項目二微生物發(fā)酵制藥工藝2.1概述2.2制藥微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系2.3制藥微生物菌種建立2.4制藥微生物培養(yǎng)基制備2.5滅菌工藝制藥工藝的滅菌滅菌：指用化學(xué)或物理的措施殺滅或清除物料及設(shè)備、空間中所有生物的技術(shù)或工藝過程。發(fā)酵和細(xì)胞車間：無菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基和空氣無菌制劑車間：無菌潔凈空間，設(shè)備無菌，原料無菌；制藥用水：無菌純凈水有關(guān)工藝：需要驗證滅菌措施與原理培養(yǎng)基滅菌工藝空氣除菌工藝2.5滅菌工藝幾種概念雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，到達(dá)無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，到達(dá)無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。發(fā)酵制藥滅菌工藝1、化學(xué)滅菌2、物理滅菌2.5.1滅菌措施與原理發(fā)酵制藥滅菌工藝1、化學(xué)滅菌用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。化學(xué)滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。機(jī)理：與微生物細(xì)胞中的成分反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。應(yīng)用：皮膚表面、器具、試驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。發(fā)酵制藥滅菌工藝常用的化學(xué)滅菌劑藥劑殺菌原理使用濃度高錳酸鉀使蛋白質(zhì)、氨基酸氧化0.1～3％漂白粉在水溶液中分解為新生態(tài)氧和氯。1～5%酒精溶液使細(xì)胞脫水，蛋白質(zhì)凝固變性。75％新潔而滅以陽離子形式與菌體表面結(jié)合，引起菌體外膜損傷和蛋白質(zhì)變性。0.25％甲醛強(qiáng)還原劑，與氨基結(jié)合。37％過氧乙酸強(qiáng)氧化劑，廣譜、高效、速效。戊二酸在堿性條件下具有殺死芽胞的能力2％酚類石炭酸（來蘇爾）1～5％2、物理滅菌多種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進(jìn)行滅菌輻射滅菌：高能量電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致菌體死亡。局部空間和器皿表面滅菌干熱滅菌：高溫(140-180℃1-2h或灼燒)氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮等作用致死微生物。試驗室器皿蒸汽滅菌：高溫和蒸汽的穿透力，培養(yǎng)基滅菌過濾滅菌：物理截留微生物，無菌空氣制備。發(fā)酵制藥滅菌工藝2.5.2培養(yǎng)基滅菌（1）微生物高溫死亡動力學(xué)與滅菌的關(guān)系微生物受熱死亡過程的一級動力學(xué)反應(yīng)：－dX/dt=kdX微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。發(fā)酵制藥滅菌工藝1、滅菌設(shè)計kd與微生物種類、生理狀態(tài)、滅菌溫度有關(guān)一般：殺死芽孢的溫度和時間為指標(biāo)，X＝0.001。保證徹底滅菌，實際操作中增長50％的保險系數(shù)。滅菌時間與比死亡速率之間的關(guān)系發(fā)酵制藥滅菌工藝（2）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞動力學(xué)與微生物死亡過程類似，營養(yǎng)物降解符合一級動力學(xué)：C——營養(yǎng)物濃度t——反應(yīng)時間kc——降解常數(shù)阿倫尼烏斯方程kc與T溫度的關(guān)系A(chǔ)—比例常數(shù)；E—降解活化能R－氣體常數(shù)T—絕對溫度發(fā)酵制藥滅菌工藝（3）滅菌溫度選擇原則試驗測定：滅菌的活化能不小于營養(yǎng)成分破壞的活化能每升高2℃，速率常數(shù)的增長倍數(shù)為Q2：一般化學(xué)反應(yīng)Q2為1.5～2.0；(營養(yǎng)成分降解)殺滅芽胞的反應(yīng)Q2為5～2；（滅菌）殺滅微生物細(xì)胞的反應(yīng)Q2為35左右。（滅菌）在熱滅菌的過程中：同步發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基成分破壞兩個過程。滅菌溫度選擇原則：到達(dá)滅菌規(guī)定的溫度，但營養(yǎng)成分不被破壞的溫度發(fā)酵制藥滅菌工藝（4）影響培養(yǎng)基滅菌的原因微生物種類：不一樣的微生物k值不一樣。初始菌濃度：滅菌時間與初始菌濃度的對數(shù)成正比。滅菌時間和溫度：溫度越高，時間越短培養(yǎng)基成分：油脂、蛋白質(zhì)增長微生物的耐熱性；固體顆粒影響熱穿透。傳熱與混合狀況：泡沫影響受熱均勻度。蒸汽中空氣：減少蒸汽分壓和滅菌溫度。pH：酸性pH下可加緊微生物熱死速率。發(fā)酵制藥滅菌工藝高固形物含量，滅菌溫度高環(huán)境耐熱性大腸桿菌水60～65℃2％糖液70℃，4～6min30％糖液70℃，30min發(fā)酵制藥滅菌工藝pH的影響溫度/℃孢子數(shù)/（個/ml）滅菌時間/minpH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120200087533115200025251213131220007065353024202000740720180150150發(fā)酵制藥滅菌工藝（5）滅菌高溫對培養(yǎng)基質(zhì)量的影響破壞營養(yǎng)：成分降解，褐變，有毒害物質(zhì)形成沉淀物：多肽類沉淀，磷酸鹽和碳酸鹽變化pH：一般減少，酸化發(fā)酵制藥滅菌工藝減少高溫有害的措施采用持續(xù)滅菌措施分別滅菌：含Ca或Fe的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，不易形成磷酸鹽沉淀高溫破壞的糖培養(yǎng)基：低壓滅菌。高溫破壞維生素等：過濾滅菌發(fā)酵制藥滅菌工藝2、分批滅菌操作方式間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，到達(dá)滅菌規(guī)定的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵規(guī)定的溫度，使培養(yǎng)基和設(shè)備同步滅菌。特點：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，手動。缺陷：加熱和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐運用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。發(fā)酵制藥滅菌工藝分批操作的滅菌過程－溫度時間變化加熱升溫：維持滅菌溫度：15－30min，121℃；0.09－0.2MPa冷卻降溫：

每段對滅菌的奉獻(xiàn)于取決時間長短。發(fā)酵制藥滅菌工藝分批滅菌的操作過程預(yù)熱：空氣、夾套通蒸汽。加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)整進(jìn)汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。發(fā)酵制藥滅菌工藝四路出汽：排氣、接種、進(jìn)料和消沫劑管排氣三路進(jìn)汽：空氣、取樣和出料口（1）高溫短時滅菌操作，連消：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過一套滅菌設(shè)備持續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不一樣的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。3、持續(xù)滅菌操作發(fā)酵制藥滅菌工藝（2）持續(xù)滅菌操作－流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽在連銷塔直接混勻，在20～30s到達(dá)滅菌溫度（130-140℃），由維持罐保持必需的殺菌時間，噴淋式冷卻。加熱器：噴射式和塔式保溫設(shè)備：罐式和管式冷卻器：噴淋式、板式、真空冷卻發(fā)酵制藥滅菌工藝蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)蒸汽直接噴入生培養(yǎng)液，溫度幾乎立即上升到預(yù)定殺菌溫度，由保溫段管長度來保證必要的殺菌時間。發(fā)酵制藥滅菌工藝持續(xù)板式換熱器構(gòu)成的滅菌系統(tǒng)工藝流程圖在20s內(nèi)達(dá)殺菌溫度，經(jīng)保溫后，再板式熱互換器另一段20s內(nèi)冷卻到發(fā)酵溫度。發(fā)酵制藥滅菌工藝（3）持續(xù)滅菌－操作過程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，迅速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基通過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。發(fā)酵制藥滅菌工藝持續(xù)滅菌的特點1）高溫迅速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少；2）熱能運用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增長了持續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增長染菌幾率。5）對壓力規(guī)定高，一般為0.45-0.8MPa。發(fā)酵制藥滅菌工藝滅菌操作舉例1滅菌鍋內(nèi)滅菌固體培養(yǎng)基滅菌蒸汽壓力0.098MPa，維持20～30min；液體培養(yǎng)基滅菌蒸汽壓力0.098MPa，維持15～20min；玻璃器皿及用品滅菌，壓力0.098MPa，30～60min。手提式臥式立式立式發(fā)酵制藥滅菌工藝滅菌操作舉例2種子罐、發(fā)酵罐、計量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌從有關(guān)管道通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa，維持45min；滅菌過程從閥門、邊閥排出空氣，并使蒸汽通過到達(dá)死角滅菌；滅菌完畢，關(guān)閉蒸汽，待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時，通入無菌空氣保持罐壓0.098MPa。發(fā)酵制藥滅菌工藝滅菌操作舉例3種子培養(yǎng)基實罐滅菌發(fā)酵制藥滅菌工藝從夾層通入蒸汽間接加熱至80℃再從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、接種管進(jìn)蒸汽，直接加熱關(guān)閉夾層蒸汽進(jìn)口閥門，升溫121℃，維持30min。谷氨酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)基實罐滅菌為12℃，維持2min。滅菌操作舉例4發(fā)酵培養(yǎng)基實罐滅菌夾層或盤管進(jìn)蒸汽，間接加熱90℃，關(guān)夾層蒸汽取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管三路進(jìn)蒸汽，直接加熱至121℃，維持30min。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基具有生物素等生長因子，實罐滅菌25℃，維持15min。發(fā)酵制藥滅菌工藝滅菌操作舉例5發(fā)酵培養(yǎng)基持續(xù)滅菌一般培養(yǎng)基為130℃，維持5min。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為115℃，6~8min。發(fā)酵制藥滅菌工藝2.5.3空氣除菌操作工藝好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。持續(xù)一定流量的壓縮無灰、無油、無水、無雜質(zhì)的無菌空氣?？諝饬髁浚阂话?.1-2.0。壓強(qiáng)：0.2-0.4MPa。空氣質(zhì)量：相對濕度不不小于70％；比培養(yǎng)溫度高2－30℃；潔凈度20級，或失敗率2－3。1、發(fā)酵對空氣的規(guī)定發(fā)酵制藥滅菌工藝2、工業(yè)制備大量空氣的措施加熱滅菌：運用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量（達(dá)200℃）除菌，無菌化程度不高的發(fā)酵過程。靜電除菌：通過高壓電流場，帶電粒子被吸附。介質(zhì)過濾：捕集粒子及多種微生物。發(fā)酵工業(yè)采用可靠，經(jīng)濟(jì)，以便。發(fā)酵制藥滅菌工藝3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。空氣運動通過深層過濾介質(zhì)時：離心場作用：顆粒及其微生物沉降直接被截留：顆粒慣性碰撞，互相集聚成大顆粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：微生物微粒帶不一樣的電荷，與異性電荷吸引而沉降，有一定作用。發(fā)酵制藥滅菌工藝4、空氣過濾介質(zhì)膜過濾介質(zhì)：孔徑不不小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。孔徑0.1-0.5um深層過濾介質(zhì)：空隙不小于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(16-20um直徑，空隙20－50um)、玻璃纖維（18－19um）、活性炭過濾紙：超細(xì)玻璃纖維紙(直徑1-1.5um)金屬燒結(jié)管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾管安裝在過濾器內(nèi)。發(fā)酵制藥滅菌工藝粗過濾壓縮機(jī)儲罐冷卻器絲網(wǎng)分離器過濾器5、空氣滅菌工藝過程I:空氣預(yù)處理II：除去空氣中油和水III：空氣過濾旋風(fēng)分離器加熱器發(fā)酵制藥滅菌工藝（I）空氣預(yù)處理目的：提高空氣的潔凈度措施：(1)高空取氣，提高空氣吸入口位置，采風(fēng)塔高，設(shè)計流速8m/s。每升2m，空氣雜菌降一種數(shù)量級。(2)加強(qiáng)過濾，空壓機(jī)吸入口前安裝粗過濾器。流速0.1-0.5m/s。發(fā)酵制藥滅菌工藝空氣壓縮機(jī)與空氣儲罐空氣壓縮機(jī)：提供空氣流動的動力。往復(fù)式、螺桿式、渦輪式空壓機(jī)。

空氣儲罐：消除壓縮空氣的脈動，用于往復(fù)式空壓機(jī)。設(shè)置在空壓站附近。發(fā)酵制藥滅菌工藝空氣冷卻器作用：降溫，除潮。壓縮機(jī)出口空氣120－150℃，需要冷卻至20－25℃。分級冷卻，兩級串聯(lián)使用。第一級：循環(huán)水（30℃）冷卻，至40－50℃第二級：低溫水（9℃）或地下水（15－18℃）冷卻，至20－25。設(shè)置在發(fā)酵車間外。發(fā)酵制藥滅菌工藝（II）除油除水－氣液分離設(shè)備除去空氣中油和水：冷卻空氣濕度20％，形成油滴和水滴。旋風(fēng)分離器：空氣速度15－25m/s。完全除去20um以上離子，對2um離子的分離效率為60－70％。絲網(wǎng)除沫器：1um以上霧滴除去率98％發(fā)酵制藥滅菌工藝（II）除油除水－空氣加熱設(shè)備溫度下降形成水滴：加熱空氣，30－35℃，減少相對濕度（從20％到70％如下），才能進(jìn)入空氣過濾器。列管式換熱器：空氣走管程，蒸汽走殼程。套夾式加熱器：空氣走管程，蒸汽走夾套。發(fā)酵制藥滅菌工藝（III）無菌空氣—空氣過濾器