第1節(jié)基因工程的基本操作程序第三章基因工程DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)PCR利用了

原理，通過調(diào)節(jié)

來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。(2)PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了

的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)。DNA的熱變性溫度DNA半保留復(fù)制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高溫變性中溫低溫復(fù)性延伸1次循環(huán)（一）DNA體外擴(kuò)增：探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具(1)用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）PCR儀微量離心管推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭）探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具(2)材料①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。②PCR反應(yīng)體系的配方(見教材)。10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL為保證加入反應(yīng)體系中的各試劑體積的準(zhǔn)確性，建議按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即先加入無菌水。為保護(hù)酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟(1)DNA片段的擴(kuò)增用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）。使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定[思考]1.為什么最后1次變性時(shí)間延長？TaqDNA聚合酶活性會(huì)隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降。在每一輪循環(huán)中，部分片段可能沒有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了。最后1次變性時(shí)間延長，讓這些DNA打開，重新延伸。2.PCR的產(chǎn)物是什么？3.如何鑒定PCR的產(chǎn)物？DNA片段瓊脂糖凝膠電泳探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（二）DNA片段電泳鑒定：1.實(shí)驗(yàn)原理（1）電泳：DNA分子具有_______________，在一定的________下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳?？山怆x的基團(tuán)pH相反一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶

，在電場(chǎng)中DNA便向

泳動(dòng)。負(fù)電荷正極磷酸電離形成的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電樣品點(diǎn)樣孔應(yīng)靠近

極。負(fù)探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（2）鑒定方法：PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。瓊脂糖來源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，瓊脂糖在水中一般加熱到90℃以上溶解，溫度下降到35-40℃時(shí)形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（孔徑），孔徑大小與瓊脂糖凝膠濃度有關(guān)，濃度越高，孔徑越

，能夠通過的核酸分子越

。瓊脂糖凝膠電泳在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________、_________________和______等有關(guān)凝膠的濃度DNA分子的大小構(gòu)象小小探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA分子大?。↘b）遷移速率0.61～20慢快0.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3瓊脂糖凝膠濃度越大，分離的DNA分子越小，遷移速率越快探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定核酸染色劑常用的核酸染色劑有EB（溴化乙錠）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的堿基對(duì)之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。1.實(shí)驗(yàn)原理探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）DNAMarker是

的片段，在實(shí)驗(yàn)時(shí)和樣本DNA同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳，通過對(duì)比兩者的遷移速率，可以大致估計(jì)

。樣本DNA的大小已知的DNA分子大小探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具瓊脂糖凝膠電泳裝置探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。①熔化：②倒模:③凝固:探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（marker）。接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待

前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳①加液②加樣③電泳指示劑①有顏色，使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣。②分子量較小，指示樣品遷移的速率及方向。探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳取出凝膠置于

下觀察和照相。紫外燈探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.方法步驟注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（1）.如圖所示，該片段大小約為

。

750bp0次12次12次30次30次Marker

根據(jù)條帶的

及

來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果（2）.判斷成功擴(kuò)增出DNA片段的依據(jù)是什么？分布粗細(xì)程度估計(jì)DNA的大小估計(jì)DNA的數(shù)量探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（3）.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因？未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶可能的原因有：①引物出現(xiàn)質(zhì)量問題；②變性時(shí)溫度

，變性時(shí)間

，模板DNA鏈未打開。③Taq酶失活；④Mg2+濃度過

。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶可能的原因有：①引物特異性不強(qiáng)或容易聚合成二聚體②復(fù)性時(shí)的溫度過低，引物隨機(jī)連接到非目的基因片段③DNA聚合酶的濃度過高，即使引物與模板的結(jié)合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反應(yīng)，生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。④Mg2+濃度過高⑤模板DNA出現(xiàn)污染低低短一條條帶（目的基因片段）及時(shí)訓(xùn)練1.用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號(hào)的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾B3號(hào)PCR結(jié)果包含250~500bp片段，應(yīng)包含目的基因9號(hào)PCR結(jié)果不包含250~50bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株及時(shí)訓(xùn)練2.如圖是從酵母菌細(xì)胞中獲取某植物需要的某種酶基因的流程。結(jié)合所學(xué)知識(shí)及相關(guān)信息回答下列問題：(1)圖中B過程是________。(2)為在短時(shí)間內(nèi)大量獲得目的基因，可用________擴(kuò)增的方法，其原理是___________________。(3)獲取目的基因之后，需要進(jìn)行___