3 3 7 17 22 22 22 22 23 231一、工作簡況本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國標(biāo)委發(fā)〔2024〕25號《國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會關(guān)于下達(dá)2024年第三批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計(jì)劃的通知》（項(xiàng)目編號為由山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院、上海化工院檢測有限公司、國家化中心（上海）、山東蓬勃生物科技有限公司、云南化工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)蕓苔素內(nèi)酯是一種新型植物生長調(diào)劑物質(zhì)，是長調(diào)節(jié)劑，滲透強(qiáng)、內(nèi)吸快。人工合成的蕓苔素內(nèi)酯在很植物的營養(yǎng)體生長和促進(jìn)受精作用，在有效增加葉綠素含量、提促根壯苗、?；ū９岣咦魑锏目购?、抗旱性、抗鹽蕓苔素內(nèi)酯與沖施肥、液體硼、磷酸二氫鉀等利用率，常被用作混配成分添加到肥料中，并以此開發(fā)要為增產(chǎn)和調(diào)節(jié)植物生長，但蕓苔素內(nèi)酯有一定的適宜可能會對作物出現(xiàn)不同程度的抑制現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致細(xì)胞果實(shí)畸形等藥害。《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》規(guī)定，未取得農(nóng)藥得在肥料中添加使用。為引導(dǎo)肥料行業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展2少。蕓苔素內(nèi)酯類化合物沸點(diǎn)較高，難氣化，無法用氣相構(gòu)及光電響應(yīng)基團(tuán)，常規(guī)液相色譜結(jié)合紫外、熒光及光電易離子化基團(tuán)，無法使用質(zhì)譜法檢測，可通過衍生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)中引入生色基團(tuán)或易離子化基團(tuán)，選擇適用的檢測器肥料中蕓苔素內(nèi)酯的液相色譜-紫外檢測法和液相色譜-電霧式檢測法，將進(jìn)一步完善肥料中植物生長調(diào)節(jié)劑檢測標(biāo)準(zhǔn)體系，保護(hù)農(nóng)民的合法全，為規(guī)范市場良性競爭，保障我國肥料產(chǎn)品質(zhì)量安全省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院聯(lián)合上?；ぴ簷z測有限公司、云站、貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院等單位共同成立標(biāo)準(zhǔn)起草查閱了大量文獻(xiàn)資料，進(jìn)行了樣品收集、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)2024年6月至2025年3月，主要進(jìn)行了資料關(guān)政策法規(guī)、國內(nèi)肥料產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀調(diào)研及現(xiàn)有國家關(guān)實(shí)驗(yàn)樣品，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，及2025年4~5月，編制《肥料中蕓苔素內(nèi)酯的測定高效液相色譜法》作業(yè)指導(dǎo)書及實(shí)驗(yàn)室間比對方案，選取驗(yàn)證樣品，在國內(nèi)5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品比對工作，匯二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及確定的依據(jù)3起草小組在充分收集、認(rèn)真研究相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及資料的指南》對肥料中蕓苔素內(nèi)酯的檢測方法各技術(shù)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)靈敏度、準(zhǔn)確性、線性范圍和應(yīng)用范圍的前提下，通過系統(tǒng)肥料中蕓苔素內(nèi)酯的高效液相色譜法，力求技術(shù)先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了方法的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、回收率和精密度等主要內(nèi)容，同時根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)苔素內(nèi)酯和28-表高蕓苔素內(nèi)酯，約占蕓苔素內(nèi)酯產(chǎn)品登記總數(shù)的80%，因此選定表1待測物信息表化合物名稱CAS號分子式分子量24-表蕓苔素內(nèi)酯78821-43-9C28H48O6480.6828-表高蕓苔素內(nèi)酯110369-52-3C29H50O6494.7028-高蕓苔素內(nèi)酯82373-95-3C29H50O6494.70三、主要驗(yàn)證試驗(yàn)的分析及預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果該法用甲醇為溶劑提取樣品后，采用高效液相色譜-紫外檢測法測定待測物含4并確定了最佳色譜分離條件，通過紫外檢測器在222nm波長下進(jìn)行定量分析。樣品經(jīng)制備后提取過程為：稱取0.5g至2g（精確至0.0001g）樣品于50mL離心管通過對蕓苔素內(nèi)酯性質(zhì)的了解及相關(guān)文獻(xiàn)的查詢，業(yè)內(nèi)多使用C18色譜柱對蕓苔素內(nèi)酯衍生物進(jìn)行色譜分離，試驗(yàn)分別考察了（a）以Column1（C18,4.6mm×250mm，5.0μm）為分離柱5（b）以Column2（C18,4.6mm×150mm，5.0μm）為分離柱（c）以Column3（C18,4.6mm×100mm，2.7μm）為分離柱圖120.0mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖對試樣進(jìn)行分離測定，色譜峰出峰時間較長，且三種蕓苔素離；以不同比例的乙腈和水為流動相，利用改變流動相配比6圖2蕓苔素內(nèi)酯衍生物紫外全波長掃描光譜圖）；7圖3蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物液相色譜圖蕓苔素內(nèi)酯屬于酯溶性激素，其常溫下在水中的溶解度相對較低，僅約為5mg/kg，但它在有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈中具有良好的溶解性。選取空白樣品，進(jìn)行對3種蕓苔素內(nèi)酯衍生物的提取效果（見圖4）。發(fā)現(xiàn)以丙酮為提取溶劑時，待測物的回收率低于40%；以乙腈為提取溶劑時，待測物的回收率小于60%；以甲醇和溶劑，需增加氮吹及復(fù)溶過程，為提高檢測效率，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇為提取圖4不同提取試劑下三種待測物加標(biāo)回收率硼酸類衍生劑作為環(huán)形衍生劑可與蕓苔素內(nèi)酯鄰位的兩8蕓苔素內(nèi)酯類化合物理想的衍生化試劑，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)衍生化試劑。因甲醇對蕓苔素內(nèi)酯衍生物的提取效率較高常溫使用苯硼酸衍生化具有操作簡便和衍生化效率高的優(yōu)苯硼酸和3種蕓苔素內(nèi)酯的衍生化時間進(jìn)行了研究（見圖5）。發(fā)現(xiàn)已知含量的蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品與苯硼酸室溫下衍生化反應(yīng)，以蕓苔素內(nèi)圖5不同衍生化時間下待測物液相色譜響應(yīng)峰面積試驗(yàn)對衍生化試劑苯硼酸的用量進(jìn)行了研究（圖6），發(fā)現(xiàn)苯硼酸濃度為1.0峰值，為避免操作誤差及其他影響，實(shí)驗(yàn)采用過量苯硼酸進(jìn)行衍生化，衍生9圖6不同衍生化試劑用量下待測物液相色譜響應(yīng)峰面積考慮到不同肥料樣品對提取溶劑的溶解性可能有差別，實(shí)驗(yàn)選擇提取效率高、聲時間為10min時，樣品測定準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性最佳，因此確定超聲提取時間為10(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測物線性表2待測物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)化合物名稱標(biāo)準(zhǔn)溶液系列(μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)r28-表高蕓苔素內(nèi)酯y=10.46040x-2.141450.999824-表蕓苔素內(nèi)酯y=8.73765x-0.937770.999028-高蕓苔素內(nèi)酯y=8.94655x-0.341570.9997考察方法檢出限和定量限，按3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法根據(jù)實(shí)際樣品檢出濃度情況，稱取空白樣品，分別設(shè)個水平重復(fù)測定六次。按優(yōu)化后的方法進(jìn)行樣品前處理，依次對樣品進(jìn)行檢測。分別計(jì)算兩個濃度的加標(biāo)回收率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3~表5，3種待測物不同添加水平的平均添加回收率在94.4%～101.7%之間，RSD值范圍為表328-表高蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號28-表高蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值(μg）添加量/μg測定值/μg15046.85244.95126.72343.96443.57552.16129.62651.73129.18平均/μg/47.20/122.96回收率/%94.4098.37RSD/%8.165.03表424-表蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號24-表蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值/μg添加量/μg測定值/μg15045.05249.23132.87346.56129.23448.64126.99550.82131.68652.42132.83平均/μg/48.79/回收率/%97.58101.70RSD/%5.533.52表528-高蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號28-高蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值/μg添加量/μg測定值/μg15046.17244.63346.45127.81447.68131.295650.83126.83平均/μg/47.82/122.48回收率/%95.6497.98RSD/%5.525.68通過對不同樣品的測試，對肥料中蕓苔素內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表6。計(jì)算每組平行的算術(shù)平均值以及相對相差（相對相差表示兩次測定差值的絕對值與算術(shù)平均值的比值）。按照相對表6蕓苔素內(nèi)酯重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總表化合物名稱樣品序號平行1/%平行2/%算術(shù)平均值/%相對相差/%28-表高蕓苔素內(nèi)酯yp-10.00910.0110.0100yp-20.00920.00900.00912yp-30.0100.00900.009524-表蕓苔素內(nèi)酯yp-40.0110.0100.010yp-50.0120.0100.011yp-60.0110.0110.011028-高蕓苔素內(nèi)酯yp-70.00420.00430.00422yp-80.00390.00440.0042統(tǒng)計(jì)。計(jì)算每個樣品中待測物質(zhì)的不同實(shí)驗(yàn)室間最大相對密度差異，不同實(shí)驗(yàn)室測定時，兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對表7蕓苔素內(nèi)酯再現(xiàn)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總表樣品編號檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室A檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室B檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室C檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室D檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室E檢驗(yàn)結(jié)果/%最大相對相差/%0320-A24-表蕓苔素內(nèi)酯0.0160.0140.0150.0180.01725樣品編號檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室A檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室B檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室C檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室D檢驗(yàn)結(jié)果/%實(shí)驗(yàn)室E檢驗(yàn)結(jié)果/%最大相對相差/%28-高蕓苔素內(nèi)酯0.0190.0160.0180.0180.0190320-B24-表蕓苔素內(nèi)酯0.00710.00870.00930.00920.00862728-高蕓苔素內(nèi)酯0.00920.00800.00850.00920.00910320-C28-表高蕓苔素內(nèi)酯0.00840.00890.00900.00810.00830320-D24-表蕓苔素內(nèi)酯0.0160.0180.0190.0190.01828-高蕓苔素內(nèi)酯0.0200.0180.0200.0200.0190320-E28-表高蕓苔素內(nèi)酯0.0190.0200.0180.0190.018性，外標(biāo)法定量。試驗(yàn)過程中研究確定了提取溶劑、色譜分離柱，例、流速等色譜分離條件以及檢測器參數(shù)，提高了檢測效率。確定取過程為：稱取0.5g至2g（精確至0.0001g）樣品于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入注：電霧式檢測器（CAD）是一種新型質(zhì)量型檢測技術(shù)，其工作原理為液相色譜洗脫由氮?dú)夥稚㈧F化，排出較大的霧滴后，其余較小的霧滴在干燥管中受熱迅速干燥形成溶質(zhì)顆粒。溶質(zhì)顆粒與帶正電荷的氮?dú)獍l(fā)生逆向碰撞并使其表面帶上正電荷，再經(jīng)過負(fù)電荷離子阱，使電遷移率較大的氮?dú)馀c易揮發(fā)溶劑顆粒的表面的正電荷被中和，最后，電遷移率小的帶電溶質(zhì)顆粒進(jìn)入收集器，由高靈敏度的靜電檢測計(jì)測量其電信號，該信號強(qiáng)度與溶質(zhì)的質(zhì)量成正比。28-表高蕓苔素內(nèi)酯、24-表蕓苔素內(nèi)酯和28-高蕓苔素內(nèi)酯因自身結(jié)構(gòu)的特異柱對待測物的分離效果（圖7）。優(yōu)化色譜條件后，發(fā)現(xiàn)利用ThermoFisherFOODKIT1&2ADE色譜柱，三種待測物可快速出峰，但分離效果遠(yuǎn)低于AgilentZorboxSB-C18柱，且AgilentZorboxSB-C1835:65四種液相色譜流動相體系。發(fā)現(xiàn)待測物的出峰時間對流動相中乙腈的體積變化較為敏感，流動相體系中隨著乙腈體積的減小，待測物比為35:65時，三種待測物出峰時間適中，基本實(shí)現(xiàn)分離。進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整色譜流動相條件，確定最佳液相色譜檢測條件為乙腈圖7不同色譜分離柱條件下100.0mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖注：A、B為利用ThermoFisherFOODKIT1&2ADE柱獲得的色譜圖，C為柱獲得的色譜圖?；陔婌F式檢測器的特點(diǎn)，高進(jìn)樣量可能導(dǎo)致溶劑蒸發(fā)不完全，降低靈敏同時，色譜進(jìn)樣體積需考慮到色譜柱載樣能力。實(shí)驗(yàn)選定的AgilentZorboxSB-C18（4.6mm×100mm，2.7μm）色譜柱屬于粒徑小的填料，載樣量較低，需適性和溶劑蒸發(fā)效率。霧化溫度過低，溶劑蒸發(fā)不全，可能導(dǎo)度過高，可能導(dǎo)致化合物分解，導(dǎo)致待測物響應(yīng)峰面積下降物檢測靈敏度。綜合考慮，選定電霧式檢測器的霧化溫度為50℃。）：）；圖10蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖計(jì)算各個樣品的加標(biāo)回收率。試驗(yàn)表明，采用10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇為提取溶劑時，3種待測物的加標(biāo)回收率均低于40%，采用70%甲醇、90%甲醇為提取溶劑時，3種待測物的加標(biāo)回收率在52.7%~64.8%之間；隨著提取溶劑中水相比例增加，待測物的峰型和響應(yīng)變差；采用甲醇為提取溶劑時，3種待測物的加標(biāo)回收苔素內(nèi)酯、24表蕓苔素內(nèi)酯和28-高蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高依次準(zhǔn)曲線，3種待測物線性曲線圖見圖11，試驗(yàn)結(jié)果表明3種待測物在1μg/mL~20圖113種待測物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖考察方法檢出限和定量限，按3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法根據(jù)實(shí)際樣品檢出濃度情況，稱取空白樣品，分別設(shè)個水平重復(fù)測定六次。按優(yōu)化后的方法進(jìn)行樣品前處理，表828-表高蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號28-表高蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值(μg）添加量/μg測定值/μg15045.93105.36241.31103.74346.25101.22450.6798.57551.7496.45648.29109.58平均/μg/47.36/102.49回收率/%94.72102.49RSD/%8.165.03表924-表蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號24-表蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值/μg添加量/μg測定值/μg15042.5196.27241.8785.35340.9293.48445.6986.36543.74106.25652.6398.47平均/μg/44.56/94.36回收率/%94.36RSD/%9.618.32表1028-高蕓苔素內(nèi)酯加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)表平行樣編號28-高蕓苔素內(nèi)酯測定結(jié)果低水平中水平添加量/μg測定值/μg添加量/μg測定值/μg15041.7389.43247.8585.35352.41443.3983.27549.8480.62644.7578.97平均/μg/46.66/82.96回收率/%93.3282.96RSD/%8.744.75通過對不同樣品的測試，對肥料中蕓苔素內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)誤定差值的絕對值與算術(shù)平均值的比值）。按照相對相差差為20.4%。因此，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果表11重復(fù)性數(shù)據(jù)匯總表樣品編號檢驗(yàn)項(xiàng)目平行1/%平行2/%算術(shù)平均值/%相對相差/%0320-B24-表蕓苔素內(nèi)酯0.00910.00970.00946.428-高蕓苔素內(nèi)酯0.00750.00920.008420.40320-C28-表高蕓苔素內(nèi)酯0.00930.01070.0100320-D24-表蕓苔素內(nèi)酯0.0170.0150.016樣品編號檢驗(yàn)項(xiàng)目平行1/%平行2/%算術(shù)平均值/%相對相差/%28-高蕓苔素內(nèi)酯0.0180.0170.0185.70320-E28-表高蕓苔素內(nèi)酯0.0190.0210.020選擇4個實(shí)際肥料樣品，分別按照選定的試驗(yàn)高效液相色譜-紫外檢測法測定肥料中蕓苔素表12方法比對數(shù)據(jù)匯總表樣品編號檢驗(yàn)項(xiàng)目高效液相色譜-紫外檢測法檢驗(yàn)結(jié)果/%高效液相色譜-電霧式檢測法檢驗(yàn)結(jié)果/%相對相差/%0320-B24-表蕓苔素內(nèi)酯0.00860.00948.928-高蕓苔素內(nèi)酯0.00910.0