絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的保護(hù)機(jī)制探究：基于多維度指標(biāo)的分析一、引言1.1研究背景與意義2型糖尿?。═ype2DiabetesMellitus，T2DM）是一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與胰島素抵抗和胰島素分泌不足有關(guān)。近年來(lái)，隨著人們生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，T2DM的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的數(shù)據(jù)顯示，截止到2045年T2DM全球患病人數(shù)將增加到7.83億，這無(wú)疑給家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。T2DM不僅會(huì)引起糖、脂肪和蛋白質(zhì)等代謝紊亂，導(dǎo)致一系列如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等微血管和大血管并發(fā)癥，越來(lái)越多的研究還表明，其與認(rèn)知功能障礙之間存在緊密聯(lián)系，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。海馬是大腦顳葉內(nèi)側(cè)面的重要腦結(jié)構(gòu)，由CA1-4、齒狀回、下托等亞區(qū)構(gòu)成，與海馬旁回、隔區(qū)、下丘腦及扣帶回等存在廣泛的纖維連接。在學(xué)習(xí)、記憶的形成和鞏固過(guò)程中，海馬起著關(guān)鍵作用，是人類學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的重要神經(jīng)基礎(chǔ)。大量研究表明，海馬是T2DM患者腦損傷的重要靶區(qū)。在T2DM狀態(tài)下，海馬會(huì)出現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變。結(jié)構(gòu)方面，T2DM患者存在雙側(cè)海馬以及其多個(gè)亞區(qū)萎縮，萎縮程度與空腹血糖、胰島素抵抗及學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。功能影像研究顯示，T2DM患者海馬區(qū)腦血流下降，海馬與其他腦區(qū)間的功能連接減低，海馬的神經(jīng)-血流耦合紊亂?；诳臻g工作記憶以及情景記憶編碼任務(wù)的功能磁共振成像（fMRI）研究顯示，T2DM患者空間工作記憶及情景記憶表現(xiàn)的下降與海馬等多個(gè)腦區(qū)的激活下降密切相關(guān)。在沒(méi)有出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的情況下，T2DM患者的海馬結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)屬性已經(jīng)發(fā)生改變，且其全局效率與工作記憶表現(xiàn)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示海馬網(wǎng)絡(luò)屬性的改變影響T2DM患者的記憶行為。這些變化嚴(yán)重影響患者的認(rèn)知功能，導(dǎo)致患者記憶下降、學(xué)習(xí)能力減退等，極大地降低了患者的生活質(zhì)量。胰島素抵抗是T2DM的重要發(fā)病機(jī)制，胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子（INS/IGF）信號(hào)通路功能受損，導(dǎo)致胰島素的靶器官對(duì)胰島素的敏感性降低。INS是由胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生的含有51個(gè)氨基酸的多肽，與胰島素受體（INSR）結(jié)合后可作用于全身所有器官。分子結(jié)構(gòu)與INS類似的胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF），包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）和胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF-2）兩種亞型，除了與IGF-1受體（IGF-1R）結(jié)合外，還可與其高度耦合的酪氨酸激酶受體INSR結(jié)合。INS和IGF1/2與INSR和IGF-1R結(jié)合后，活化的INSR、IGF-1R招募胰島素受體底物（IRS）和SHC蛋白家族，從而引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活I(lǐng)R-IRS-PI3K-AKT通路（PI3K/AKT通路）和IR-SCH-Ras-MEK-MAPK通路（MAPK通路），在肌肉、肝臟及腦等多種組織中發(fā)揮生物學(xué)效能，對(duì)維持機(jī)體能量平衡和代謝、調(diào)控神經(jīng)再生以及腦功能具有重要作用。腦內(nèi)INS和IGF主要來(lái)源于外周血，通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，此外，海馬和下丘腦等區(qū)域也能合成INS和IGF。腦內(nèi)INSR和IGF-1R廣泛分布，但以海馬、大腦皮層、嗅球、下丘腦和小腦等區(qū)域分布為主，對(duì)維持正常神經(jīng)元功能、突觸可塑性及控制腦內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用。研究表明INSR、IGF-1R、IRS2在海馬內(nèi)高表達(dá)，INS/IGF信號(hào)通路對(duì)于維持海馬神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。既往研究表明，INS/IGF信號(hào)通路障礙可引起海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)下降、血糖調(diào)節(jié)紊亂、并促進(jìn)腦組織淀粉樣蛋白-β（Aβ）的產(chǎn)生、Tau蛋白磷酸化以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能損害，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能。絲膠（Sericin）是源于蠶絲的一種天然水溶性蛋白質(zhì)，由18種氨基酸組成，其中絲氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸含量較多。絲膠具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、保濕、抗炎、抗癌、降血糖、降血脂等作用。近年來(lái)，絲膠在糖尿病并發(fā)癥治療中的作用逐漸受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，絲膠在糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變、肝臟損傷、生殖功能障礙、認(rèn)知功能障礙等疾病的治療中療效顯著。承德醫(yī)學(xué)院陳志宏博士所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，蠶繭提取的絲膠可通過(guò)改善糖尿病模型大鼠海馬Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常變化、降低糖尿病模型大鼠海馬和大腦皮質(zhì)血紅素加氧酶1的表達(dá)，減少海馬神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用。深入研究絲膠對(duì)T2DM大鼠海馬損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用方面，T2DM患者數(shù)量龐大，其引發(fā)的認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和家庭社會(huì)負(fù)擔(dān)，目前針對(duì)糖尿病神經(jīng)并發(fā)癥的有效治療手段有限，絲膠作為一種天然產(chǎn)物，若能證實(shí)其對(duì)T2DM海馬損傷的保護(hù)作用，有望為糖尿病神經(jīng)并發(fā)癥的防治提供新的、安全有效的治療策略和藥物選擇，從而改善患者的生活質(zhì)量，減輕社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。從理論價(jià)值來(lái)看，進(jìn)一步探究絲膠對(duì)T2DM大鼠海馬損傷保護(hù)作用的機(jī)制，有助于深入了解糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制，豐富和完善糖尿病及其并發(fā)癥的病理生理學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向，推動(dòng)糖尿病治療領(lǐng)域的理論發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀2型糖尿?。═2DM）對(duì)海馬損傷的研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明，T2DM與海馬損傷之間存在緊密聯(lián)系。在結(jié)構(gòu)方面，大量臨床研究通過(guò)磁共振成像（MRI）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，T2DM患者雙側(cè)海馬及多個(gè)亞區(qū)呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)。一項(xiàng)對(duì)100例T2DM患者和50例健康對(duì)照者的MRI研究顯示，T2DM患者海馬體積明顯小于對(duì)照組，且萎縮程度與空腹血糖水平、胰島素抵抗指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，即血糖越高、胰島素抵抗越嚴(yán)重，海馬萎縮越明顯。在功能層面，功能影像研究利用正電子發(fā)射斷層掃描（PET）等技術(shù)證實(shí)，T2DM患者海馬區(qū)腦血流明顯下降，導(dǎo)致其與其他腦區(qū)間的功能連接減弱，神經(jīng)-血流耦合出現(xiàn)紊亂。這使得海馬在學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的執(zhí)行過(guò)程中無(wú)法與其他腦區(qū)有效協(xié)作，進(jìn)而影響認(rèn)知功能。在探討T2DM導(dǎo)致海馬損傷的機(jī)制方面，胰島素抵抗及INS/IGF信號(hào)通路障礙被認(rèn)為是關(guān)鍵因素。胰島素抵抗使胰島素?zé)o法正常發(fā)揮作用，導(dǎo)致INS/IGF信號(hào)通路受損。INS和IGF與相應(yīng)受體結(jié)合后引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)受阻，無(wú)法有效激活PI3K/AKT通路和MAPK通路。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM模型動(dòng)物海馬組織中INSR、IGF-1R的表達(dá)明顯降低，下游的AKT、ERK等蛋白磷酸化水平下降，這表明信號(hào)通路的傳導(dǎo)受到抑制。這種抑制會(huì)引起海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)下降，破壞神經(jīng)元之間的正常信號(hào)傳遞，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力減退。同時(shí)，信號(hào)通路障礙還會(huì)促進(jìn)腦組織淀粉樣蛋白-β（Aβ）的產(chǎn)生和Tau蛋白磷酸化。Aβ的聚集形成淀粉樣斑塊，Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，它們會(huì)破壞神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致海馬損傷。絲膠作為一種具有多種生物活性的天然蛋白質(zhì)，其相關(guān)研究也在不斷深入。絲膠的生物活性研究涉及多個(gè)領(lǐng)域。在抗氧化方面，體外實(shí)驗(yàn)表明，絲膠能夠顯著清除超氧陰離子自由基、羥自由基等，其作用機(jī)制可能與絲膠中富含的絲氨酸、天門冬氨酸等氨基酸有關(guān)，這些氨基酸能夠提供電子，中和自由基。在抗炎方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，絲膠可降低炎癥模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的水平，通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損傷。在細(xì)胞增殖與分化調(diào)控方面，研究發(fā)現(xiàn)絲膠能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等的增殖和分化，為組織修復(fù)和再生提供支持。近年來(lái)，絲膠在糖尿病治療領(lǐng)域的作用逐漸受到關(guān)注。有研究報(bào)道，絲膠對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有一定的治療效果。在糖尿病腎病方面，對(duì)糖尿病腎病模型大鼠給予絲膠干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)大鼠的尿蛋白、尿素氮、肌酐等腎功能指標(biāo)明顯改善，腎臟組織中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)降低，表明絲膠能夠減輕糖尿病腎病的腎臟損傷。在糖尿病視網(wǎng)膜病變方面，實(shí)驗(yàn)表明絲膠可以改善糖尿病模型動(dòng)物視網(wǎng)膜的微血管病變，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。在糖尿病認(rèn)知功能障礙方面，前期研究已取得一定成果。如承德醫(yī)學(xué)院陳志宏博士團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，蠶繭提取的絲膠灌胃治療糖尿病大鼠后，大鼠血糖水平顯著降低，海馬生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1軸紊亂得到減輕，海馬損傷狀況明顯改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可通過(guò)改善糖尿病模型大鼠海馬Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常變化，使Akt蛋白磷酸化水平升高，激活下游的抗凋亡蛋白，減少海馬神經(jīng)元凋亡；同時(shí)降低糖尿病模型大鼠海馬和大腦皮質(zhì)血紅素加氧酶1的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用。綜上所述，目前T2DM對(duì)海馬損傷的研究已取得一定進(jìn)展，但在發(fā)病機(jī)制和治療手段上仍有深入探索的空間；絲膠的生物活性及對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用研究也為其在糖尿病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但絲膠對(duì)T2DM大鼠海馬損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不完全明確，有待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探討絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。具體而言，通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，給予絲膠干預(yù)，觀察大鼠海馬組織在結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)分子表達(dá)等方面的變化，明確絲膠是否能夠改善2型糖尿病大鼠的海馬損傷狀況。同時(shí)，從胰島素抵抗、INS/IGF信號(hào)通路以及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個(gè)角度，全面解析絲膠發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)治療糖尿病神經(jīng)并發(fā)癥的新型藥物和策略提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在研究思路和方法上。在研究思路方面，目前關(guān)于絲膠對(duì)糖尿病海馬損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究多集中于單一通路或機(jī)制，而本研究綜合考慮胰島素抵抗、INS/IGF信號(hào)通路以及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個(gè)關(guān)鍵因素，從多通路、多角度深入探究絲膠的作用機(jī)制，有助于更全面、系統(tǒng)地揭示絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的保護(hù)作用本質(zhì)，為后續(xù)研究提供更廣闊的思路和更全面的視角。在研究方法上，將采用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和檢測(cè)手段，如蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、免疫組織化學(xué)染色、透射電子顯微鏡觀察等，從分子、細(xì)胞和組織水平多層次、全方位地對(duì)絲膠的保護(hù)作用進(jìn)行研究，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為研究絲膠的保護(hù)作用提供更豐富、更有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。二、絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重200-220g，購(gòu)自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證號(hào)]。大鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(22±2)℃，相對(duì)濕度為(50±10)%，12h光照/12h黑暗交替，自由進(jìn)食和飲水。在適應(yīng)期結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行健康檢查，確保其無(wú)疾病和感染，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)所用的絲膠提取自優(yōu)質(zhì)蠶絲，采用[具體提取方法]進(jìn)行提取，經(jīng)檢測(cè)其純度達(dá)到[X]%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，純度≥98%，用前以無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.2-4.5）現(xiàn)配現(xiàn)用。其他試劑如胰島素、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺等均為分析純，購(gòu)自國(guó)內(nèi)知名試劑公司。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器設(shè)備包括血糖儀（[品牌及型號(hào)]），用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)大鼠血糖水平；全自動(dòng)生化分析儀（[品牌及型號(hào)]），可全面檢測(cè)血液中的各項(xiàng)生化指標(biāo)，如血脂、肝功能、腎功能等；低溫高速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]），能在低溫環(huán)境下高速離心樣本，用于分離血清、血漿等；酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中的吸光度，定量分析各種生物分子的含量；蛋白質(zhì)電泳儀（[品牌及型號(hào)]）和凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（[品牌及型號(hào)]），用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)量；免疫組化染色設(shè)備及顯微鏡成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），用于免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，觀察組織中特定蛋白的分布和表達(dá)情況；透射電子顯微鏡（[品牌及型號(hào)]），用于觀察海馬組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，了解細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)微變化。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的50只SPF級(jí)雄性SD大鼠，按照體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control組，n=10）和造模組（n=40）。造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼料配方為：基礎(chǔ)飼料60%、豬油15%、蔗糖20%、蛋黃粉5%。喂養(yǎng)4周后，造模組大鼠禁食12h（不禁水），然后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），劑量為35mg/kg，用無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.2-4.5）現(xiàn)配現(xiàn)用。正常對(duì)照組大鼠注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ72h后，采用血糖儀檢測(cè)大鼠尾靜脈空腹血糖，選取空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠，判定為2型糖尿病模型成功建立。成模后的造模組大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組（Model組，n=10）、絲膠低劑量組（SL組，n=10）、絲膠中劑量組（SM組，n=10）和絲膠高劑量組（SH組，n=10）。2.3絲膠干預(yù)方式與檢測(cè)指標(biāo)設(shè)定正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠每天給予等體積的生理鹽水灌胃，絲膠低、中、高劑量組大鼠分別給予絲膠0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg灌胃，灌胃體積均為10mL/kg，每天1次，連續(xù)干預(yù)8周。在干預(yù)期間，每周定時(shí)測(cè)量大鼠體重和空腹血糖，觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)等情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用血糖儀檢測(cè)大鼠尾靜脈空腹血糖，以了解血糖控制情況；并采集大鼠血液，離心分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清胰島素、糖化血紅蛋白、血脂（總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）等指標(biāo)，全面評(píng)估大鼠的糖脂代謝狀況。脫頸椎處死后迅速取出大鼠海馬組織，一部分海馬組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的形態(tài)學(xué)變化，包括神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量、排列等情況；進(jìn)行尼氏染色，觀察尼氏小體的分布和數(shù)量，以評(píng)估神經(jīng)元的損傷程度；進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)胰島素受體（INSR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）、胰島素受體底物2（IRS2）、p-AKT、p-ERK等蛋白的表達(dá)和分布情況。另一部分海馬組織置于液氮中速凍后，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)海馬組織中INSR、IGF-1R、IRS2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、Bax、Bcl-2、Caspase-3等蛋白的表達(dá)水平；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)海馬組織中INSR、IGF-1R、IRS2、Bax、Bcl-2、Caspase-3等基因的mRNA表達(dá)水平。還有一部分海馬組織用于透射電子顯微鏡觀察，將海馬組織切成1mm3大小的組織塊，經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，在透射電子顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等細(xì)胞器的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。三、絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)的影響3.1病理切片觀察對(duì)正常對(duì)照組、糖尿病模型組和絲膠治療組（低、中、高劑量）大鼠海馬組織進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)變化。正常對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常。海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回的神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密且整齊，呈典型的錐形或梭形，胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)均勻淡染，細(xì)胞之間界限清晰，無(wú)明顯的細(xì)胞損傷或炎癥反應(yīng)跡象。糖尿病模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯的病理改變。神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，層次結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞間隙明顯增寬。許多神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積縮小，胞體皺縮，呈三角形或不規(guī)則形，胞核固縮深染，部分細(xì)胞核偏位，甚至出現(xiàn)核碎裂現(xiàn)象。細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，尤其是在CA1區(qū)和CA3區(qū)，神經(jīng)元丟失較為嚴(yán)重，提示糖尿病導(dǎo)致了海馬神經(jīng)元的損傷和死亡。同時(shí)，可見(jiàn)組織中有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍有水腫現(xiàn)象，表明糖尿病引發(fā)了海馬組織的炎癥反應(yīng)和局部微循環(huán)障礙。絲膠治療組大鼠海馬組織的病理?yè)p傷程度明顯減輕，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。絲膠低劑量組，部分神經(jīng)元形態(tài)有所改善，細(xì)胞排列較模型組稍顯整齊，但仍存在一些細(xì)胞形態(tài)異常和排列紊亂的情況，細(xì)胞數(shù)量減少的情況有所緩解，但改善程度相對(duì)有限。絲膠中劑量組，神經(jīng)元排列進(jìn)一步趨于整齊，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，胞核形態(tài)較為規(guī)則，核仁可見(jiàn)，細(xì)胞間隙變窄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，血管周圍水腫減輕，海馬組織的整體結(jié)構(gòu)和形態(tài)有了明顯的改善。絲膠高劑量組，海馬組織結(jié)構(gòu)接近正常對(duì)照組，神經(jīng)元排列緊密整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，胞核清晰，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，炎癥反應(yīng)和水腫基本消失，表明高劑量的絲膠對(duì)糖尿病大鼠海馬組織的保護(hù)作用更為顯著，能夠有效減輕糖尿病對(duì)海馬組織的損傷。3.2神經(jīng)元計(jì)數(shù)分析為了進(jìn)一步量化絲膠對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，在顯微鏡下對(duì)海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。在400倍顯微鏡下，每個(gè)大鼠海馬切片隨機(jī)選取3個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)形態(tài)完整、胞核清晰的神經(jīng)元數(shù)量。對(duì)每個(gè)標(biāo)本取3張連續(xù)切片進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終取其平均值作為該大鼠海馬特定區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密且形態(tài)完整。糖尿病模型組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明糖尿病的發(fā)生導(dǎo)致了海馬神經(jīng)元的大量丟失，與病理切片觀察到的神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)量減少的結(jié)果一致。絲膠治療組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量較糖尿病模型組均有不同程度的增加，且呈現(xiàn)劑量依賴性。絲膠低劑量組神經(jīng)元數(shù)量雖有增加，但與糖尿病模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。絲膠中劑量組和高劑量組神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且絲膠高劑量組的神經(jīng)元數(shù)量增加更為明顯，接近正常對(duì)照組水平。這充分說(shuō)明絲膠能夠有效減少糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的丟失，促進(jìn)神經(jīng)元的存活，對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用，且高劑量絲膠的保護(hù)效果更為顯著。四、絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)4.1凋亡相關(guān)蛋白采用Westernblot法對(duì)正常對(duì)照組、糖尿病模型組以及絲膠低、中、高劑量組大鼠海馬組織中的凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。Bax是一種促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2則是一種抗凋亡蛋白，可通過(guò)抑制線粒體膜電位的下降、阻止細(xì)胞色素C的釋放等機(jī)制，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠海馬組織中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)水平則明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05）。這表明在糖尿病狀態(tài)下，海馬神經(jīng)元的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡，促凋亡作用增強(qiáng)，抗凋亡作用減弱，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元更容易發(fā)生凋亡，這與之前觀察到的糖尿病模型組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、病理?yè)p傷明顯的結(jié)果相呼應(yīng)。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中Bax蛋白的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸降低，其中絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。絲膠低劑量組雖然也能使Bax蛋白表達(dá)降低、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這充分說(shuō)明絲膠能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用，且這種作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量絲膠的調(diào)節(jié)效果更為顯著。4.2氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法對(duì)正常對(duì)照組、糖尿病模型組以及絲膠低、中、高劑量組大鼠海馬組織中的超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量進(jìn)行檢測(cè)。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過(guò)氧化氫，從而清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，維持氧化還原平衡。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可以反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度，即氧化應(yīng)激水平的高低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠海馬組織中SOD活性顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），而MDA含量則明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）。這表明在糖尿病狀態(tài)下，海馬組織的抗氧化能力下降，自由基大量產(chǎn)生，引發(fā)了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞受到氧化損傷，這與糖尿病導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程密切相關(guān)。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中SOD活性隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，其中絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，MDA含量隨著絲膠劑量的增加而逐漸降低，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。絲膠低劑量組雖然也能使SOD活性升高、MDA含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這充分說(shuō)明絲膠能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高SOD活性，增強(qiáng)抗氧化能力，減少自由基的產(chǎn)生，降低MDA含量，減輕氧化應(yīng)激對(duì)海馬組織的損傷，且這種作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量絲膠的調(diào)節(jié)效果更為顯著。4.3神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）對(duì)正常對(duì)照組、糖尿病模型組以及絲膠低、中、高劑量組大鼠海馬組織中的谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）等神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，在糖尿病等病理狀態(tài)下，Glu的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，過(guò)多的Glu釋放會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度興奮，引發(fā)興奮性毒性損傷。GABA則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，維持神經(jīng)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。GABA功能異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，在糖尿病導(dǎo)致的海馬損傷中，GABA能系統(tǒng)也受到明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠海馬組織中Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體（如EAAT2）的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），這使得Glu的攝取和清除能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞間隙中Glu大量堆積。同時(shí)，Glu受體（如NMDA受體）的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），進(jìn)一步增強(qiáng)了神經(jīng)元對(duì)Glu的敏感性，加劇了興奮性毒性損傷，這與糖尿病模型組海馬神經(jīng)元損傷、凋亡增加的結(jié)果相符合。在GABA能系統(tǒng)方面，糖尿病模型組大鼠海馬組織中GABA合成酶（如GAD65、GAD67）的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），導(dǎo)致GABA的合成減少；GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體（如GAT1）的表達(dá)水平也降低（P<0.05），影響了GABA的再攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，使得GABA的抑制性作用減弱。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中EAAT2的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，其中絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這有助于增強(qiáng)對(duì)Glu的攝取和清除，減少Glu的興奮性毒性。同時(shí)，NMDA受體的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸降低，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），降低了神經(jīng)元對(duì)Glu的敏感性，減輕了興奮性損傷。在GABA能系統(tǒng)中，絲膠治療組大鼠海馬組織中GAD65、GAD67的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），促進(jìn)了GABA的合成；GAT1的表達(dá)水平也逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），增強(qiáng)了GABA的轉(zhuǎn)運(yùn)和再攝取，從而提高了GABA的抑制性作用，維持神經(jīng)系統(tǒng)的平衡。絲膠低劑量組雖然也能使相關(guān)蛋白表達(dá)有所改變，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明絲膠能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善Glu和GABA的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和抑制性平衡，對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元起到保護(hù)作用，且這種作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量絲膠的調(diào)節(jié)效果更為顯著。五、絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬相關(guān)基因表達(dá)的影響5.1RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，對(duì)正常對(duì)照組、糖尿病模型組以及絲膠低、中、高劑量組大鼠海馬組織中的凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl-2）、氧化應(yīng)激相關(guān)基因（如SOD1、CAT等）、神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因（如EAAT2、GAD65等）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在凋亡相關(guān)基因方面，糖尿病模型組大鼠海馬組織中Bax基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)水平則明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），這表明糖尿病狀態(tài)下，海馬組織中促凋亡基因表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡傾向增強(qiáng)。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中Bax基因的mRNA表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸降低，其中絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。絲膠低劑量組雖也能使Bax基因表達(dá)降低、Bcl-2基因表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明絲膠能夠在基因水平上調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用，且這種作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在氧化應(yīng)激相關(guān)基因方面，糖尿病模型組大鼠海馬組織中SOD1、CAT等抗氧化酶基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），表明糖尿病導(dǎo)致海馬組織抗氧化基因表達(dá)減少，抗氧化能力下降。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中SOD1、CAT基因的mRNA表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，其中絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示絲膠能夠促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)糖尿病大鼠海馬組織的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷。絲膠低劑量組雖也能使抗氧化酶基因表達(dá)有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因方面，糖尿病模型組大鼠海馬組織中EAAT2基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），導(dǎo)致谷氨酸攝取和清除能力下降；而GAD65基因的mRNA表達(dá)水平也明顯降低（P<0.05），影響γ-氨基丁酸的合成。與糖尿病模型組相比，絲膠治療組大鼠海馬組織中EAAT2基因的mRNA表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），有助于恢復(fù)谷氨酸的正常代謝；GAD65基因的mRNA表達(dá)水平也逐漸升高，絲膠中劑量組和高劑量組與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），促進(jìn)γ-氨基丁酸的合成，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和抑制性平衡。絲膠低劑量組雖也能使相關(guān)基因表達(dá)有所改變，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。5.2基因表達(dá)與蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析為了深入探究絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。采用Pearson相關(guān)性分析方法，分別對(duì)凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl-2）、氧化應(yīng)激相關(guān)基因（SOD1、CAT等）、神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因（EAAT2、GAD65等）的mRNA表達(dá)水平與其對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。在凋亡相關(guān)基因和蛋白方面，結(jié)果顯示Bax基因的mRNA表達(dá)水平與Bax蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值1]，P<0.01），這表明在轉(zhuǎn)錄水平上Bax基因表達(dá)的上調(diào)能夠有效促進(jìn)其蛋白表達(dá)的增加，進(jìn)而增強(qiáng)促凋亡作用。而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)水平與Bcl-2蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值2]，P<0.01），即Bcl-2基因表達(dá)的升高會(huì)促使其蛋白表達(dá)相應(yīng)增多，增強(qiáng)抗凋亡能力。絲膠干預(yù)后，隨著B(niǎo)ax基因mRNA表達(dá)水平的降低，Bax蛋白表達(dá)水平也隨之下降；同時(shí)，Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平也升高，進(jìn)一步證實(shí)了絲膠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響其蛋白表達(dá)，發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用。在氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白方面，SOD1基因的mRNA表達(dá)水平與SOD活性呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值3]，P<0.01），說(shuō)明SOD1基因表達(dá)的增加能夠有效提高SOD酶的合成，增強(qiáng)抗氧化能力。CAT基因的mRNA表達(dá)水平與CAT酶活性也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值4]，P<0.01）。絲膠干預(yù)后，SOD1、CAT基因mRNA表達(dá)水平升高，相應(yīng)的酶活性也增強(qiáng)，表明絲膠能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高抗氧化酶的活性，減輕氧化應(yīng)激損傷。在神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因和蛋白方面，EAAT2基因的mRNA表達(dá)水平與EAAT2蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值5]，P<0.01），GAD65基因的mRNA表達(dá)水平與GAD65蛋白表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值6]，P<0.01）。絲膠干預(yù)使EAAT2、GAD65基因mRNA表達(dá)水平升高，相應(yīng)蛋白表達(dá)也增加，表明絲膠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，影響其蛋白的合成，從而改善神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和抑制性平衡。綜上所述，基因表達(dá)與蛋白表達(dá)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的保護(hù)作用是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)和功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從分子層面進(jìn)一步揭示了絲膠的保護(hù)機(jī)制。六、絲膠保護(hù)作用機(jī)制的綜合分析6.1抗凋亡機(jī)制探討在糖尿病狀態(tài)下，海馬神經(jīng)元面臨著較高的凋亡風(fēng)險(xiǎn)，這與多種因素導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，這一變化打破了細(xì)胞內(nèi)促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡，使得細(xì)胞凋亡程序被激活。Bax作為促凋亡蛋白，可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它能夠與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9又可激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)cl-2作為抗凋亡蛋白，可通過(guò)抑制Bax的寡聚化、阻止線粒體膜電位的下降以及抑制細(xì)胞色素C的釋放等機(jī)制，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2表達(dá)減少時(shí)，其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，細(xì)胞更容易受到凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)。絲膠干預(yù)后，大鼠海馬組織中Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明絲膠能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡。絲膠可能通過(guò)多種信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)這一調(diào)節(jié)作用。一方面，絲膠可能激活了PI3K/AKT信號(hào)通路。在正常生理狀態(tài)下，胰島素與其受體結(jié)合后，激活PI3K，PI3K使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)KT?；罨腁KT可通過(guò)磷酸化多種底物來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。AKT可磷酸化Bax，使其失活，從而抑制Bax誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。AKT還可磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，促進(jìn)Bcl-2與Bad的解離，增強(qiáng)Bcl-2的抗凋亡功能。另一方面，絲膠可能調(diào)節(jié)了MAPK信號(hào)通路。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路中的JNK和p38MAPK被激活后，可促進(jìn)Bax的表達(dá)和活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而ERK1/2的激活通常具有抗凋亡作用。絲膠可能通過(guò)抑制JNK和p38MAPK的激活，同時(shí)促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，從而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡。從基因水平來(lái)看，絲膠能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)，與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。這進(jìn)一步證實(shí)了絲膠在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)凋亡相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，從而影響蛋白的合成，發(fā)揮抗凋亡作用?；虮磉_(dá)與蛋白表達(dá)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，Bax基因的mRNA表達(dá)水平與Bax蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平與Bcl-2蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。絲膠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)和功能，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷起到保護(hù)作用。6.2抗氧化應(yīng)激機(jī)制探討在糖尿病狀態(tài)下，機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致大量活性氧（ROS）產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激。海馬組織富含多不飽和脂肪酸，對(duì)氧化應(yīng)激極為敏感。糖尿病時(shí)，海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)酶類失衡，抗氧化酶活性降低，氧化產(chǎn)物堆積。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病模型組大鼠海馬組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，表明氧化應(yīng)激水平明顯增強(qiáng)。SOD活性降低，使其清除超氧陰離子自由基的能力下降，導(dǎo)致自由基在細(xì)胞內(nèi)大量積累。這些自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量MDA。MDA具有細(xì)胞毒性，會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。同時(shí)，自由基還可攻擊蛋白質(zhì)和核酸，影響細(xì)胞的正常代謝和功能。絲膠干預(yù)后，大鼠海馬組織中SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明絲膠能夠有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，減輕氧化損傷。絲膠中富含的多種氨基酸可能在抗氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。絲氨酸殘基上的羥基具有供氫能力，能夠與自由基結(jié)合，使其穩(wěn)定，從而清除自由基。天門冬氨酸等酸性氨基酸可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，有利于抗氧化酶的活性發(fā)揮。絲膠可能通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)和活性。在正常情況下，Nrf2與Keap1結(jié)合，處于細(xì)胞質(zhì)中，處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)一系列抗氧化酶基因（如SOD、CAT、GSH-Px等）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。絲膠可能通過(guò)某種機(jī)制激活Nrf2，促進(jìn)其入核，進(jìn)而上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高SOD等抗氧化酶的活性。從基因水平來(lái)看，絲膠能夠上調(diào)SOD1等抗氧化酶基因的mRNA表達(dá)，與蛋白水平的變化一致。這表明絲膠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)，從而增加抗氧化酶的合成，增強(qiáng)抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對(duì)海馬組織的損傷?；虮磉_(dá)與蛋白表達(dá)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，SOD1基因的mRNA表達(dá)水平與SOD活性呈顯著正相關(guān)。絲膠通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)和功能，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷起到保護(hù)作用。6.3調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)機(jī)制探討神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在大腦的正常功能中起著至關(guān)重要的作用，其平衡對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定和正常的神經(jīng)傳遞至關(guān)重要。在2型糖尿病狀態(tài)下，海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)會(huì)發(fā)生顯著變化，這種變化與海馬損傷以及認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病模型組大鼠海馬組織中谷氨酸（Glu）轉(zhuǎn)運(yùn)體（如EAAT2）的表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致Glu攝取和清除能力下降，細(xì)胞間隙中Glu大量堆積。同時(shí)，Glu受體（如NMDA受體）的表達(dá)水平明顯升高，使得神經(jīng)元對(duì)Glu的敏感性增強(qiáng)，過(guò)度激活的NMDA受體引發(fā)了一系列細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。過(guò)多的Glu與NMDA受體結(jié)合，導(dǎo)致鈣離子大量?jī)?nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。這會(huì)激活一系列鈣依賴性蛋白酶，如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和鈣蛋白酶等，這些酶會(huì)破壞細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。此外，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載還會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），進(jìn)一步損傷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。在γ-氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng)方面，糖尿病模型組大鼠海馬組織中GABA合成酶（如GAD65、GAD67）的表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致GABA的合成減少；GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體（如GAT1）的表達(dá)水平也降低，影響了GABA的再攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，使得GABA的抑制性作用減弱。這種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的失衡打破了神經(jīng)元興奮性和抑制性的平衡，使得神經(jīng)元更容易受到損傷，進(jìn)而導(dǎo)致海馬功能受損，影響學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能。絲膠干預(yù)后，能夠顯著調(diào)節(jié)糖尿病大鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的失衡狀態(tài)。絲膠治療組大鼠海馬組織中EAAT2的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，增強(qiáng)了對(duì)Glu的攝取和清除能力，減少了細(xì)胞間隙中Glu的堆積，從而降低了Glu的興奮性毒性。同時(shí)，NMDA受體的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸降低，降低了神經(jīng)元對(duì)Glu的敏感性，減輕了因Glu過(guò)度刺激導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。在GABA能系統(tǒng)中，絲膠治療組大鼠海馬組織中GAD65、GAD67的表達(dá)水平隨著絲膠劑量的增加而逐漸升高，促進(jìn)了GABA的合成；GAT1的表達(dá)水平也逐漸升高，增強(qiáng)了GABA的轉(zhuǎn)運(yùn)和再攝取，提高了GABA的抑制性作用，恢復(fù)了神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和抑制性平衡。絲膠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的機(jī)制可能與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。絲膠可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。激活的AKT可以磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如CREB等，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)中，CREB可能參與調(diào)節(jié)EAAT2、GAD65等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。絲膠還可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路來(lái)影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。MAPK信號(hào)通路包括ERK1/2、JNK和p38MAPK等多條途徑，它們?cè)诩?xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在糖尿病狀態(tài)下，MAPK信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)失調(diào)。絲膠可能通過(guò)抑制JNK和p38MAPK的激活，同時(shí)促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能。從基因水平來(lái)看，絲膠能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因（如EAAT2、GAD65等）的mRNA表達(dá)，與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。這表明絲膠在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，從而影響蛋白的合成，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)?；虮磉_(dá)與蛋白表達(dá)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，EAAT2基因的mRNA表達(dá)水平與EAAT2蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，GAD65基因的mRNA表達(dá)水平與GAD65蛋白表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)。絲膠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)和功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷起到保護(hù)作用。七、結(jié)論與展望7.1研究成果總結(jié)本研究通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，深入探究了絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果表明，絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠海馬損傷具有顯著的保護(hù)