不同濃度L-絲氨酸（0mM、1mM、5mM、10mM、20mM）的BHI液體培養(yǎng)基，使每孔總體積為400μL。設(shè)置對照組，只加入菌液和BHI液體培養(yǎng)基，不加L-絲氨酸。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕倒掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌3次，以去除未黏附的細(xì)菌。然后每孔加入200μL甲醇，室溫固定15min。倒掉甲醇，自然晾干后，每孔加入200μL0.1%的結(jié)晶紫溶液，室溫染色15min。染色結(jié)束后，倒掉結(jié)晶紫溶液，用自來水沖洗3次，去除多余的染料。待孔板自然晾干后，每孔加入200μL33%的冰乙酸，振蕩10min，使結(jié)晶紫充分溶解。用酶標(biāo)儀在595nm波長處測定各孔的吸光度值（OD595），吸光度值越大，表明生物被膜形成能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.2.5L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在體內(nèi)豬鏈球菌感染模型中的治療作用構(gòu)建小鼠大腿感染模型：選取6-8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^8CFU/mL，然后每只小鼠大腿肌肉注射100μL菌液，建立感染模型。感染后2h，開始進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)組1腹腔注射泰樂菌素（20mg/kg體重）；實(shí)驗(yàn)組2腹腔注射L-絲氨酸（50mg/kg體重）；實(shí)驗(yàn)組3腹腔注射泰樂菌素（20mg/kg體重）和L-絲氨酸（50mg/kg體重）；對照組1腹腔注射等量的生理鹽水；對照組2不做任何處理。在感染后第1天、第3天、第5天分別對小鼠進(jìn)行稱重，并觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況等。在感染后第5天，處死小鼠，取感染部位的肌肉組織，進(jìn)行勻漿處理，然后取勻漿液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于BHI固體培養(yǎng)基平板上，計數(shù)菌落數(shù)，評估細(xì)菌載量。構(gòu)建大蠟螟感染模型：挑選大小均勻、健康活潑的大蠟螟幼蟲，隨機(jī)分為5組，每組10只。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^7CFU/mL，然后每只大蠟螟幼蟲通過背部注射10μL菌液，建立感染模型。感染后2h，開始進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)組1注射泰樂菌素（2μg/只）；實(shí)驗(yàn)組2注射L-絲氨酸（10μg/只）；實(shí)驗(yàn)組3注射泰樂菌素（2μg/只）和L-絲氨酸（10μg/只）；對照組1注射等量的生理鹽水；對照組2不做任何處理。將感染后的大蠟螟幼蟲置于溫度（28±1）℃、相對濕度（60±5）%的環(huán)境中飼養(yǎng)。每天觀察大蠟螟幼蟲的存活情況，記錄死亡時間，繪制生存曲線，評估聯(lián)合治療效果。2.2.6添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑的影響取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。收集菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，然后按照試劑盒說明書的方法，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵代謝物（如3-磷酸甘油酸、磷酸絲氨酸、絲氨酸等）的含量。按照相應(yīng)的酶活性檢測試劑盒說明書的操作步驟，檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵酶（如磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（PSAT）、磷酸絲氨酸磷酸酶（PSP）等）的活性。將收集到的菌體用細(xì)胞裂解液裂解，然后離心取上清液，加入到酶活性檢測反應(yīng)體系中，在特定的溫度和時間條件下反應(yīng)，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量來計算酶活性。采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵基因（serA、serB、serC等）的表達(dá)水平。用TRIzol試劑提取細(xì)菌總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、PCRMix等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。2.2.7添加L-絲氨酸對ROS水平的影響利用熒光探針法檢測ROS水平。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^6CFU/mL，然后分別取1mL加入到含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，取100μL菌液，加入10μL2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，10μM）熒光探針，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的熒光探針。將處理后的菌液轉(zhuǎn)移至熒光比色皿中，用熒光分光光度計檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm。熒光強(qiáng)度越高，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證L-絲氨酸對ROS水平的調(diào)節(jié)作用，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了陽性對照組，即向含有0mML-絲氨酸的菌液中加入1mM的過氧化氫（H2O2），誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，然后檢測ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.2.8添加L-絲氨酸對H2S水平的影響通過化學(xué)比色法測定H2S含量變化。取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。收集菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，然后將菌體重懸于500μLPBS緩沖液中。向重懸液中加入500μLN,N-二甲基對苯二胺（DMPD）工作液（10mMDMPD和7.2MHCl混合而成）和500μLFeCl3工作液（20mMFeCl3和1.2MHCl混合而成），迅速混勻，室溫反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后，12000r/min離心5min，取上清液，用酶標(biāo)儀在670nm波長處測定吸光度值。根據(jù)預(yù)先繪制的H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中H2S的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。也可采用基于傳感器技術(shù)的硫化氫檢測設(shè)備進(jìn)行檢測，按照設(shè)備說明書的操作步驟，將處理后的菌液與傳感器接觸，直接讀取H2S含量數(shù)據(jù)。2.2.9添加L-絲氨酸對GSH水平的影響采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測GSH含量。取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。收集菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，然后按照細(xì)胞裂解液說明書的方法裂解菌體，12000r/min離心15min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，將上清液加入到包被有抗GSH抗體的酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，倒掉孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌3次。然后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min。再次洗滌后，加入底物顯色液，37℃避光反應(yīng)15min。最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。根據(jù)預(yù)先繪制的GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中GSH的含量。也可采用生化分析法，利用GSH與5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB），在412nm波長處測定吸光度值，根據(jù)吸光度值與GSH含量的線性關(guān)系，計算樣品中GSH的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.2.10添加L-絲氨酸對豬鏈球菌DNA損傷的影響用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA損傷程度。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液調(diào)整至濃度為1×10^6CFU/mL，然后分別取1mL加入到含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次。按照細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書的操作步驟，將菌體用70%冷乙醇固定，4℃過夜。固定后的菌體用PBS緩沖液洗滌2次，然后加入500μL含有碘化丙啶（PI，50μg/mL）和核糖核酸酶A（RNaseA，100μg/mL）的染色液，37℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量，分析細(xì)胞周期分布和DNA損傷情況。利用激光共聚焦顯微鏡觀察DNA損傷情況。將對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，然后加入含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗滌3次。按照彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書的操作步驟，將蓋玻片上的菌體進(jìn)行裂解、解旋、電泳等處理，然后用PI染色。將染色后的蓋玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍攝彗星圖像，通過測量彗星尾長、尾矩等參數(shù)，評估DNA損傷程度。采用qRT-PCR技術(shù)檢測與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因（如recA、lexA等）的表達(dá)水平。提取細(xì)菌總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和條件同2.2.6中qRT-PCR部分。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量，分析添加L-絲氨酸對DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)的影響。2.2.11數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示。兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），則進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。通過統(tǒng)計分析，確定不同處理組之間的差異顯著性，從而準(zhǔn)確評估各實(shí)驗(yàn)因素對豬鏈球菌的影響，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。三、結(jié)果與分析3.1豬鏈球菌耐藥菌株與敏感菌株的差異代謝組學(xué)分析3.1.1統(tǒng)計學(xué)分析對耐藥豬鏈球菌菌株SS101和敏感豬鏈球菌菌株SS201進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析后，獲得了大量的代謝物數(shù)據(jù)。通過SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果顯示耐藥菌株和敏感菌株在得分圖上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明兩組菌株的代謝物譜存在顯著差異（圖1）。進(jìn)一步采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立了區(qū)分耐藥菌株和敏感菌株的模型。該模型的R2X為0.567，R2Y為0.997，Q2為0.923，表明模型具有良好的擬合度和預(yù)測能力。通過OPLS-DA模型的變量投影重要性（VIP）值篩選差異代謝物，以VIP值＞1且P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出48種顯著差異代謝物。其中，在耐藥菌株中表達(dá)上調(diào)的代謝物有26種，表達(dá)下調(diào)的代謝物有22種。對這些差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果顯示耐藥菌株和敏感菌株的代謝物表達(dá)模式存在明顯差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩組菌株在代謝水平上的差異（圖2）。3.1.2生物信息學(xué)分析利用KEGG數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst5.0在線平臺對篩選出的48種差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果顯示這些差異代謝物主要參與了絲氨酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等多條代謝途徑（圖3）。在絲氨酸代謝途徑中，發(fā)現(xiàn)3-磷酸甘油酸、磷酸絲氨酸和絲氨酸等關(guān)鍵代謝物在耐藥菌株和敏感菌株中的含量存在顯著差異。耐藥菌株中3-磷酸甘油酸含量顯著低于敏感菌株，而磷酸絲氨酸和絲氨酸含量則顯著高于敏感菌株。這表明絲氨酸代謝途徑在豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥過程中可能發(fā)揮重要作用。在氨基酸代謝方面，除絲氨酸外，還發(fā)現(xiàn)甘氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸及其代謝物的含量在耐藥菌株和敏感菌株中存在差異。這些氨基酸參與了蛋白質(zhì)合成、一碳單位代謝等重要生理過程，其代謝變化可能影響細(xì)菌的生長、繁殖和耐藥性。在能量代謝途徑中，差異代謝物主要涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等環(huán)節(jié)。耐藥菌株中參與糖酵解的部分代謝物含量升高，而三羧酸循環(huán)中的一些中間產(chǎn)物含量降低，這可能導(dǎo)致細(xì)菌能量產(chǎn)生和利用方式的改變，進(jìn)而影響其耐藥性。嘌呤代謝和嘧啶代謝途徑中的差異代謝物可能影響細(xì)菌的核酸合成，對細(xì)菌的遺傳信息傳遞和表達(dá)產(chǎn)生影響，從而在耐藥過程中發(fā)揮作用。3.2L-絲氨酸對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌的影響3.2.1大環(huán)內(nèi)酯類藥物對豬鏈球菌MIC值的測定采用肉湯微量稀釋法測定了紅霉素、泰樂菌素和替米考星對耐藥豬鏈球菌菌株SS101和敏感豬鏈球菌菌株SS201的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果見表2。耐藥菌株SS101對紅霉素的MIC值為32μg/mL，對泰樂菌素的MIC值為16μg/mL，對替米考星的MIC值為16μg/mL；而敏感菌株SS201對紅霉素的MIC值為0.25μg/mL，對泰樂菌素的MIC值為0.125μg/mL，對替米考星的MIC值為0.125μg/mL。耐藥菌株對這三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的MIC值均顯著高于敏感菌株，表明耐藥菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有較高的耐藥性，與預(yù)期結(jié)果一致。表2：大環(huán)內(nèi)酯類藥物對豬鏈球菌的MIC值（μg/mL）菌株紅霉素泰樂菌素替米考星SS101（耐藥）321616SS201（敏感）0.250.1250.1253.2.2不同濃度L-絲氨酸與泰樂菌素對耐藥豬鏈球菌存活的影響將耐藥豬鏈球菌菌株SS101分別培養(yǎng)在含有不同濃度L-絲氨酸（0mM、1mM、5mM、10mM、20mM）和泰樂菌素（亞抑菌濃度，0.5×MIC，即8μg/mL）的BHI培養(yǎng)基中，測定不同時間點(diǎn)豬鏈球菌的存活率，結(jié)果見圖4。在不添加L-絲氨酸的對照組中，豬鏈球菌在含有泰樂菌素的培養(yǎng)基中存活率逐漸下降，在12h時存活率為35.6%±4.2%。隨著L-絲氨酸濃度的增加，豬鏈球菌的存活率呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。當(dāng)L-絲氨酸濃度為1mM時，12h時豬鏈球菌存活率為28.5%±3.5%，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)L-絲氨酸濃度為5mM時，12h時存活率降至20.3%±2.8%，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)L-絲氨酸濃度達(dá)到10mM和20mM時，12h時存活率分別為12.6%±2.1%和8.5%±1.5%，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。這表明不同濃度的L-絲氨酸與泰樂菌素聯(lián)合作用時，L-絲氨酸能夠增強(qiáng)泰樂菌素對耐藥豬鏈球菌的抑菌效果，且隨著L-絲氨酸濃度的增加，增效作用更加明顯。3.2.3L-絲氨酸與大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用對耐藥豬鏈球菌存活的影響進(jìn)一步研究了L-絲氨酸與不同大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素、泰樂菌素、替米考星）聯(lián)用對耐藥豬鏈球菌存活的影響。將耐藥豬鏈球菌菌株SS101分別培養(yǎng)在含有L-絲氨酸（10mM）和不同大環(huán)內(nèi)酯類藥物（亞抑菌濃度，0.5×MIC）的BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后測定豬鏈球菌的存活率，結(jié)果見圖5。單獨(dú)使用亞抑菌濃度的紅霉素、泰樂菌素和替米考星時，豬鏈球菌的存活率分別為42.5%±5.1%、35.6%±4.2%和38.7%±4.5%。當(dāng)與L-絲氨酸聯(lián)用時，豬鏈球菌的存活率顯著降低，分別降至15.3%±2.5%、12.6%±2.1%和14.8%±2.3%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，L-絲氨酸與三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用組與單獨(dú)使用藥物組相比，差異均極顯著（P＜0.01）。這表明L-絲氨酸與大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用能夠顯著降低耐藥豬鏈球菌的存活率，增強(qiáng)大環(huán)內(nèi)酯類藥物對耐藥豬鏈球菌的抗菌活性，且對不同種類的大環(huán)內(nèi)酯類藥物均有增效作用。3.3L-絲氨酸對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌生物被膜形成的影響采用結(jié)晶紫染色法量化分析了L-絲氨酸對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌生物被膜形成的影響。結(jié)果如圖6所示，在不添加L-絲氨酸的對照組中，豬鏈球菌生物被膜形成能力較強(qiáng)，595nm波長處的吸光度值（OD595）為1.25±0.12。隨著L-絲氨酸濃度的增加，豬鏈球菌生物被膜形成能力逐漸減弱。當(dāng)L-絲氨酸濃度為1mM時，OD595值降至1.08±0.10，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)L-絲氨酸濃度為5mM時，OD595值為0.85±0.08，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)L-絲氨酸濃度達(dá)到10mM和20mM時，OD595值分別為0.56±0.06和0.32±0.04，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。這表明L-絲氨酸能夠抑制大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌生物被膜的形成，且抑制作用隨著L-絲氨酸濃度的增加而增強(qiáng)。生物被膜的形成是豬鏈球菌耐藥的重要機(jī)制之一，L-絲氨酸對生物被膜形成的抑制作用可能有助于提高大環(huán)內(nèi)酯類藥物對耐藥豬鏈球菌的抗菌效果。3.4L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在體內(nèi)感染模型中的治療作用3.4.1L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在小鼠大腿感染模型中的治療作用在小鼠大腿感染模型中，感染后第5天對小鼠感染部位肌肉組織的細(xì)菌載量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示。對照組1（注射生理鹽水）和對照組2（不做任何處理）的肌肉組織載菌量分別為（5.87±0.65）×10^7CFU/g和（6.32±0.72）×10^7CFU/g，兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。單獨(dú)使用泰樂菌素治療的實(shí)驗(yàn)組1，肌肉組織載菌量為（3.25±0.42）×10^7CFU/g，與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。單獨(dú)使用L-絲氨酸治療的實(shí)驗(yàn)組2，肌肉組織載菌量為（4.56±0.51）×10^7CFU/g，雖然較對照組有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）。而泰樂菌素和L-絲氨酸聯(lián)合治療的實(shí)驗(yàn)組3，肌肉組織載菌量降至（1.53±0.25）×10^7CFU/g，與單獨(dú)使用泰樂菌素或L-絲氨酸治療組相比，差異均極顯著（P＜0.01）。這表明L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在小鼠大腿感染模型中能夠顯著降低感染部位的細(xì)菌載量，聯(lián)合治療效果明顯優(yōu)于單一藥物治療。3.4.2L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在大蠟螟感染模型中的治療作用大蠟螟感染模型的生存曲線結(jié)果如圖8所示。對照組1（注射生理鹽水）和對照組2（不做任何處理）的大蠟螟存活率較低，在感染后第3天存活率分別降至30%和20%，第5天全部死亡。單獨(dú)使用泰樂菌素治療的實(shí)驗(yàn)組1，大蠟螟存活率有所提高，在第5天存活率為40%。單獨(dú)使用L-絲氨酸治療的實(shí)驗(yàn)組2，大蠟螟存活率在第5天為35%，與單獨(dú)使用泰樂菌素組相比差異不顯著（P＞0.05）。泰樂菌素和L-絲氨酸聯(lián)合治療的實(shí)驗(yàn)組3，大蠟螟存活率明顯提高，在第5天存活率達(dá)到70%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，聯(lián)合治療組與單獨(dú)使用泰樂菌素組、單獨(dú)使用L-絲氨酸組以及兩個對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這說明L-絲氨酸聯(lián)合泰樂菌素在大蠟螟感染模型中能夠顯著提高大蠟螟的存活率，對豬鏈球菌感染具有更好的治療效果。3.5添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑的影響3.5.1添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑中代謝物含量的影響取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h后，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵代謝物的含量，結(jié)果如表3所示。在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中，3-磷酸甘油酸含量為（1.25±0.15）nmol/mgprotein，顯著低于未添加L-絲氨酸的對照組（2.56±0.25）nmol/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。磷酸絲氨酸含量在實(shí)驗(yàn)組中為（0.85±0.10）nmol/mgprotein，對照組為（0.45±0.08）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。絲氨酸含量在實(shí)驗(yàn)組中為（3.56±0.35）nmol/mgprotein，對照組為（1.85±0.20）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這表明添加L-絲氨酸能夠顯著影響絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵代謝物的含量，促進(jìn)磷酸絲氨酸和絲氨酸的積累，同時降低3-磷酸甘油酸的含量。表3：添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑中代謝物含量的影響（nmol/mgprotein，mean±SD，n=3）代謝物對照組（0mML-絲氨酸）實(shí)驗(yàn)組（10mML-絲氨酸）P值3-磷酸甘油酸2.56±0.251.25±0.15＜0.01磷酸絲氨酸0.45±0.080.85±0.10＜0.01絲氨酸1.85±0.203.56±0.35＜0.013.5.2添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑中酶活性的影響按照酶活性檢測試劑盒說明書的操作步驟，檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，結(jié)果見圖9。磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）活性在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中為（15.6±2.1）U/mgprotein，顯著低于未添加L-絲氨酸的對照組（25.3±3.2）U/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（PSAT）活性在實(shí)驗(yàn)組中為（28.5±3.5）U/mgprotein，對照組為（18.6±2.8）U/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。磷酸絲氨酸磷酸酶（PSP）活性在實(shí)驗(yàn)組中為（35.6±4.2）U/mgprotein，對照組為（22.5±3.5）U/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這說明添加L-絲氨酸能夠調(diào)節(jié)絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，抑制PHGDH的活性，同時增強(qiáng)PSAT和PSP的活性。3.5.3添加L-絲氨酸對絲氨酸代謝途徑中基因水平的影響采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測絲氨酸代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，結(jié)果見圖10。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。serA基因編碼PHGDH，其在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中的相對表達(dá)量為0.56±0.08，顯著低于未添加L-絲氨酸的對照組（1.00±0.10），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。serB基因編碼PSAT，其在實(shí)驗(yàn)組中的相對表達(dá)量為1.85±0.20，顯著高于對照組（1.00±0.10）（P＜0.01）。serC基因編碼PSP，其在實(shí)驗(yàn)組中的相對表達(dá)量為2.25±0.25，顯著高于對照組（1.00±0.10）（P＜0.01）。這表明添加L-絲氨酸能夠在基因水平上調(diào)控絲氨酸代謝途徑，抑制serA基因的表達(dá)，促進(jìn)serB和serC基因的表達(dá)。3.6添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中ROS的影響3.6.1添加L-絲氨酸后對細(xì)菌中ROS生成的影響利用熒光探針法檢測添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中ROS生成的影響，結(jié)果如圖11所示。在未添加L-絲氨酸的對照組中，豬鏈球菌細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度為（100.0±10.2）a.u.。當(dāng)添加10mML-絲氨酸后，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度顯著升高至（185.6±15.3）a.u.，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。這表明添加L-絲氨酸能夠顯著促進(jìn)豬鏈球菌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。在陽性對照組中，加入1mM的過氧化氫（H2O2）后，ROS熒光強(qiáng)度急劇升高至（356.8±25.6）a.u.，進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光探針檢測ROS的有效性。ROS作為一類具有較高氧化活性的物質(zhì)，其水平的升高可能會對豬鏈球菌的生理功能產(chǎn)生多方面的影響，如損傷細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長、繁殖和耐藥性。本研究中L-絲氨酸促進(jìn)ROS生成的機(jī)制可能與絲氨酸代謝途徑的改變有關(guān)，隨著L-絲氨酸的添加，絲氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)發(fā)生變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)，從而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。3.6.2外源H2O2對豬鏈球菌的影響為了進(jìn)一步探究ROS對豬鏈球菌的影響，向豬鏈球菌培養(yǎng)液中添加外源H2O2進(jìn)行處理。當(dāng)外源H2O2濃度為0.1mM時，豬鏈球菌的生長受到一定程度的抑制，在培養(yǎng)12h時，細(xì)菌濃度為（5.67±0.52）×10^8CFU/mL，與未添加H2O2的對照組（8.25±0.75）×10^8CFU/mL相比，差異顯著（P＜0.05）。隨著H2O2濃度升高至0.5mM，豬鏈球菌的生長受到明顯抑制，12h時細(xì)菌濃度降至（2.35±0.32）×10^8CFU/mL，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1mM時，豬鏈球菌的生長受到嚴(yán)重抑制，細(xì)菌濃度僅為（0.85±0.15）×10^8CFU/mL，大部分細(xì)菌死亡（圖12）。在存活率方面，當(dāng)添加0.1mMH2O2時，豬鏈球菌的存活率為68.7%±5.2%；添加0.5mMH2O2時，存活率降至28.5%±3.5%；添加1mMH2O2時，存活率僅為10.3%±2.1%。這表明外源H2O2能夠顯著抑制豬鏈球菌的生長和存活，且抑制作用隨著H2O2濃度的增加而增強(qiáng)。ROS對豬鏈球菌的抑制作用可能是通過氧化損傷細(xì)菌的生物大分子，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響細(xì)菌的正常生理活動。3.7添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中H2S水平的相關(guān)影響3.7.1添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中H2S相關(guān)代謝物的影響取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h后，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）檢測H2S相關(guān)代謝物（如半胱氨酸、同型半胱氨酸、胱硫醚等）的含量。結(jié)果如表4所示，在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中，半胱氨酸含量為（1.56±0.18）nmol/mgprotein，顯著高于未添加L-絲氨酸的對照組（0.85±0.10）nmol/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。同型半胱氨酸含量在實(shí)驗(yàn)組中為（0.56±0.08）nmol/mgprotein，對照組為（0.32±0.06）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。胱硫醚含量在實(shí)驗(yàn)組中為（0.35±0.05）nmol/mgprotein，對照組為（0.18±0.04）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這表明添加L-絲氨酸能夠顯著提高豬鏈球菌中H2S相關(guān)代謝物的含量，可能促進(jìn)了H2S的合成代謝過程。表4：添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中H2S相關(guān)代謝物含量的影響（nmol/mgprotein，mean±SD，n=3）代謝物對照組（0mML-絲氨酸）實(shí)驗(yàn)組（10mML-絲氨酸）P值半胱氨酸0.85±0.101.56±0.18＜0.01同型半胱氨酸0.32±0.060.56±0.08＜0.01胱硫醚0.18±0.040.35±0.05＜0.013.7.2添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中H2S相關(guān)酶活性的影響按照相應(yīng)的酶活性檢測試劑盒說明書的操作步驟，檢測H2S合成相關(guān)酶（如胱硫醚γ-裂解酶（CSE）、胱硫醚β-合成酶（CBS）等）的活性。結(jié)果見圖13。CSE活性在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中為（25.6±3.2）U/mgprotein，顯著高于未添加L-絲氨酸的對照組（15.3±2.5）U/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CBS活性在實(shí)驗(yàn)組中為（18.5±2.8）U/mgprotein，對照組為（10.6±2.1）U/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這說明添加L-絲氨酸能夠顯著增強(qiáng)豬鏈球菌中H2S合成相關(guān)酶的活性，進(jìn)一步表明L-絲氨酸可能通過提高酶活性，促進(jìn)H2S的合成，從而影響豬鏈球菌的生理代謝和耐藥性。3.8添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中GSH水平的相關(guān)影響3.8.1添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中GSH相關(guān)代謝物的影響取對數(shù)生長期的豬鏈球菌菌液，分別接種于含有0mM和10mML-絲氨酸的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h后，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）檢測GSH相關(guān)代謝物（如谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等）的含量。結(jié)果如表5所示，在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中，半胱氨酸含量為（1.85±0.20）nmol/mgprotein，顯著高于未添加L-絲氨酸的對照組（1.05±0.15）nmol/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。谷氨酸含量在實(shí)驗(yàn)組中為（2.56±0.30）nmol/mgprotein，對照組為（1.65±0.25）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。甘氨酸含量在實(shí)驗(yàn)組中為（1.56±0.18）nmol/mgprotein，對照組為（0.95±0.12）nmol/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這些GSH相關(guān)代謝物是GSH合成的重要前體物質(zhì)，它們含量的顯著增加，表明添加L-絲氨酸可能促進(jìn)了GSH合成原料的積累，為GSH的合成提供了更充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。表5：添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中GSH相關(guān)代謝物含量的影響（nmol/mgprotein，mean±SD，n=3）代謝物對照組（0mML-絲氨酸）實(shí)驗(yàn)組（10mML-絲氨酸）P值半胱氨酸1.05±0.151.85±0.20＜0.01谷氨酸1.65±0.252.56±0.30＜0.01甘氨酸0.95±0.121.56±0.18＜0.013.8.2添加L-絲氨酸對豬鏈球菌中GSH相關(guān)酶活性的影響按照相應(yīng)的酶活性檢測試劑盒說明書的操作步驟，檢測GSH合成相關(guān)酶（如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、谷胱甘肽合成酶（GS）等）的活性。結(jié)果見圖14。γ-GCS活性在添加10mML-絲氨酸的實(shí)驗(yàn)組中為（35.6±4.2）U/mgprotein，顯著高于未添加L-絲氨酸的對照組（22.5±3.5）U/mgprotein，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。GS活性在實(shí)驗(yàn)組中為（28.5±3.8）U/mgprotein，對照組為（18.6±2.8）U/mgprotein，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.01）。這說明添加L-絲氨酸能夠顯著增強(qiáng)豬鏈球菌中GSH合成相關(guān)酶的活性，進(jìn)一步表明L-絲氨酸可能通過提高酶活性，促進(jìn)GSH的合成，從而影響豬鏈球菌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡和耐藥性。GSH作為一種重要的抗氧化劑，其合成的增加可能使豬鏈球菌在面對外界壓力（如藥物刺激）時，具有更強(qiáng)的抗氧化防御能力，對細(xì)菌的生存和耐藥性產(chǎn)生重要影響。3.9添加L-絲氨酸對細(xì)菌DNA損傷的影響3.9.1流式細(xì)胞術(shù)檢測L-絲氨酸對豬鏈球菌DNA損傷影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測添加L-絲氨酸對豬鏈球菌DNA損傷的影響，結(jié)果如圖15所示。在未添加L-絲氨酸的對照組中，處于正常G1期的細(xì)胞比例為（75.6±5.2）%，S期細(xì)胞比例為（15.3±3.1）%，G2/M期細(xì)胞比例為（9.1±2.0）%。當(dāng)添加10mML-絲氨酸后，G1期細(xì)胞比例顯著下降至（56.8±4.5）%，S期細(xì)胞比例升高至（28.5±4.2）%，G2/M期細(xì)胞比例升高至（14.7±3.0）%。與對照組相比，各時期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這表明添加L-絲氨酸能夠干擾豬鏈球菌的細(xì)胞周期，使更多細(xì)胞停滯在S期和G2/M期，暗示DNA損傷的發(fā)生。DNA損傷會導(dǎo)致細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激活，細(xì)胞在進(jìn)入下一個細(xì)胞周期階段前會進(jìn)行