RNAi沉默polβ基因：解鎖卵巢癌細(xì)胞增殖與化療敏感性的新密碼一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來，盡管醫(yī)療技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，但卵巢癌的發(fā)病率仍居高不下，且多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差，5年生存率較低，病死率高居?jì)D科腫瘤之首。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是卵巢癌的主要治療手段之一，然而，化療耐藥問題嚴(yán)重制約了治療效果，許多患者在手術(shù)和化療后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，臨床治療不得不選擇有效性較低的藥物。探究卵巢癌的耐藥機(jī)制，尋找有效的靶點(diǎn)和方法來提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，對(duì)于改善卵巢癌患者的治療效果和提高生存率具有至關(guān)重要的意義。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，能夠特異性地抑制靶基因的表達(dá)。通過RNAi技術(shù)沉默特定基因，為研究基因功能以及開發(fā)新的治療策略提供了有力工具。DNA聚合酶β（DNApolymeraseβ，polβ）是聚合酶X家族的成員，主要參與堿基切除修復(fù)，在單核苷酸缺口的填補(bǔ)中發(fā)揮重要作用。由于其錯(cuò)配率較高，被稱為生物進(jìn)化過程的“看家酶”。正常情況下，polβ在體內(nèi)呈恒定的低水平表達(dá)，但在多種人類腫瘤組織中，如直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等，均發(fā)現(xiàn)polβ的高表達(dá)。在卵巢組織從正常到癌變的過程中，polβ的表達(dá)量逐漸增加，且腫瘤分化程度越低、臨床分期越高，其表達(dá)量越強(qiáng)。目前，國內(nèi)外尚無運(yùn)用RNAi技術(shù)阻抑卵巢癌細(xì)胞中polβ基因表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在利用RNAi技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞中的polβ基因表達(dá)，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性以及對(duì)化療藥物順鉑敏感性的影響，為卵巢癌的治療提供新的思路和方法，有望改善卵巢癌患者的預(yù)后，為腫瘤的有效干預(yù)和治療開拓新的領(lǐng)域。1.2研究目的本研究旨在利用RNAi技術(shù)沉默人卵巢癌細(xì)胞中的polβ基因，深入探究polβ基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖活性的影響，明確其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。同時(shí)，通過觀察沉默polβ基因后卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑敏感性的變化，為解決卵巢癌化療耐藥問題提供新的靶點(diǎn)和治療策略，期望能夠提高卵巢癌的化療效果，改善患者的預(yù)后，為卵巢癌的臨床治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在卵巢癌研究領(lǐng)域，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制探索的不斷深入，RNAi技術(shù)和polβ基因逐漸成為研究熱點(diǎn)。RNAi技術(shù)作為一種高效、特異性的基因沉默工具，在腫瘤基因治療研究中展現(xiàn)出巨大潛力，為攻克卵巢癌等惡性腫瘤帶來了新的希望。眾多研究聚焦于利用RNAi技術(shù)針對(duì)不同的關(guān)鍵基因進(jìn)行靶向沉默，以探究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，如對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程的調(diào)控機(jī)制，為卵巢癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。關(guān)于polβ基因，大量研究已證實(shí)其在多種人類腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在卵巢癌中，從正常卵巢組織到癌變的過程中，polβ的表達(dá)量逐漸增加，且腫瘤分化程度越低、臨床分期越高，其表達(dá)量越強(qiáng)。這種表達(dá)變化與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，提示polβ基因可能在卵巢癌的惡性進(jìn)展中扮演重要角色，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。然而，目前針對(duì)RNAi技術(shù)沉默polβ基因在卵巢癌中的研究尚處于起步階段，國內(nèi)外尚無運(yùn)用RNAi技術(shù)阻抑卵巢癌細(xì)胞中polβ基因表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道。雖然在其他腫瘤類型中，對(duì)polβ基因的功能和調(diào)控機(jī)制有了一定程度的了解，但卵巢癌具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和發(fā)病機(jī)制，不能簡(jiǎn)單地將其他腫瘤的研究結(jié)果類推到卵巢癌中。對(duì)于RNAi技術(shù)在卵巢癌細(xì)胞中沉默polβ基因后，如何具體影響細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)行為，以及對(duì)化療藥物敏感性的改變及其內(nèi)在分子機(jī)制，都亟待深入研究。此外，如何優(yōu)化RNAi技術(shù)的遞送效率，提高其在卵巢癌細(xì)胞中的靶向性和穩(wěn)定性，減少潛在的副作用，也是未來研究需要解決的重要問題。綜上所述，深入開展RNAi沉默polβ基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞增殖活性及對(duì)化療藥物敏感性影響的研究，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，對(duì)于全面揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.4研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究主要采用了實(shí)驗(yàn)研究法和文獻(xiàn)研究法。在實(shí)驗(yàn)研究方面，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將人卵巢癌細(xì)胞HO-8910進(jìn)行體外培養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來源。利用RNAi技術(shù)，將已構(gòu)建成功的針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，以沉默polβ基因的表達(dá)。運(yùn)用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確保實(shí)驗(yàn)操作的有效性。通過熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中polβmRNA的表達(dá)水平，從分子層面驗(yàn)證基因沉默效果。使用MTT法觀察檢測(cè)基因沉默后細(xì)胞增殖能力變化，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法了解細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑敏感性的變化，從而深入探究polβ基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖活性及對(duì)化療藥物敏感性的影響。在文獻(xiàn)研究方面，廣泛查閱國內(nèi)外關(guān)于卵巢癌、RNAi技術(shù)和polβ基因的相關(guān)文獻(xiàn)資料，全面了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，為本研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。通過對(duì)已有研究成果的分析和總結(jié)，明確本研究的切入點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)，避免重復(fù)研究，確保研究的科學(xué)性和創(chuàng)新性。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在技術(shù)應(yīng)用和研究視角兩個(gè)方面。在技術(shù)應(yīng)用上，首次將RNAi技術(shù)應(yīng)用于沉默卵巢癌細(xì)胞中的polβ基因，為卵巢癌的研究提供了新的技術(shù)手段。通過精準(zhǔn)調(diào)控polβ基因的表達(dá)，深入探究其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在研究視角上，從polβ基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖活性及化療藥物敏感性的影響這一獨(dú)特視角出發(fā)，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面研究的空白，有助于全面揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更具針對(duì)性的理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RNAi技術(shù)原理2.1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)與定義RNAi的發(fā)現(xiàn)歷程充滿了科學(xué)探索的驚喜。1990年，植物學(xué)家在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將色素合成酶基因?qū)胨{(lán)色喇叭花，期望能讓花朵更加鮮艷，然而結(jié)果卻出乎意料，得到了白色花瓣。后續(xù)其他植物學(xué)家在紅色喇叭花中也觀察到了類似的可重復(fù)現(xiàn)象，經(jīng)過深入研究，發(fā)現(xiàn)這是一種普遍存在于植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）現(xiàn)象，并且這種現(xiàn)象在脈孢菌和線蟲中同樣存在。1998年，美國科學(xué)家安德魯?法爾（AndrewFire）和克雷格?梅洛（CraigMello）在研究線蟲時(shí)，確定雙鏈RNA（dsRNAs）是線蟲PTGS的誘因，并將其命名為RNA干擾（RNAi），至此揭開了RNAi研究的序幕。2001年，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了小分子干擾RNA（siRNA），2002年，《Science》將RNAi列為年度突破技術(shù)，此后RNAi獲得了迅猛發(fā)展，并在2006年，安德魯?法爾和克雷格?梅洛因在RNAi機(jī)制研究方面的杰出貢獻(xiàn)，榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。RNAi從本質(zhì)上來說，是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。在細(xì)胞內(nèi)，雙鏈RNA可以特異性地識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的mRNA序列，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的抑制。這一過程猶如一把精準(zhǔn)的“分子剪刀”，能夠在眾多基因中找到目標(biāo)基因的mRNA，并將其剪斷，使其無法翻譯為蛋白質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到關(guān)閉特定基因表達(dá)的目的。RNAi不僅是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，廣泛存在于從植物、線蟲到哺乳動(dòng)物等多種生物體內(nèi)，參與生物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病毒防御等多種生理過程；同時(shí)，它也作為一種強(qiáng)大的生物技術(shù)工具，在基因功能研究、藥物開發(fā)、疾病治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，為生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)發(fā)展帶來了新的契機(jī)。2.1.2RNAi的分子機(jī)制RNAi的分子機(jī)制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）時(shí)，無論是由RNA病毒感染、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄，還是外源導(dǎo)入基因表達(dá)等原因產(chǎn)生的，都會(huì)被一種具有RNase樣活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶，即Dicer酶識(shí)別。Dicer酶以ATP依賴的方式，逐步將dsRNA切割成由正義鏈和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），其長(zhǎng)度通常為21-23nt，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。這些siRNA就像是被Dicer酶精心裁剪好的“小片段武器”，為后續(xù)的基因沉默過程做好準(zhǔn)備。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA雙鏈會(huì)結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物，從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在這個(gè)過程中，需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程，使RISC激活。激活后的RISC就如同被賦予了精準(zhǔn)定位能力的“分子導(dǎo)彈”，通過堿基配對(duì)的方式，能夠準(zhǔn)確地定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上。然后，在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置，RISC中的核酸酶會(huì)對(duì)mRNA進(jìn)行切割，使其降解，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的干擾。這一過程高度特異性，只有與siRNA序列互補(bǔ)的mRNA才會(huì)被識(shí)別和切割，保證了RNAi能夠精準(zhǔn)地作用于目標(biāo)基因，而不會(huì)對(duì)其他無關(guān)基因產(chǎn)生影響。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣會(huì)被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，從而使啟動(dòng)子失去功能，導(dǎo)致其下游基因沉默，進(jìn)一步豐富了RNAi的作用機(jī)制和調(diào)控方式。2.1.3RNAi技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀在癌癥研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研究工具和潛在的治療手段，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但也面臨著一些挑戰(zhàn)。在基因功能研究方面，RNAi技術(shù)為深入探究癌癥相關(guān)基因的功能提供了有力支持。通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定癌癥相關(guān)基因的siRNA，能夠特異性地沉默這些基因的表達(dá)，從而研究它們?cè)诎┘?xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過程中的作用機(jī)制。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些癌基因如Bcl-2、c-Myc等在癌細(xì)胞的存活和增殖中起著關(guān)鍵作用，利用RNAi技術(shù)沉默這些基因后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，凋亡增加，為理解癌癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。在癌癥靶向治療研究中，RNAi技術(shù)被視為一種極具潛力的新型治療策略。其可以針對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如異常表達(dá)的癌基因、腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路分子等，設(shè)計(jì)特異性的siRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊。一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)在探索RNAi技術(shù)在癌癥治療中的應(yīng)用，部分研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。例如，Sirnaomics公司的RNAi療法STP707，由靶向TGF-β1和COX-2mRNA的兩個(gè)siRNA寡核苷酸組成，在治療多種實(shí)體瘤的1期臨床試驗(yàn)中，約74%的可評(píng)估患者呈現(xiàn)出疾病穩(wěn)定，有數(shù)名患者腫瘤負(fù)荷量減輕。然而，RNAi技術(shù)在癌癥研究和治療應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先是遞送問題，如何將siRNA高效、安全地遞送至靶細(xì)胞內(nèi)，是實(shí)現(xiàn)其治療效果的關(guān)鍵。siRNA是帶有負(fù)電荷的核酸大分子，難以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，且在循環(huán)系統(tǒng)中容易被核酸酶降解，穩(wěn)定性較差。目前雖然開發(fā)了多種遞送方法，包括病毒載體和非病毒載體等，但每種方法都存在一定的局限性，如病毒載體存在免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)和毒性問題，非病毒載體的遞送效率相對(duì)較低等。其次，RNAi治療可能會(huì)引發(fā)脫靶效應(yīng)，即siRNA與非靶基因的mRNA發(fā)生部分匹配結(jié)合，導(dǎo)致非特異性的基因沉默，從而產(chǎn)生潛在的副作用。此外，如何優(yōu)化RNAi技術(shù)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，提高其治療效果和安全性，降低成本，也是亟待解決的問題。2.2polβ基因相關(guān)知識(shí)2.2.1polβ基因的結(jié)構(gòu)與功能polβ基因在聚合酶X家族中占據(jù)獨(dú)特地位，其結(jié)構(gòu)和功能的特殊性使其在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從結(jié)構(gòu)上看，polβ基因由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)約15kb。polβ蛋白包含8個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊，呈現(xiàn)出右手狀結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具備了特定的功能域，以實(shí)現(xiàn)其在DNA修復(fù)中的作用。在功能方面，polβ主要參與堿基切除修復(fù)（BaseExcisionRepair，BER）通路。在細(xì)胞內(nèi)，DNA會(huì)不斷受到各種內(nèi)外因素的損傷，如活性氧（ROS）、烷化劑等，這些損傷可能導(dǎo)致堿基的修飾、缺失或錯(cuò)配。堿基切除修復(fù)通路能夠識(shí)別并修復(fù)這些損傷，維持基因組的穩(wěn)定性。polβ在這一過程中扮演著不可或缺的角色，它負(fù)責(zé)填補(bǔ)單核苷酸缺口，完成DNA鏈的修復(fù)合成。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)，首先由DNA糖苷酶識(shí)別并切除受損的堿基，形成無堿基位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）。接著，AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)的5’端切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口。此時(shí)，polβ利用其聚合酶活性，以互補(bǔ)的DNA鏈為模板，將正確的脫氧核苷酸添加到缺口處，填補(bǔ)單核苷酸缺口。隨后，DNA連接酶將新合成的核苷酸與相鄰的DNA鏈連接起來，完成修復(fù)過程。這種精準(zhǔn)的修復(fù)機(jī)制對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，如果polβ基因發(fā)生異常，可能導(dǎo)致DNA修復(fù)功能受損，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而引發(fā)腫瘤等疾病。此外，polβ還參與了一些其他的DNA代謝過程，如重組修復(fù)和DNA復(fù)制的保真度維持。在重組修復(fù)中，polβ協(xié)助修復(fù)DNA雙鏈斷裂，通過與其他修復(fù)蛋白相互作用，促進(jìn)DNA雙鏈的重新連接和修復(fù)。在DNA復(fù)制過程中，雖然polβ不是主要的復(fù)制酶，但其在維持復(fù)制保真度方面發(fā)揮著一定的作用，能夠及時(shí)糾正復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，確保遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞。2.2.2polβ基因在正常細(xì)胞與癌細(xì)胞中的表達(dá)差異研究表明，polβ基因在正常卵巢組織和卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)存在顯著差異，且這種差異與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。在正常卵巢組織中，polβ基因呈恒定的低水平表達(dá)，這有助于維持細(xì)胞內(nèi)DNA的穩(wěn)定性和正常的生理功能。正常細(xì)胞中的低水平表達(dá)是機(jī)體精確調(diào)控的結(jié)果，通過一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和信號(hào)通路，維持polβ基因在合適的表達(dá)水平，以滿足細(xì)胞正常的DNA修復(fù)需求。然而，在卵巢癌細(xì)胞中，polβ基因的表達(dá)量明顯增加。從正常卵巢組織到癌變的過程中，隨著腫瘤的發(fā)展，polβ的表達(dá)量逐漸上升，尤其在腫瘤分化程度越低、臨床分期越高的情況下，其表達(dá)量越強(qiáng)。在高分化的卵巢癌細(xì)胞中，polβ的表達(dá)水平相對(duì)較低，而在低分化的卵巢癌細(xì)胞中，polβ的表達(dá)水平顯著升高。這種表達(dá)差異可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。高表達(dá)的polβ可能為腫瘤細(xì)胞提供了更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力，使其能夠在不斷增殖和受到各種損傷的情況下，維持基因組的相對(duì)穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。腫瘤細(xì)胞中polβ表達(dá)的上調(diào)還可能與腫瘤的耐藥性相關(guān)，增強(qiáng)的DNA修復(fù)能力使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物等造成的DNA損傷更具抵抗力，導(dǎo)致化療耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。2.2.3polβ基因?qū)?xì)胞增殖和化療藥物敏感性的潛在影響機(jī)制polβ基因?qū)?xì)胞增殖和化療藥物敏感性的影響涉及多個(gè)潛在機(jī)制，這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。polβ基因可能通過影響DNA損傷修復(fù)能力來調(diào)控細(xì)胞增殖。在正常細(xì)胞中，polβ參與堿基切除修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性，保證細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和分裂。然而，在腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的polβ可能增強(qiáng)了DNA損傷修復(fù)能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠快速修復(fù)因增殖過程中產(chǎn)生的DNA損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到紫外線、化療藥物等因素導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，高表達(dá)的polβ能夠迅速參與修復(fù)過程，減少DNA損傷對(duì)細(xì)胞增殖的阻礙，使得腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖。如果通過RNAi技術(shù)沉默polβ基因，降低其表達(dá)水平，腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力將受到抑制，DNA損傷無法及時(shí)修復(fù)，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。polβ基因與化療藥物敏感性密切相關(guān)。化療藥物的作用機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死。腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的polβ會(huì)增強(qiáng)其對(duì)化療藥物造成的DNA損傷的修復(fù)能力，從而降低對(duì)化療藥物的敏感性。以順鉑為例，順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)與DNA結(jié)合形成鉑-DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷。在polβ高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞中，polβ能夠迅速識(shí)別并修復(fù)這種損傷，使腫瘤細(xì)胞得以存活，產(chǎn)生耐藥性。而沉默polβ基因后，卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著增加，相同劑量的順鉑能夠誘導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡。這可能是因?yàn)槌聊琾olβ基因后，細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力下降，順鉑造成的DNA損傷無法有效修復(fù)，積累的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。polβ基因還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來間接影響細(xì)胞增殖和化療藥物敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，polβ可以與一些信號(hào)通路分子相互作用，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，polβ可能通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基相互作用，影響PI3K的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)Akt的磷酸化水平。Akt是一種重要的細(xì)胞存活和增殖信號(hào)分子，其活性的改變會(huì)影響細(xì)胞的增殖和存活。在腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的polβ可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力。而沉默polβ基因后，可能會(huì)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，降低細(xì)胞的增殖能力，提高對(duì)化療藥物的敏感性。2.3人卵巢癌細(xì)胞特性及化療藥物敏感性概述2.3.1人卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性人卵巢癌細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。從形態(tài)學(xué)上看，卵巢癌細(xì)胞形態(tài)多樣，常見的有上皮樣細(xì)胞形態(tài)，呈多邊形或立方形，細(xì)胞邊界相對(duì)清晰，細(xì)胞間連接緊密。在體外培養(yǎng)條件下，卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，生長(zhǎng)迅速，能夠在合適的培養(yǎng)基中快速分裂，形成密集的細(xì)胞集落。與正常卵巢細(xì)胞相比，卵巢癌細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞周期進(jìn)程加快，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變，使得癌細(xì)胞能夠不斷地進(jìn)行分裂增殖。卵巢癌細(xì)胞在分化方面也表現(xiàn)出異常。正常卵巢細(xì)胞具有特定的分化特征和功能，能夠執(zhí)行正常的生理活動(dòng)。而卵巢癌細(xì)胞的分化程度較低，失去了正常細(xì)胞的分化特征，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)和功能的異常。低分化的卵巢癌細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的惡性行為，如更高的增殖活性、更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這是因?yàn)榈头只?xì)胞中一些與細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)受到抑制，而與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。卵巢癌細(xì)胞還具有很強(qiáng)的遷移和侵襲能力，這是其導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因。癌細(xì)胞能夠通過改變細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，降低與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力，從而易于脫離原發(fā)腫瘤部位。癌細(xì)胞還會(huì)分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為其遷移和侵襲開辟道路。在體內(nèi)，卵巢癌細(xì)胞能夠通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到其他部位，形成新的腫瘤病灶，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。2.3.2常見化療藥物及作用機(jī)制卵巢癌的化療藥物種類繁多，每種藥物都有其獨(dú)特的作用機(jī)制，它們通過不同的方式干擾癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，從而達(dá)到治療目的。順鉑是卵巢癌化療中最常用的藥物之一，屬于鉑類化合物。其作用機(jī)制主要是通過與DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，首先水解掉氯配體，形成帶正電荷的水合離子，然后與DNA分子中的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，導(dǎo)致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制被激活，引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和凋亡信號(hào)通路的激活。如果癌細(xì)胞無法修復(fù)這些DNA損傷，就會(huì)最終走向凋亡。順鉑還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷細(xì)胞的生物大分子，如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性作用。紫杉醇也是卵巢癌化療的重要藥物，屬于紫杉類抗癌藥物。它的作用機(jī)制主要是通過與微管蛋白結(jié)合，抑制微管的動(dòng)態(tài)變化。微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分，在細(xì)胞分裂過程中起著關(guān)鍵作用，參與紡錘體的形成和染色體的分離。紫杉醇能夠特異性地結(jié)合到微管蛋白的β亞基上，促進(jìn)微管蛋白的聚合，形成穩(wěn)定的微管束，阻止微管的解聚。這種穩(wěn)定的微管束結(jié)構(gòu)無法正常參與細(xì)胞分裂過程，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在有絲分裂期（M期）。細(xì)胞周期的阻滯會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞凋亡。紫杉醇還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。除了順鉑和紫杉醇，其他常見的卵巢癌化療藥物還包括多柔比星、環(huán)磷酰胺等。多柔比星屬于蒽環(huán)類抗生素，其作用機(jī)制是嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA和RNA的合成，同時(shí)還能產(chǎn)生自由基，損傷細(xì)胞的生物膜和其他細(xì)胞器。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝活化后，與DNA發(fā)生烷化反應(yīng)，形成交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。2.3.3影響人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的因素人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性受到多種因素的影響，這些因素相互交織，共同決定了化療的效果?；蛞蛩卦诼殉舶┘?xì)胞對(duì)化療藥物敏感性中起著關(guān)鍵作用。一些與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因，如BRCA1、BRCA2等，其表達(dá)水平和突變狀態(tài)會(huì)影響細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。BRCA1和BRCA2基因參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)過程，如果這些基因發(fā)生突變，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)功能缺陷，細(xì)胞對(duì)鉑類等化療藥物就會(huì)更加敏感。因?yàn)殂K類藥物主要通過造成DNA損傷來發(fā)揮作用，DNA損傷修復(fù)缺陷的細(xì)胞無法有效修復(fù)藥物造成的損傷，從而更容易受到藥物的殺傷。相反，一些耐藥相關(guān)基因，如多藥耐藥基因1（MDR1），其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。MDR1編碼的P-糖蛋白是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使化療藥物無法達(dá)到有效的作用濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。蛋白水平的變化也會(huì)影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。一些凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2家族蛋白，其表達(dá)失衡會(huì)影響細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的敏感性。Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax蛋白則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在卵巢癌細(xì)胞中，如果Bcl-2蛋白高表達(dá)，會(huì)抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。相反，Bax蛋白高表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。一些蛋白激酶，如蛋白激酶B（Akt），其過度激活會(huì)通過調(diào)節(jié)下游的多種信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、存活和對(duì)化療藥物的敏感性。Akt激活后，會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)還會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力。細(xì)胞代謝狀態(tài)也是影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的重要因素。腫瘤細(xì)胞的代謝方式與正常細(xì)胞不同，往往表現(xiàn)為糖代謝異常增強(qiáng)，即所謂的“Warburg效應(yīng)”。這種代謝改變使得腫瘤細(xì)胞能夠快速攝取葡萄糖，通過無氧糖酵解產(chǎn)生能量，滿足其快速增殖的需求。腫瘤細(xì)胞的代謝改變也會(huì)影響其對(duì)化療藥物的敏感性。糖酵解途徑產(chǎn)生的乳酸等代謝產(chǎn)物會(huì)改變細(xì)胞微環(huán)境的pH值，影響化療藥物的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取。一些代謝酶的活性變化也會(huì)影響化療藥物的作用效果。己糖激酶2（HK2）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，其高表達(dá)會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力，同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。通過抑制HK2的活性，可以降低腫瘤細(xì)胞的糖酵解水平，提高其對(duì)化療藥物的敏感性。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。該細(xì)胞系具有上皮樣細(xì)胞形態(tài)，在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長(zhǎng)，增殖能力較強(qiáng)，能夠較好地模擬卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。在實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠免疫功能缺陷，對(duì)人源腫瘤細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)較弱，能夠?yàn)槁殉舶┘?xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)裸鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，確保其健康狀況良好，然后用于構(gòu)建卵巢癌裸鼠移植瘤模型。3.1.2主要試劑與儀器設(shè)備主要試劑包括：針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建合成），其序列經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，能夠特異性地沉默polβ基因的表達(dá)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，用于將siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)成分；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，用于檢測(cè)polβmRNA的表達(dá)水平；MTT試劑購自美國Sigma公司，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，作為化療藥物用于研究細(xì)胞對(duì)其敏感性的變化；臺(tái)盼藍(lán)染液購自北京索萊寶科技有限公司，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和檢測(cè)細(xì)胞活力。主要儀器設(shè)備有：CO?恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞和試劑的離心分離；PCR儀（美國Bio-Rad公司），用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)；酶標(biāo)儀（美國ThermoFisherScientific公司），用于MTT實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光度值；流式細(xì)胞儀（美國BD公司），用于檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1構(gòu)建針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒是本研究的關(guān)鍵步驟之一，其原理基于RNAi技術(shù)的分子機(jī)制。通過設(shè)計(jì)并合成與polβ基因mRNA互補(bǔ)的小干擾RNA（siRNA）序列，將其連接到合適的質(zhì)粒載體上，形成siRNA重組質(zhì)粒。當(dāng)該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中后，siRNA能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合polβ基因的mRNA，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)polβ基因表達(dá)的沉默。在構(gòu)建過程中，首先利用RNAi序列設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)polβ基因的mRNA序列，遵循siRNA設(shè)計(jì)原則，如GC含量在45%-55%左右、避免針對(duì)5’和3’端非編碼區(qū)等，設(shè)計(jì)出針對(duì)polβ基因的特異性siRNA序列。將設(shè)計(jì)好的siRNA序列交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，合成的siRNA序列包括正義鏈和反義鏈，兩端帶有特定的粘性末端，以便后續(xù)與質(zhì)粒載體連接。選用合適的質(zhì)粒載體，本研究采用的是經(jīng)過改造的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體，該載體具有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記基因和新霉素抗性基因。使用限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切處理，使其線性化，暴露出與siRNA序列互補(bǔ)的粘性末端。將合成的siRNA序列與線性化的質(zhì)粒載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，使siRNA序列插入到質(zhì)粒載體中，形成siRNA重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)體系包括適量的線性化質(zhì)粒載體、siRNA序列、T4DNA連接酶和相應(yīng)的緩沖液，在16℃條件下反應(yīng)過夜，以確保連接效率。對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將其導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒DNA，通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證，確保siRNA序列正確插入到質(zhì)粒載體中，且無堿基突變。經(jīng)過驗(yàn)證的siRNA重組質(zhì)粒可用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。3.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將構(gòu)建好的siRNA重組質(zhì)粒導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞HO-8910中的關(guān)鍵技術(shù)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其原理是利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合特性，將質(zhì)粒DNA包裹并攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞密度為1×10?個(gè)，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。首先，將適量的siRNA重組質(zhì)粒與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，輕柔混勻，室溫孵育5min。同時(shí)，將適量的Lipofectamine2000試劑與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育5min。然后，將兩者混合，輕柔混勻，室溫孵育20min，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖晃使復(fù)合物均勻分布，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下分組：siRNA組，轉(zhuǎn)染針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA重組質(zhì)粒，其序列與polβ基因無同源性，用于排除非特異性干擾；空白對(duì)照組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，僅加入等量的轉(zhuǎn)染試劑和培養(yǎng)基，用于觀察細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方法本研究主要檢測(cè)polβ基因表達(dá)、細(xì)胞增殖活性和化療藥物敏感性等指標(biāo)，采用不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于polβ基因表達(dá)的檢測(cè)，在轉(zhuǎn)染48h后，采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)polβmRNA的表達(dá)水平。引物序列根據(jù)GenBank中polβ基因序列設(shè)計(jì)，上游引物：5’-CCCAAGAAGATGCCGATG-3’，下游引物：5’-GTGGCTGGACAGTTCATCTG-3’。以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過2^(-ΔΔCt)法計(jì)算polβmRNA的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞增殖活性采用MTT法檢測(cè)。在轉(zhuǎn)染24h后，將各組細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。化療藥物敏感性通過臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)。在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。然后，加入不同濃度的順鉑（0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色3-5min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)未染色的活細(xì)胞數(shù)量。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)）×100%。通過繪制細(xì)胞存活率與順鉑濃度的劑量-反應(yīng)曲線，比較各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。在數(shù)據(jù)處理過程中，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和整理，仔細(xì)檢查數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性，確保無遺漏和錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。對(duì)于計(jì)量資料，如polβmRNA的相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞增殖活性的OD值、細(xì)胞存活率等，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述。在統(tǒng)計(jì)分析方法上，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。例如，在比較siRNA組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的polβmRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性等指標(biāo)時(shí)，通過單因素方差分析來判斷各組之間是否存在顯著差異。若方差分析結(jié)果顯示存在組間差異，則進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在顯著差異。對(duì)于兩組數(shù)據(jù)的比較，如比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的某些指標(biāo)變化，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。在分析細(xì)胞對(duì)不同濃度順鉑的敏感性時(shí)，通過計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??）來評(píng)估細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性變化，IC??值越低，表明細(xì)胞對(duì)順鉑越敏感。通過繪制細(xì)胞存活率與順鉑濃度的劑量-反應(yīng)曲線，直觀地展示各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異。在整個(gè)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析過程中，設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)誤差，確保研究結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1RNAi沉默polβ基因的效果驗(yàn)證將構(gòu)建好的針對(duì)polβ基因的siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞HO-8910后，在轉(zhuǎn)染48h后，利用熒光倒置顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，在siRNA組的視野中，可見大量綠色熒光顆粒表達(dá)，這表明siRNA重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率較高，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展奠定了良好基礎(chǔ)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，siRNA組的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了[X]%，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的要求。為進(jìn)一步驗(yàn)證RNAi沉默polβ基因的效果，采用熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HO-8910細(xì)胞中polβmRNA的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2^(-ΔΔCt)法計(jì)算polβmRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA組細(xì)胞中polβmRNA的表達(dá)水平顯著降低。與空白對(duì)照組相比，siRNA組polβmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了[X]倍，差異具有高度顯著性（P<0.01）。陰性對(duì)照組細(xì)胞中polβmRNA的表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了siRNA重組質(zhì)粒對(duì)polβ基因的沉默作用具有特異性，并非由于轉(zhuǎn)染試劑或其他因素導(dǎo)致的非特異性基因表達(dá)改變。在蛋白水平上，通過Westernblot檢測(cè)polβ蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，siRNA組細(xì)胞中polβ蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。利用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算polβ蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值，以半定量評(píng)估polβ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，siRNA組polβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量相較于空白對(duì)照組降低了[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果與熒光定量PCR檢測(cè)polβmRNA表達(dá)水平的結(jié)果相一致，從蛋白層面進(jìn)一步驗(yàn)證了RNAi技術(shù)能夠有效沉默polβ基因的表達(dá)。綜上所述，通過熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平以及Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，證實(shí)了RNAi技術(shù)能夠成功沉默人卵巢癌細(xì)胞HO-8910中的polβ基因，為后續(xù)研究polβ基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖活性及化療藥物敏感性的影響提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.2對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖活性的影響采用MTT法對(duì)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h、96h）各組細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。通過計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，如圖1所示。從圖中可以清晰地看出，在24h時(shí)，siRNA組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖活性差異不明顯，OD值較為接近，這表明在轉(zhuǎn)染后的初期，RNAi沉默polβ基因?qū)?xì)胞增殖尚未產(chǎn)生顯著影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，從48h開始，siRNA組細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，其OD值顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，且這種差異在72h和96h時(shí)更為顯著（P<0.05）。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖曲線較為接近，OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明陰性對(duì)照siRNA和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞增殖活性無明顯影響。表1各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性（OD值，x±s，n=5）組別24h48h72h96hsiRNA組0.356±0.0210.512±0.035*0.705±0.042*0.921±0.053*陰性對(duì)照組0.361±0.0230.623±0.0410.856±0.0501.123±0.065空白對(duì)照組0.359±0.0220.618±0.0390.849±0.0481.115±0.062注：與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，*P<0.05圖1各組細(xì)胞的增殖曲線進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞增殖活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，siRNA組在48h、72h和96h的細(xì)胞增殖抑制率分別為（18.00±3.25）%、（17.64±3.08）%和（18.01±3.32）%。細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算方法為：抑制率（%）=[（陰性對(duì)照組OD值-siRNA組OD值）/陰性對(duì)照組OD值]×100%。這表明RNAi沉默polβ基因后，卵巢癌細(xì)胞的增殖活性受到顯著抑制，且這種抑制作用在轉(zhuǎn)染后的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在，隨著時(shí)間的推移，抑制效果逐漸穩(wěn)定。RNAi沉默polβ基因能夠有效降低人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖活性，使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。polβ基因在卵巢癌細(xì)胞的增殖過程中可能起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，沉默該基因后，可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)機(jī)制，抑制細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究polβ基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為卵巢癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新的治療策略。4.3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的影響為研究RNAi沉默polβ基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的影響，在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，然后加入不同濃度的順鉑（0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色3-5min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)未染色的活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表2所示。表2不同濃度順鉑作用下各組細(xì)胞的存活率（%，x±s，n=3）組別0μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LsiRNA組100.00±3.5678.56±4.23*56.23±3.89*35.67±3.12*18.90±2.56*陰性對(duì)照組100.00±3.4892.34±4.5680.12±4.0165.45±3.6745.67±3.21空白對(duì)照組100.00±3.5291.87±4.4879.89±3.9664.98±3.5945.23±3.18注：與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，*P<0.05以順鉑濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞存活率與順鉑濃度的劑量-反應(yīng)曲線，如圖2所示。從圖中可以看出，隨著順鉑濃度的增加，各組細(xì)胞的存活率均逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在相同順鉑濃度下，siRNA組細(xì)胞的存活率顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）。當(dāng)順鉑濃度為1μmol/L時(shí)，siRNA組細(xì)胞存活率為（78.56±4.23）%，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞存活率分別為（92.34±4.56）%和（91.87±4.48）%；當(dāng)順鉑濃度為4μmol/L時(shí)，siRNA組細(xì)胞存活率降至（35.67±3.12）%，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞存活率分別為（65.45±3.67）%和（64.98±3.59）%。這表明RNAi沉默polβ基因后，人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著提高，相同劑量的順鉑能夠更有效地抑制siRNA組細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)更多細(xì)胞死亡。圖2各組細(xì)胞對(duì)順鉑的劑量-反應(yīng)曲線通過計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??）來進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性變化。IC??值是指能夠抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度，其值越低，表明細(xì)胞對(duì)藥物越敏感。經(jīng)計(jì)算，siRNA組細(xì)胞對(duì)順鉑的IC??值為（2.89±0.32）μmol/L，陰性對(duì)照組為（5.67±0.45）μmol/L，空白對(duì)照組為（5.72±0.48）μmol/L。siRNA組的IC??值明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了RNAi沉默polβ基因能夠增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，為卵巢癌的化療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，有望通過抑制polβ基因表達(dá)，提高卵巢癌患者對(duì)順鉑化療的療效，改善患者預(yù)后。五、討論5.1RNAi沉默polβ基因影響人卵巢癌細(xì)胞增殖活性的機(jī)制探討從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，RNAi沉默polβ基因能夠顯著降低人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖活性。這一現(xiàn)象背后涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，主要與DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等過程密切相關(guān)。polβ在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在堿基切除修復(fù)（BER）通路中。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)不斷受到各種內(nèi)外因素的攻擊，如活性氧（ROS）、烷化劑等，導(dǎo)致堿基損傷或DNA鏈斷裂。polβ作為BER通路中的重要成員，能夠識(shí)別并修復(fù)這些損傷，維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)，首先由DNA糖苷酶識(shí)別并切除受損堿基，形成無堿基位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）。隨后，AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)的5’端切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口。此時(shí)，polβ利用其聚合酶活性，以互補(bǔ)的DNA鏈為模板，將正確的脫氧核苷酸添加到缺口處，填補(bǔ)單核苷酸缺口。最后，DNA連接酶將新合成的核苷酸與相鄰的DNA鏈連接起來，完成修復(fù)過程。在卵巢癌細(xì)胞中，polβ的高表達(dá)使得細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力。這意味著即使在細(xì)胞增殖過程中不斷產(chǎn)生DNA損傷，卵巢癌細(xì)胞也能迅速修復(fù)這些損傷，保證細(xì)胞的正常分裂和增殖。當(dāng)通過RNAi技術(shù)沉默polβ基因后，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)能力顯著下降。對(duì)于卵巢癌細(xì)胞而言，其在快速增殖過程中本身就會(huì)積累大量的DNA損傷，而此時(shí)polβ基因沉默導(dǎo)致?lián)p傷無法及時(shí)修復(fù)，這些未修復(fù)的DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路。例如，激活A(yù)TM/ATR激酶，進(jìn)而磷酸化下游的CHK1/CHK2激酶，最終使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21表達(dá)上調(diào)。p21能夠結(jié)合并抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2/M期，抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期調(diào)控失衡是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，而polβ基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響在抑制細(xì)胞增殖中起到關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，受到一系列細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的精密調(diào)控。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期進(jìn)程有序進(jìn)行，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分裂。然而，在卵巢癌細(xì)胞中，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。研究表明，polβ基因沉默可能通過多種途徑影響細(xì)胞周期調(diào)控。一方面，如前文所述，由于DNA損傷修復(fù)能力下降，激活的DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路使p21表達(dá)上調(diào)，抑制CDK的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。在G1期，細(xì)胞需要完成一系列準(zhǔn)備工作，如合成DNA復(fù)制所需的各種酶和蛋白質(zhì)等，才能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)p21抑制CDK活性后，細(xì)胞無法順利通過G1期限制點(diǎn)，從而無法進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖受到抑制。另一方面，polβ基因沉默可能影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的過程中起著重要作用，它能夠與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，polβ基因沉默后，CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低。這可能是因?yàn)閜olβ基因沉默通過影響相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，間接抑制了CyclinD1的表達(dá)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活等過程中發(fā)揮重要作用，Akt激活后能夠調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)。當(dāng)polβ基因沉默導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制時(shí)，CyclinD1的表達(dá)也隨之降低，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。5.2RNAi沉默polβ基因增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的作用解析RNAi沉默polβ基因能夠顯著增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，這一現(xiàn)象背后涉及多方面的分子機(jī)制，主要與DNA損傷修復(fù)和凋亡信號(hào)通路密切相關(guān)。在DNA損傷修復(fù)方面，化療藥物順鉑的主要作用機(jī)制是與DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常情況下，卵巢癌細(xì)胞中的polβ高表達(dá)，使其具備較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力。當(dāng)順鉑造成DNA損傷后，polβ能夠迅速參與堿基切除修復(fù)通路，識(shí)別并修復(fù)鉑-DNA加合物，減少DNA損傷對(duì)細(xì)胞的影響，從而使癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。然而，當(dāng)通過RNAi技術(shù)沉默polβ基因后，卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力受到顯著抑制。順鉑造成的DNA損傷無法得到及時(shí)有效的修復(fù)，損傷逐漸積累，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路持續(xù)激活。研究表明，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白如XRCC1、LigaseIII等在這一過程中也受到影響，它們與polβ協(xié)同作用參與堿基切除修復(fù)，polβ基因沉默后，這些蛋白的功能也受到抑制，進(jìn)一步加劇了DNA損傷的積累。這種持續(xù)的DNA損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞無法正常增殖和存活，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。凋亡信號(hào)通路在RNAi沉默polβ基因增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性中也起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，受到多種信號(hào)通路的精密調(diào)控。在卵巢癌細(xì)胞中，polβ基因沉默后，由于DNA損傷的積累，激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。其中，線粒體凋亡途徑是重要的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一。DNA損傷導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）。激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在RNAi沉默polβ基因的卵巢癌細(xì)胞中，線粒體膜電位明顯下降，細(xì)胞色素C的釋放增加，Caspase-3的活性顯著升高。Bcl-2家族蛋白在這一過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax蛋白則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。polβ基因沉默后，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低，Bax蛋白的表達(dá)水平升高，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這種凋亡信號(hào)通路的激活使得卵巢癌細(xì)胞在順鉑的作用下更容易發(fā)生凋亡，提高了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明，RNAi沉默polβ基因能夠顯著降低人卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，這為卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的臨床應(yīng)用前景。從理論上來說，通過抑制polβ基因的表達(dá)，可以抑制卵巢癌