RNA干擾survivin基因：解鎖HepG2細(xì)胞凋亡與化療敏感性提升的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，在我國(guó)的發(fā)病率與死亡率長(zhǎng)期居高不下，形勢(shì)極為嚴(yán)峻。根據(jù)相關(guān)權(quán)威統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年肝癌新發(fā)病例數(shù)眾多，約占全球新發(fā)病例的一半以上，且死亡率也相當(dāng)高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。并且肝癌具有高度異質(zhì)性，對(duì)化療、放療等傳統(tǒng)治療方法的敏感性較低，導(dǎo)致治療效果往往不盡人意，患者的5年生存率極低，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。因此，深入探尋肝癌的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)更為有效的治療策略，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待攻克的關(guān)鍵難題，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。細(xì)胞凋亡，作為一種由基因嚴(yán)格調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等諸多生理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。一旦細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡被打破，就可能引發(fā)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)紊亂，這為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。Survivin基因，作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員，其表達(dá)產(chǎn)物Survivin蛋白在抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期以及促進(jìn)腫瘤血管生成等方面扮演著關(guān)鍵角色。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，這種特異性的表達(dá)差異使得Survivin基因成為肝癌治療的理想靶點(diǎn)。通過(guò)抑制Survivin基因的表達(dá)，有望恢復(fù)肝癌細(xì)胞正常的凋亡機(jī)制，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡的目的。RNA干擾（RNAi）技術(shù)，作為一種新興的基因沉默技術(shù)，能夠通過(guò)引入與靶基因互補(bǔ)的雙鏈RNA（dsRNA），特異性地降解靶基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的高效抑制。該技術(shù)具有高度的特異性、高效性以及操作相對(duì)簡(jiǎn)便等顯著優(yōu)勢(shì)，為肝癌的基因治療開(kāi)辟了嶄新的途徑。將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于抑制Survivin基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，不僅可以深入探究Survivin基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制，還為肝癌的治療提供了一種極具潛力的新方法。本研究聚焦于利用RNA干擾技術(shù)抑制Survivin基因在人肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，旨在深入探討其對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡以及化療敏感性的影響。通過(guò)本研究，期望能夠進(jìn)一步揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制，為肝癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略，為改善肝癌患者的預(yù)后帶來(lái)新的希望。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌的研究領(lǐng)域中，細(xì)胞凋亡機(jī)制以及相關(guān)基因靶點(diǎn)的探索一直是熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞RNA干擾survivin基因?qū)epG2細(xì)胞凋亡及化療影響展開(kāi)了深入研究。國(guó)外方面，早期研究明確了Survivin基因在多種腫瘤組織中高表達(dá)的特性，尤其在肝癌細(xì)胞系如HepG2中，其高表達(dá)與細(xì)胞凋亡抑制緊密相關(guān)。有研究通過(guò)將針對(duì)Survivin基因的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低Survivin基因的mRNA水平，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這初步揭示了RNA干擾技術(shù)作用于Survivin基因在肝癌治療中的潛在價(jià)值。后續(xù)研究進(jìn)一步深入探究其對(duì)化療敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)干擾Survivin基因表達(dá)后，HepG2細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的敏感性有所提高，為聯(lián)合治療提供了新思路。國(guó)內(nèi)研究同樣成果豐碩。眾多團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建針對(duì)Survivin基因靶序列的短發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究。研究結(jié)果一致表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升，且對(duì)順鉑等化療藥物的敏感性顯著增強(qiáng)。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還從分子機(jī)制層面深入挖掘，發(fā)現(xiàn)Survivin基因被干擾后，會(huì)影響下游一系列與凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步闡釋了其作用的內(nèi)在機(jī)制。盡管目前國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處。首先，RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用面臨著傳遞效率和穩(wěn)定性的挑戰(zhàn)。如何高效、穩(wěn)定地將干擾序列遞送至細(xì)胞內(nèi)，并且確保其在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用，仍然是亟待解決的問(wèn)題。其次，雖然已明確RNA干擾Survivin基因可增強(qiáng)化療敏感性，但對(duì)于聯(lián)合治療的最佳方案，包括藥物種類、劑量、用藥時(shí)間等方面，尚未達(dá)成共識(shí)，缺乏系統(tǒng)性、標(biāo)準(zhǔn)化的研究。再者，現(xiàn)有的研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究相對(duì)較少，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過(guò)程還需要更多的探索和驗(yàn)證。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制Survivin基因在人肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，深入探究其對(duì)細(xì)胞凋亡以及化療敏感性的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的作用機(jī)制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。在研究?jī)?nèi)容方面，本研究首先根據(jù)GenBank中公布的Survivin基因序列，嚴(yán)格遵循RNA干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，精心設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Survivin基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。隨后，將該序列成功克隆至真核表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組表達(dá)載體pshRNA-survivin。通過(guò)一系列的鑒定方法，如酶切鑒定、測(cè)序分析等，確保重組表達(dá)載體的準(zhǔn)確性和正確性。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pshRNA-survivin，利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，導(dǎo)入人肝癌HepG2細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理的HepG2細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞），以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精準(zhǔn)檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin基因mRNA的表達(dá)水平，以確定RNA干擾對(duì)Survivin基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平，從蛋白質(zhì)層面進(jìn)一步驗(yàn)證RNA干擾的效果。利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行精確檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，分析RNA干擾Survivin基因表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下清晰觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞核的濃縮、碎裂等，為細(xì)胞凋亡的檢測(cè)提供直觀的形態(tài)學(xué)證據(jù)。將干擾Survivin基因表達(dá)后的HepG2細(xì)胞，分別與臨床常用的化療藥物（如順鉑、阿霉素等）共同孵育。運(yùn)用MTT法，在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h等）檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，準(zhǔn)確計(jì)算細(xì)胞抑制率，以此評(píng)估細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性變化。采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況，分析RNA干擾Survivin基因表達(dá)聯(lián)合化療藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。在分子機(jī)制研究方面，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Caspase-3、Bcl-2、Bax等）的表達(dá)水平變化，深入探究RNA干擾Survivin基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)化療敏感性的分子信號(hào)通路。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，直觀觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，為分子機(jī)制的研究提供更豐富的信息。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實(shí)驗(yàn)研究法，具體技術(shù)路線如下：首先，根據(jù)GenBank中公布的Survivin基因序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)及RNA干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)Survivin基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。隨后，將設(shè)計(jì)好的shRNA序列進(jìn)行合成，并克隆至真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pshRNA-survivin。運(yùn)用限制性內(nèi)切酶對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶位置及大小，以判斷插入片段是否正確。并將重組表達(dá)載體送至專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)得序列與目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)，確保重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。復(fù)蘇并培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，使用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pshRNA-survivin導(dǎo)入HepG2細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理的HepG2細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞），每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)指標(biāo)及方法方面，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin基因mRNA的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，加入特異性引物和熒光定量PCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)分析Ct值，計(jì)算Survivin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入Survivin蛋白特異性抗體及相應(yīng)二抗，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色后，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，得出Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育一段時(shí)間后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)分析凋亡細(xì)胞的百分比，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。利用Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行處理，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，滴加Hoechst33342染色液染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，記錄凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征。將干擾Survivin基因表達(dá)后的HepG2細(xì)胞，分別與臨床常用化療藥物（如順鉑、阿霉素等）共同孵育。運(yùn)用MTT法，在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h等）檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。將細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同濃度化療藥物及干擾處理后的細(xì)胞，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育，然后加入DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入70%冷乙醇固定，再用PI染色液染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞比例。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Caspase-3、Bcl-2、Bax等）的表達(dá)水平變化。按照上述Westernblot方法進(jìn)行操作，使用相應(yīng)抗體檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量，探究其在RNA干擾Survivin基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)化療敏感性中的作用機(jī)制。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化。將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，固定、通透、封閉后，加入相應(yīng)蛋白的一抗和熒光標(biāo)記二抗，避光孵育，最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1HepG2細(xì)胞概述HepG2細(xì)胞作為肝癌研究領(lǐng)域中極具代表性的細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，為肝癌相關(guān)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。它最初?975年從一名15歲白人男性肝母細(xì)胞瘤（原誤診為肝細(xì)胞癌）患者的腫瘤組織中成功分離建立。在形態(tài)學(xué)方面，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，在體外培養(yǎng)條件下，它們以貼壁的方式生長(zhǎng)，緊密連接成片，形成小島狀的增殖結(jié)構(gòu)，這種生長(zhǎng)形態(tài)使其在培養(yǎng)過(guò)程中易于觀察和識(shí)別。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，HepG2細(xì)胞具有較高的增殖率，在合適的培養(yǎng)條件下，能夠快速生長(zhǎng)和分裂。其倍增時(shí)間約為48-72小時(shí)，這一特性使得研究人員能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在培養(yǎng)過(guò)程中，HepG2細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)環(huán)境較為敏感。它通常需要使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液的pH值要求也較為嚴(yán)格，需維持在7.2-7.4之間，以保障細(xì)胞的正常貼壁和生長(zhǎng)。血清質(zhì)量的波動(dòng)也可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，若血清質(zhì)量不佳，可能導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難、生長(zhǎng)緩慢甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。當(dāng)遇到細(xì)胞貼壁困難的問(wèn)題時(shí)，可臨時(shí)將血清濃度提升至15%-20%，以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。HepG2細(xì)胞在代謝功能方面具有一定的特點(diǎn)。它表達(dá)多種肝特異性蛋白和受體，如甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、α-2-巨球蛋白、胰島素受體和IGFⅡ的受體等，這些蛋白和受體的表達(dá)反映了其具有一定的肝臟細(xì)胞功能。它還具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性，參與膽固醇和甘油三酯的代謝過(guò)程。然而，與原代肝細(xì)胞相比，HepG2細(xì)胞的某些代謝功能存在一定的局限性。例如，其細(xì)胞色素P450（CYP）等藥物代謝酶的表達(dá)顯著低于原代肝細(xì)胞，其中CYP3A4在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)僅為肝細(xì)胞的1/100-1/400，這可能會(huì)影響其對(duì)某些藥物的代謝能力，在藥物代謝研究中需要加以考慮。在肝癌研究領(lǐng)域，HepG2細(xì)胞發(fā)揮著舉足輕重的作用。在藥物開(kāi)發(fā)與毒性評(píng)估方面，它被廣泛應(yīng)用于藥物肝毒性測(cè)試，通過(guò)檢測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝等方面的影響，評(píng)估藥物的潛在肝毒性。研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物處理HepG2細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，提示該藥物可能具有肝毒性。HepG2細(xì)胞也用于研究藥物的抗腫瘤機(jī)制，如利拉魯肽可通過(guò)激活JNK通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，其IC50約為100nM，這為開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了重要的理論依據(jù)。在腫瘤生物學(xué)機(jī)制解析方面，HepG2細(xì)胞同樣是重要的研究工具。研究表明，靶向PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能夠有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，揭示了該信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的關(guān)鍵作用。敲除PRDX6基因可觸發(fā)HepG2細(xì)胞線粒體功能障礙與G2/M期阻滯，進(jìn)一步深入探究了基因調(diào)控與肝癌細(xì)胞周期及線粒體功能之間的關(guān)系。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，HepG2細(xì)胞在基因編輯與疾病模型構(gòu)建方面也取得了重要進(jìn)展。通過(guò)優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)與轉(zhuǎn)染條件，利用CRISPR技術(shù)對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行基因敲除，其效率可達(dá)80%以上，為研究特定基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的手段。構(gòu)建三維球形培養(yǎng)體系的HepG2類器官，可提升細(xì)胞的代謝活性，使其更接近體內(nèi)肝細(xì)胞的生理狀態(tài)，為肝癌的研究提供了更具生理相關(guān)性的模型。將HepG2細(xì)胞移植到裸鼠皮下，可成功構(gòu)建CDX模型，成瘤率達(dá)100%，適用于藥物體內(nèi)外一致性驗(yàn)證，加速了肝癌藥物從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。2.2survivin基因Survivin基因，作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族的關(guān)鍵成員，自1997年被Ambrosini等學(xué)者利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1（EPR-1）cDNA在人類基因組文庫(kù)中成功篩選克隆以來(lái)，受到了廣泛而深入的研究。該基因定位于染色體17q25，其全長(zhǎng)14.7kb，結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。由Survivin基因編碼產(chǎn)生的Survivin蛋白，由142個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為16500，是IAP家族中最小的成員。從結(jié)構(gòu)上看，Survivin蛋白的N端僅含有一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR），這一結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮抗凋亡作用的核心區(qū)域，能夠與多種凋亡相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其羧基末端不含鋅指結(jié)構(gòu)，取而代之的是一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是Survivin與微管相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵位點(diǎn)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，Survivin的表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期依賴性，主要在G2/M期大量表達(dá)。在這一時(shí)期，Survivin與微管結(jié)合，參與有絲分裂的進(jìn)程，確保細(xì)胞正常分裂。它能夠穩(wěn)定紡錘體微管，維持染色體的正確分離和細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。若Survivin在G2/M期的表達(dá)或功能出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常，引發(fā)染色體不穩(wěn)定等問(wèn)題，進(jìn)而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Survivin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。在眾多腫瘤組織中，Survivin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而在正常分化成熟的組織中幾乎不表達(dá)，這種特異性的表達(dá)差異使其成為腫瘤研究的熱點(diǎn)基因之一。在肝癌中，大量研究表明Survivin基因的高表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Bao等學(xué)者利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)SurvivinmRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者僅在肝癌細(xì)胞和組織中有較高表達(dá)，而在正常肝組織及癌旁組織幾乎不表達(dá)。Morinaga等學(xué)者采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)40例肝癌及癌旁組織和7例正常肝組織中Survivin的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)了這一規(guī)律，并指出Survivin的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的高增殖活性及低凋亡指數(shù)有關(guān)。Ye等學(xué)者應(yīng)用免疫組化檢測(cè)55例肝癌組織，其中29例（52.7%）有Survivin表達(dá)，且Survivin表達(dá)陽(yáng)性的患者，復(fù)發(fā)率高于表達(dá)陰性者，其1年和3年生存率也顯著降低。Survivin促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要體現(xiàn)在多個(gè)方面。在抑制細(xì)胞凋亡方面，Survivin可能通過(guò)抑制終末效應(yīng)因子caspase-3和caspase-7，來(lái)干擾caspase-9的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使肝癌細(xì)胞得以逃避凋亡，持續(xù)增殖。在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，如前所述，Survivin在G2/M期的高表達(dá)能夠參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的快速分裂和增殖。在腫瘤血管生成方面，Survivin可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，為肝癌細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Survivin還與肝癌的耐藥性密切相關(guān)，其高表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低化療的療效。2.3RNA干擾技術(shù)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）現(xiàn)象最初于1995年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)Guo等學(xué)者在利用反義RNA阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)的par-1基因表達(dá)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)正義RNA和反義RNA都能阻斷該基因的表達(dá)，這一現(xiàn)象與傳統(tǒng)認(rèn)知相悖。直到1998年，F(xiàn)ire等學(xué)者將雙鏈RNA（dsRNA）轉(zhuǎn)入線蟲(chóng)細(xì)胞，證實(shí)了dsRNA能夠高效特異的阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，且效率比單鏈RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)，并將這一現(xiàn)象正式命名為RNA干擾。此后，RNAi技術(shù)得到了廣泛的研究和應(yīng)用，為基因功能研究和基因治療領(lǐng)域帶來(lái)了新的突破。RNAi的作用機(jī)制主要分為三個(gè)階段。在起始階段，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在雙鏈RNA（dsRNA）時(shí)，dsRNA可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生，如RNA病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等。dsRNA會(huì)被細(xì)胞內(nèi)一種具有RNA酶Ⅲ樣活性的核酸內(nèi)切酶，即Dicer酶識(shí)別并切割。Dicer酶在生物進(jìn)化過(guò)程中非常保守，它含有解旋酶活性區(qū)域、dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用下，Dicer酶將長(zhǎng)鏈dsRNA精確切割成21-23核苷酸長(zhǎng)度的小分子干擾RNA（siRNA），siRNA的3'端帶有2個(gè)堿基突出的黏性末端，5'端為磷酸基團(tuán)，這種特殊結(jié)構(gòu)對(duì)于siRNA后續(xù)行使功能至關(guān)重要，其剪切位點(diǎn)一般在U處，具有高度特異性。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA會(huì)與多種蛋白成分結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC中包含核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶以及輔助識(shí)別同源序列的蛋白等。在形成過(guò)程中，解旋酶利用ATP供能，解開(kāi)siRNA雙鏈，使其中的反義鏈得以暴露。隨后，RISC憑借其對(duì)同源序列的識(shí)別能力，攜帶siRNA反義鏈去尋找與之互補(bǔ)的靶mRNA序列。當(dāng)RISC識(shí)別到靶mRNA后，siRNA反義鏈與靶mRNA的互補(bǔ)區(qū)域特異性結(jié)合，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。接著，RISC中的核酸酶在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間部位將靶mRNA切斷，被切斷的mRNA片段隨后會(huì)迅速被細(xì)胞內(nèi)其他RNA酶進(jìn)一步降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的沉默。RNAi還存在級(jí)聯(lián)放大階段，這一階段進(jìn)一步增強(qiáng)了RNAi的效應(yīng)。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以被切割的靶mRNA為模板，以siRNA為引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)生的新的dsRNA又可以作為底物，再次被Dicer酶切割，生成更多的siRNA。這些新產(chǎn)生的siRNA能夠繼續(xù)參與到RISC的形成和對(duì)靶mRNA的降解過(guò)程中，如此循環(huán)往復(fù)，使得相對(duì)少量的dsRNA分子能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。即使初始導(dǎo)入細(xì)胞的dsRNA數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量，每個(gè)細(xì)胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生顯著的RNAi效應(yīng)，甚至能達(dá)到缺失突變體表型的程度。并且，dsRNA可通過(guò)細(xì)胞微管在細(xì)胞間傳遞，實(shí)現(xiàn)dsRNA在整個(gè)個(gè)體中的散布，進(jìn)一步擴(kuò)大RNAi的作用范圍。在基因功能研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)發(fā)揮著舉足輕重的作用。在功能基因組學(xué)研究中，傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)且成本高，而RNAi技術(shù)具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、高效快速等優(yōu)勢(shì)，能夠快速有效地抑制特定基因的表達(dá)，從而幫助研究人員確定基因的功能。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)不同基因的siRNA或shRNA，將其導(dǎo)入細(xì)胞中，觀察細(xì)胞表型、生理功能以及相關(guān)分子指標(biāo)的變化，即可推斷該基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝等過(guò)程中的作用。在研究細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因時(shí)，利用RNAi技術(shù)抑制某個(gè)基因的表達(dá)，若細(xì)胞周期出現(xiàn)異常，如停滯在某一階段或加速分裂等，就可以明確該基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用。在信號(hào)通路研究方面，RNAi技術(shù)可以特異性地阻斷信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而深入探究信號(hào)通路的上下游關(guān)系和調(diào)控機(jī)制。在研究MAPK信號(hào)通路時(shí)，通過(guò)RNAi抑制該通路上游關(guān)鍵激酶的表達(dá)，觀察下游蛋白的磷酸化水平以及細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)行為的變化，進(jìn)而揭示該信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。RNAi技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域也展現(xiàn)出巨大的潛力。針對(duì)腫瘤相關(guān)基因，設(shè)計(jì)并導(dǎo)入特異性的siRNA或shRNA，能夠有效抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等治療目的。在乳腺癌治療研究中，針對(duì)HER-2基因高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)抑制HER-2基因的表達(dá)，可顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力。RNAi技術(shù)還可以與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果。對(duì)于對(duì)順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞，通過(guò)RNAi技術(shù)干擾耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，可使卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯提高，從而提高化療的療效。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞株在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于研究RNA干擾Survivin基因?qū)ζ涞蛲黾盎煹挠绊憽］d體與菌株：真核表達(dá)載體pGenesil-1購(gòu)自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司，其具有多克隆位點(diǎn)，可用于插入目的基因片段，為后續(xù)構(gòu)建重組表達(dá)載體提供基礎(chǔ)。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于重組質(zhì)粒的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化。主要試劑：RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑：Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，該試劑能夠有效裂解細(xì)胞，提取高質(zhì)量的總RNA，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR相關(guān)試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司，包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如Taq酶、dNTPs、緩沖液等，具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)Survivin基因mRNA的表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，根據(jù)Survivin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性。蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑：RIPA裂解液用于提取細(xì)胞總蛋白，可有效裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司，用于測(cè)定提取蛋白的濃度，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保證蛋白上樣量的一致性。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒用于制備聚丙烯酰胺凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，可用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上，便于后續(xù)的免疫檢測(cè)。Survivin蛋白抗體、β-actin抗體以及相應(yīng)的二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)Survivin蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)水平?；瘜W(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于檢測(cè)膜上的蛋白質(zhì)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使目的蛋白條帶可視化。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，是一種高效的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⒅亟M表達(dá)載體高效導(dǎo)入HepG2細(xì)胞中。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑：AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)標(biāo)記凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸和細(xì)胞核內(nèi)的DNA，能夠準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。Hoechst33342染色液用于細(xì)胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞核的濃縮、碎裂等。化療藥物：順鉑（cisplatin）、阿霉素（doxorubicin）購(gòu)自Sigma公司，是臨床常用的化療藥物，用于研究RNA干擾Survivin基因后HepG2細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化。其他試劑：DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自Invitrogen公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，用于消化細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。瓊脂糖、Tris、甘氨酸、SDS等分子生物學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，用于配制各種緩沖液和凝膠。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)儀器：CO?培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)操作，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，可用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。核酸與蛋白質(zhì)檢測(cè)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，準(zhǔn)確測(cè)定基因表達(dá)水平。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE凝膠電泳的結(jié)果，拍攝蛋白條帶和核酸條帶的圖像。電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司，用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離。流式細(xì)胞儀：流式細(xì)胞儀購(gòu)自BDBiosciences公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面和內(nèi)部的熒光標(biāo)記物，分析細(xì)胞的生物學(xué)特性。其他儀器：高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)的離心分離。移液器購(gòu)自Gilson公司，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品。渦旋振蕩器用于混勻試劑和樣品。水浴鍋用于加熱和保溫試劑。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體根據(jù)GenBank中公布的Survivin基因序列（登錄號(hào)：NM_001168），運(yùn)用在線設(shè)計(jì)軟件（如Ambion公司的siRNA設(shè)計(jì)工具），參考RNA干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，精心設(shè)計(jì)針對(duì)Survivin基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。設(shè)計(jì)的shRNA序列需包含19-21個(gè)核苷酸的靶序列，兩端添加合適的酶切位點(diǎn)（如BamHⅠ和HindⅢ），以便后續(xù)克隆至真核表達(dá)載體中。同時(shí)，設(shè)計(jì)一段與Survivin基因無(wú)同源性的陰性對(duì)照shRNA序列，用于排除非特異性干擾。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列和陰性對(duì)照序列交由專業(yè)生物公司（如上海生工生物工程有限公司）合成。合成的寡核苷酸鏈為單鏈，需進(jìn)行退火處理形成雙鏈。取適量的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，加入退火緩沖液（含Tris-HCl、NaCl、EDTA等成分），混合均勻后，利用PCR儀進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃加熱3-5分鐘，使雙鏈解開(kāi)；然后緩慢降溫至70℃，并在70℃水浴中自然冷卻至室溫，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。將真核表達(dá)載體pGenesil-1用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。酶切體系包含適量的載體DNA、10×緩沖液、BamHⅠ和HindⅢ酶，總體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定。將酶切體系置于37℃恒溫孵育2-3小時(shí)，使載體充分酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用膠回收試劑盒（如Omega公司的膠回收試劑盒）回收線性化的載體片段?；厥者^(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，包括凝膠切割、溶膠、吸附、洗滌和洗脫等步驟，以獲得高純度的線性化載體。將退火形成的雙鏈shRNA與線性化的載體按一定摩爾比（通常為3∶1-5∶1）加入連接反應(yīng)體系中。連接體系還包含T4DNA連接酶、10×連接緩沖液等成分，總體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況確定。將連接體系置于16℃恒溫孵育過(guò)夜，使雙鏈shRNA與載體充分連接，形成重組表達(dá)載體pshRNA-survivin。設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)，即只加入線性化載體和T4DNA連接酶，不加入雙鏈shRNA；同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)，使用已知正確連接的質(zhì)粒作為對(duì)照，以驗(yàn)證連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程的有效性。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入4μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻后，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速冰浴冷卻2-3分鐘。向管中加入800μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，置于37℃恒溫?fù)u床中，以150-200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌形成單菌落。從LB平板上挑取單個(gè)菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，使細(xì)菌大量增殖。使用質(zhì)粒小量抽提試劑盒（如Omega公司的質(zhì)粒小提試劑盒）提取重組質(zhì)粒。提取過(guò)程包括細(xì)菌收集、裂解、中和、吸附、洗滌和洗脫等步驟，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以獲得高純度的重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)μ崛〉闹亟M質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定。酶切體系包含適量的重組質(zhì)粒、10×緩沖液、BglⅡ酶，總體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定。將酶切體系置于37℃恒溫孵育1-2小時(shí)，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。若重組質(zhì)粒中含有BglⅡ酶切位點(diǎn)，則酶切后會(huì)出現(xiàn)線性化條帶；若質(zhì)粒無(wú)此酶切位點(diǎn)，則保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將鑒定證實(shí)后的重組質(zhì)粒送專業(yè)測(cè)序公司（如上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序引物為M13+，通過(guò)將測(cè)得的序列與目標(biāo)shRNA序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)重組表達(dá)載體構(gòu)建是否成功。若測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致，則表明pshRNA-survivin-387載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染從液氮罐中取出凍存的人肝癌HepG2細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。用5mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱需定期進(jìn)行清潔和消毒，以防止微生物污染。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用3-5mL無(wú)菌PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶溶液，輕輕搖晃使胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，立即加入3-4mL含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落并分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將細(xì)胞以1∶2-1∶4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以合適的密度接種到6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。在無(wú)菌條件下，將10μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000加入到250μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，使脂質(zhì)體充分活化。將5μg重組表達(dá)載體pshRNA-survivin或空載體（陰性對(duì)照）加入到另一個(gè)250μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將活化后的脂質(zhì)體溶液逐滴加入到含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞1-2次。向每孔中加入1.5mL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，然后將脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖晃6孔板，使復(fù)合物均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，吸去孔中的培養(yǎng)基，加入2mL含有血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。3.2.3檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pshRNA-survivin的HepG2細(xì)胞），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向細(xì)胞沉淀中加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?/mL。加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育10-15分鐘。孵育過(guò)程中，可使用鋁箔紙包裹離心管，以避免熒光物質(zhì)受到光照影響。200g離心5分鐘，棄去上清液，加入190μLAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置15-20分鐘。染色完成后，盡快進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將染色后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)前，需對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保儀器參數(shù)準(zhǔn)確。設(shè)置檢測(cè)通道，AnnexinV-FITC為綠色熒光，檢測(cè)通道為FL1；PI為紅色熒光，檢測(cè)通道為FL2。以未染色的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，調(diào)節(jié)電壓和補(bǔ)償，使陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光信號(hào)位于左下角象限。分別檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的熒光信號(hào)，每個(gè)樣本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀配套的分析軟件（如CellQuest軟件）分析檢測(cè)結(jié)果。在散點(diǎn)圖中，左下角象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下角象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上角象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上角象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=（早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比）。通過(guò)比較各組細(xì)胞凋亡指數(shù)的差異，分析RNA干擾Survivin基因?qū)epG2細(xì)胞凋亡的影響。3.2.4檢測(cè)細(xì)胞增殖水平將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔加入200μL，使每孔細(xì)胞數(shù)量為1000個(gè)。將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。吸出96孔板中的培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度順鉑（如0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）的完全培養(yǎng)基，每孔200μL。設(shè)置順鉑濃度梯度時(shí)，需參考相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確保濃度范圍能夠反映細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性變化。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)。在檢測(cè)前，向每孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸出孔中的培養(yǎng)基，注意避免吸到細(xì)胞沉淀。向每孔中加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。在檢測(cè)前，需對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)零，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)、不同順鉑濃度下各組細(xì)胞的增殖抑制率，分析RNA干擾Survivin基因?qū)epG2細(xì)胞在順鉑作用下增殖水平的影響。3.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對(duì)于多組數(shù)據(jù)的比較，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步進(jìn)行LSD法或Dunnett'sT3法兩兩比較。對(duì)于兩組數(shù)據(jù)的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確RNA干擾Survivin基因?qū)epG2細(xì)胞凋亡及化療影響的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供依據(jù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1shRNA真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)載體pshRNA-survivin進(jìn)行酶切鑒定，以驗(yàn)證插入片段的正確性。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。在凝膠電泳圖譜中，可見(jiàn)兩條清晰的條帶，其中一條條帶大小與線性化的載體pGenesil-1大小一致，約為3.7kb；另一條條帶大小與預(yù)期插入的shRNA片段大小相符，約為150bp。這表明重組質(zhì)粒中含有正確插入的shRNA片段，酶切鑒定結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)重組表達(dá)載體的準(zhǔn)確性，將酶切鑒定證實(shí)后的重組質(zhì)粒送專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的shRNA序列與設(shè)計(jì)的目標(biāo)序列完全一致，堿基無(wú)突變、缺失或插入等異常情況，從而從分子層面確認(rèn)了pshRNA-survivin-387載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序分析的雙重驗(yàn)證，有力地證明了針對(duì)Survivin基因的shRNA真核表達(dá)載體pshRNA-survivin-387已成功構(gòu)建，可用于后續(xù)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及相關(guān)研究。圖1：pshRNA-survivin重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1：未酶切的重組質(zhì)粒；2：BglⅡ酶切后的重組質(zhì)粒，可見(jiàn)約3.7kb的載體條帶和約150bp的shRNA插入片段條帶。4.2RNA干擾對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞凋亡指數(shù)表示，具體數(shù)據(jù)如表1所示?？瞻讓?duì)照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)為(4.23±0.56)%，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)為(4.58±0.62)%，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明轉(zhuǎn)染空載體對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。而pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡指數(shù)為(28.65±2.13)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這一結(jié)果清晰地表明，pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。通過(guò)進(jìn)一步分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖（圖2），可以更直觀地觀察到各組細(xì)胞凋亡情況的差異。在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的散點(diǎn)圖中，位于右下角（早期凋亡細(xì)胞）和右上角（晚期凋亡細(xì)胞）象限的細(xì)胞數(shù)量較少，表明凋亡細(xì)胞比例較低。而在pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組的散點(diǎn)圖中，右下角和右上角象限的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，直觀地顯示出該組細(xì)胞凋亡率顯著升高。結(jié)合表1的具體數(shù)據(jù)和圖2的散點(diǎn)圖分析，可以明確得出結(jié)論：針對(duì)Survivin基因的RNA干擾能夠有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，這為深入研究Survivin基因在肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用機(jī)制以及肝癌的基因治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。表1各組HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（x±s，%）組別n凋亡指數(shù)空白對(duì)照組34.23±0.56陰性對(duì)照組34.58±0.62pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組328.65±2.13##注：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，##P<0.01。圖2：各組HepG2細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組。4.3RNA干擾對(duì)HepG2細(xì)胞化療敏感性的影響運(yùn)用MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑作用下各組HepG2細(xì)胞的增殖抑制率，以此評(píng)估RNA干擾對(duì)細(xì)胞化療敏感性的影響，具體結(jié)果見(jiàn)表2。在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中，隨著順鉑濃度的增加，細(xì)胞抑制率雖有上升趨勢(shì)，但上升幅度相對(duì)較小。當(dāng)順鉑濃度為20μM時(shí)，空白對(duì)照組細(xì)胞抑制率為(25.63±2.45)%，陰性對(duì)照組細(xì)胞抑制率為(27.85±2.86)%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞抑制率隨順鉑濃度增加顯著上升。當(dāng)順鉑濃度為20μM時(shí)，pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率達(dá)到(56.78±4.56)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。在順鉑濃度為40μM時(shí)，pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率更是高達(dá)(78.92±5.23)%，而此時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞抑制率分別為(45.67±3.56)%和(48.90±4.01)%。這表明RNA干擾Survivin基因表達(dá)后，HepG2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著提高，相同濃度順鉑對(duì)pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。表2不同濃度順鉑作用下各組HepG2細(xì)胞抑制率比較（x±s，%）組別n順鉑濃度0μM順鉑濃度5μM順鉑濃度10μM順鉑濃度20μM順鉑濃度40μM空白對(duì)照組50.00±0.0012.35±1.5618.76±2.0125.63±2.4545.67±3.56陰性對(duì)照組50.00±0.0013.56±1.8920.12±2.2327.85±2.8648.90±4.01pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組50.00±0.0025.67±2.5638.90±3.2356.78±4.5678.92±5.23注：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，##P<0.01。通過(guò)繪制不同濃度順鉑作用下各組細(xì)胞抑制率的折線圖（圖3），可以更直觀地看出三組細(xì)胞抑制率的變化趨勢(shì)。pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組的折線斜率明顯大于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，這直觀地反映出pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率隨順鉑濃度升高而快速上升，進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)染pshRNA-survivin能夠顯著提高HepG2細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。這種敏感性的提高，為臨床肝癌治療中聯(lián)合應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和化療藥物提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望通過(guò)增強(qiáng)化療效果，提高肝癌患者的治療成功率和生存率。圖3：不同濃度順鉑作用下各組HepG2細(xì)胞抑制率變化。五、RNA干擾survivin基因的作用機(jī)制探討5.1對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到精密調(diào)控的過(guò)程，涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路，而RNA干擾survivin基因后，對(duì)這些凋亡相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生了顯著影響。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵內(nèi)源性信號(hào)通路之一。在正常生理狀態(tài)下，線粒體膜電位保持穩(wěn)定，維持細(xì)胞的正常功能。然而，當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體膜通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素c（Cytochromec）等凋亡因子。細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體進(jìn)一步招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），活化的Caspase-9又會(huì)激活下游的Caspase-3等效應(yīng)蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾survivin基因表達(dá)后，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體釋放細(xì)胞色素c的量顯著增加。這表明RNA干擾survivin基因可能通過(guò)影響線粒體膜的穩(wěn)定性，激活線粒體凋亡途徑。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Caspase-9和Caspase-3的活性明顯增強(qiáng)，其蛋白表達(dá)水平也有所上升。這說(shuō)明RNA干擾survivin基因能夠通過(guò)線粒體途徑，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的外源性信號(hào)通路。該途徑主要通過(guò)細(xì)胞表面的死亡受體與相應(yīng)配體結(jié)合來(lái)啟動(dòng)。其中，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)是研究較為深入的死亡受體途徑之一。Fas（又稱CD95）是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。當(dāng)Fas與其配體FasL結(jié)合后，F(xiàn)as會(huì)發(fā)生三聚化，招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與Fas的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC招募并激活Caspase-8，活化的Caspase-8可以直接激活下游的Caspase-3等效應(yīng)蛋白酶，也可以通過(guò)切割Bid蛋白，將線粒體途徑與死亡受體途徑聯(lián)系起來(lái)，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在RNA干擾survivin基因表達(dá)的研究中，發(fā)現(xiàn)Fas和FasL的表達(dá)水平明顯上調(diào)。這意味著RNA干擾survivin基因可能增強(qiáng)了Fas/FasL系統(tǒng)的活性，從而激活死亡受體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Caspase-8的活性增強(qiáng)，其蛋白表達(dá)水平也有所增加。這表明RNA干擾survivin基因能夠通過(guò)死亡受體途徑，激活Caspase-8，進(jìn)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。除了線粒體途徑和死亡受體途徑，RNA干擾survivin基因還可能對(duì)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生影響。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的分支。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，JNK和p38MAPK的激活通常與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)，而ERK的激活則與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)。研究表明，RNA干擾survivin基因表達(dá)后，JNK和p38MAPK的磷酸化水平明顯增加，即其活性增強(qiáng)。這提示RNA干擾survivin基因可能通過(guò)激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。而ERK的磷酸化水平則有所下降，表明RNA干擾survivin基因可能抑制了ERK信號(hào)通路的活性，從而減少了細(xì)胞的增殖和存活信號(hào)。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路也是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的信號(hào)通路。PI3K被激活后，能夠?qū)⒘字＜〈?4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募AKT到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使AKT磷酸化而激活。活化的AKT可以通過(guò)磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾survivin基因表達(dá)后，PI3K的活性降低，AKT的磷酸化水平明顯下降。這說(shuō)明RNA干擾survivin基因可能抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，從而削弱了細(xì)胞的存活信號(hào)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。綜上所述，RNA干擾survivin基因表達(dá)后，通過(guò)對(duì)線粒體途徑、死亡受體途徑以及MAPK、PI3K/AKT等多條凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響，調(diào)節(jié)了凋亡相關(guān)蛋白的活性和表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。這些信號(hào)通路之間并非孤立存在，而是相互交織、相互作用，形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控著細(xì)胞的凋亡過(guò)程。5.2與化療藥物協(xié)同作用機(jī)制RNA干擾survivin基因后，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用展現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，其背后蘊(yùn)含著復(fù)雜而精妙的分子機(jī)制。從細(xì)胞凋亡的角度來(lái)看，化療藥物在作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。以順鉑為例，它能夠與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，形成DNA-鉑加合物，導(dǎo)致DNA損傷。這種損傷會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，促使細(xì)胞周期停滯，同時(shí)激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路。然而，腫瘤細(xì)胞往往具有一定的抗凋亡能力，Survivin基因的高表達(dá)就是其抗凋亡的重要機(jī)制之一。Survivin蛋白可以通過(guò)多種方式抑制細(xì)胞凋亡，如抑制Caspase家族蛋白酶的活性，阻斷凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。當(dāng)RNA干擾抑制Survivin基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力被削弱。此時(shí)，化療藥物引發(fā)的DNA損傷更容易激活凋亡信號(hào)通路，Caspase-3、Caspase-9等凋亡蛋白酶的活性進(jìn)一步增強(qiáng)。這使得化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力顯著提高，兩者協(xié)同作用，共同促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，從而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。在細(xì)胞增殖方面，化療藥物會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、復(fù)制以及細(xì)胞分裂等過(guò)程。例如，阿霉素能夠嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，從而阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期停滯在S期或G2/M期。而Survivin基因在細(xì)胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，尤其是在G2/M期，Survivin蛋白與微管結(jié)合，參與紡錘體的形成和穩(wěn)定，確保細(xì)胞正常分裂。RNA干擾Survivin基因表達(dá)后，細(xì)胞在G2/M期的分裂進(jìn)程受到干擾，細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂。當(dāng)與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，化療藥物對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用與RNA干擾Survivin基因?qū)е碌募?xì)胞周期紊亂相互疊加。使得更多的細(xì)胞停滯在對(duì)化療藥物更為敏感的細(xì)胞周期階段，增加了化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)會(huì)，從而協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞的耐藥性是影響化療效果的重要因素之一，而RNA干擾Survivin基因表達(dá)可以通過(guò)多種途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，與化療藥物發(fā)揮協(xié)同作用。一些研究表明，Survivin基因的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。例如，Survivin可能通過(guò)調(diào)節(jié)P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等藥物外排泵的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒒熕幬锱懦黾?xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)RNA干擾Survivin基因表達(dá)后，耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平下降。以P-gp為例，研究發(fā)現(xiàn)干擾Survivin基因后，P-gp的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞內(nèi)化療藥物的積累量明顯增加。這使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取增加，外排減少，提高了細(xì)胞內(nèi)化療藥物的有效濃度，增強(qiáng)了化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。RNA干擾Survivin基因還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，與化療藥物協(xié)同發(fā)揮作用。腫瘤細(xì)胞的代謝具有獨(dú)特性，它們往往依賴于有氧糖酵解來(lái)滿足其快速增殖的能量需求。Survivin基因可能參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程，干擾Survivin基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的糖代謝途徑可能發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，干擾Survivin基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖攝取減少，糖酵解關(guān)鍵酶的活性降低。這使得腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)受到影響，細(xì)胞的增殖和存活能力下降。此時(shí)，化療藥物作用于能量代謝受損的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步破壞其代謝平衡，兩者協(xié)同作用，更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。六、研究成果的臨床應(yīng)用前景與局限6.1臨床應(yīng)用前景本研究成果在肝癌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景，為肝癌患者的治療帶來(lái)了新的希望和策略。在肝癌治療方案制定方面，本研究明確了RNA干擾Survivin基因可顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。這一發(fā)現(xiàn)為臨床醫(yī)生提供了新的治療思路，未來(lái)有望將RNA干擾技術(shù)與傳統(tǒng)化療相結(jié)合，制定出更有效的聯(lián)合治療方案。對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，可先采用RNA干擾技術(shù)抑制Survivin基因表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力和耐藥性，再結(jié)合化療藥物進(jìn)行治療，從而提高治療效果，延長(zhǎng)患者生存期。這種聯(lián)合治療方案相較于單一的化療或其他傳統(tǒng)治療方法，能夠更全面地針對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行攻擊，有望突破現(xiàn)有治療手段的局限性，為肝癌患者提供更優(yōu)的治療選擇。在聯(lián)合治療策略方面，RNA干擾Survivin基因與化療藥物的協(xié)同作用機(jī)制為聯(lián)合治療提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。臨床上可根據(jù)患者的具體情況，選擇合適的化療藥物與RNA干擾技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。對(duì)于對(duì)順鉑敏感的肝癌患者，可在使用順鉑化療的同時(shí)，通過(guò)RNA干擾Survivin基因表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高化療的敏感性和療效。還可以探索將RNA干擾技術(shù)與其他治療方法，如放療、免疫治療等相結(jié)合的聯(lián)合治療模式。與放療聯(lián)合時(shí)，RNA干擾Survivin基因可能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，減少放療劑量，降低放療的副作用。與免疫治療聯(lián)合，或許能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高免疫治療的效果。這種多模式聯(lián)合治療策略將充分發(fā)揮各種治療方法的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的綜合治療，為肝癌患者帶來(lái)更好的治療預(yù)后。在個(gè)性化治療方面，由于不同患者的肝癌細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，對(duì)治療的反應(yīng)也存在差異。本研究成果為肝癌的個(gè)性化治療提供了可能。通過(guò)對(duì)患者肝癌細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，了解Survivin基因的表達(dá)情況以及其他相關(guān)基因的特征，醫(yī)生可以精準(zhǔn)地判斷患者是否適合采用RNA干擾Survivin基因的治療方法，并制定個(gè)性化的治療方案。對(duì)于Survivin基因高表達(dá)的患者，采用RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)，可能會(huì)取得更好的治療效果。還可以根據(jù)患者的個(gè)體差異，調(diào)整RNA干擾的劑量、化療藥物的種類和劑量等，實(shí)現(xiàn)真正意義上的個(gè)性化治療，提高治療的精準(zhǔn)性和有效性，減少不必要的治療副作用，提高患者的生活質(zhì)量。6.2目前研究的局限性盡管本研究在RNA干擾Survivin基因?qū)epG2細(xì)胞凋亡及化療影響方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性，需要在未來(lái)的研究中進(jìn)一步完善和改進(jìn)。本研究主要基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然能夠在一定程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，揭示基因與細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系，但與臨床實(shí)際情況仍存在較大差異。在體內(nèi)環(huán)境中，肝癌細(xì)胞處于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，受到多種細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞以及腫瘤血管等因素的影響。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們與肝癌細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用。T細(xì)胞可以識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞也會(huì)通過(guò)一些機(jī)制逃避T細(xì)胞的免疫監(jiān)視，而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中很難完全模擬這種免疫微環(huán)境。腫瘤血管為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程，體外實(shí)驗(yàn)難以準(zhǔn)確體現(xiàn)腫瘤血管對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。因此，本研究結(jié)果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化時(shí)，需要進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證RNA干擾Survivin基因在體內(nèi)的有效性和安全性。RNA干擾技術(shù)存在潛在的脫靶效應(yīng)，即干擾序列可能與非靶基因的mRNA發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致非靶基因的表達(dá)也受到抑制，從而產(chǎn)生意想不到的生物學(xué)效應(yīng)。雖然在設(shè)計(jì)shRNA序列時(shí)，遵循了嚴(yán)格的設(shè)計(jì)原則并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生概率，但仍無(wú)法完全排除這種可能性。脫靶效應(yīng)可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致對(duì)RNA干擾Survivin基因作用機(jī)制的錯(cuò)誤解讀。在未