3 3 3 3 4 4 6 13 一、申請(qǐng)人名稱(chēng)北京卓誠(chéng)惠生生物科技股份有限公司二、申請(qǐng)人住所北京市昌平區(qū)生命科學(xué)園科學(xué)園路37號(hào)院1號(hào)樓C座101室三、生產(chǎn)地址一、產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分試劑盒的主要組成成分見(jiàn)下表12引物探針混合液肺炎鏈球菌、流感嗜血桿NC肺鏈?zhǔn)妊ㄋ?（二）產(chǎn)品預(yù)期用途本試劑盒用于體外定性檢測(cè)人痰液樣本中的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的核酸DNA。本試劑盒用于下呼吸道感染人群的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌感染的輔助診斷，不能單獨(dú)作為確診或排除肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae，SP）、流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae，HI）和卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis，MC）是常見(jiàn)的條件致病菌，準(zhǔn)確及時(shí)的檢測(cè)對(duì)于患者診療具有非常重要的臨床意義。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格24人份/盒、48人份/盒。試劑盒分別選取肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌基因組中相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增過(guò)程中，探針與模板結(jié)合，其59端報(bào)告基團(tuán)被Taq酶59→39外切核酸酶活性切斷，使報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光定量PCR儀器根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)自動(dòng)繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，并計(jì)算出樣本Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。引物探針混合液中分別使用FAM、VIC、CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌探針，在同一體系中可同時(shí)進(jìn)行以上三種細(xì)菌核酸的定性檢測(cè)。二、臨床前研究概述（一）主要原材料UDG酶、滅活工程菌。這些原材料均為外購(gòu)方式獲得。引物、探針為申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后由專(zhuān)業(yè)合成公司合成。選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料，通過(guò)功能性試驗(yàn)，篩選出最佳原材料和供應(yīng)商，制定了各主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品。參考品組成如下：陽(yáng)性參考品：20份，由試劑盒檢測(cè)病原菌不同型別的病原體培養(yǎng)物組成。陰性參考品：9份，由試劑盒檢測(cè)范圍外的病原體培養(yǎng)物精密度參考品：3份，包含中強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性濃度水平的檢測(cè)限參考品：10份，由試劑盒檢測(cè)病原菌不同型別的病試劑盒包含強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照品、弱陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品各1支，用于檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制。（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究通過(guò)對(duì)試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。申請(qǐng)人對(duì)樣本中可能存在的抑制因素進(jìn)行了測(cè)試，并對(duì)樣本核dN(U)TP、Mg離子等原材料的濃度和體積進(jìn)行了優(yōu)化；對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括樣本采集處理、UDG酶消化時(shí)間、變性時(shí)間、退火和延伸溫度、循環(huán)數(shù)的選擇等，并通過(guò)驗(yàn)證最終確定了最佳反應(yīng)體系。（三）分析性能評(píng)估分析性能評(píng)估內(nèi)容主要包括：核酸分離純化性能、準(zhǔn)確度、精密度、最低檢出限、分析特異性、包容性研究等。申請(qǐng)人提交了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品，在適用機(jī)型上的性能評(píng)估資料。在核酸分離純化性能研究中，評(píng)估了產(chǎn)品配套使用的核酸提取試劑的提取性能，采用不同的核酸提取試劑及痰液消化液，使用不同濃度、型別的臨床陽(yáng)性樣本進(jìn)行提取效率、核酸純度等研究，結(jié)果表明配套使用的痰液消化液和核酸提取試劑盒可滿足產(chǎn)品使用需求。在準(zhǔn)確度研究中，申請(qǐng)人采用三批成品試劑盒，檢測(cè)企業(yè)參考品，結(jié)果符合要求。同時(shí)采用對(duì)比方法驗(yàn)證臨床陽(yáng)性樣本和陰性樣本，結(jié)果表明陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為100%。在精密度研究中，申請(qǐng)人采用三批成品試劑盒，對(duì)精密度參考品以及不同濃度的陽(yáng)性臨床樣本及陰性樣本，進(jìn)行20天的重復(fù)性檢測(cè)，評(píng)估了重復(fù)性（日內(nèi)/批內(nèi)精密度）、批間差（日內(nèi)/批間精密度）、中間精密度（批內(nèi)/日間精密度、批間/日間精密度、室間/不同操作者精密度）和再現(xiàn)性（不同時(shí)間/不同操作人員/不同實(shí)驗(yàn)室/不同試劑批次）的精密度。結(jié)果顯示：Ct值變異系數(shù)（CV，%）均在可接受范圍內(nèi)，試劑盒精密度良好。在最低檢出限研究中，申請(qǐng)人采用三批成品試劑盒，檢測(cè)系列濃度梯度樣本，將達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢出限，并進(jìn)行最低檢出限驗(yàn)證。最終確定試劑盒的肺炎鏈球菌最低檢出限為100CFU/mL，流感嗜血桿菌最低檢出限為1250CFU/mL，卡他莫拉菌最低檢出限為1000CFU/mL。在包容性研究中，申請(qǐng)人對(duì)收集的不同來(lái)源的各檢測(cè)病原菌的不同型別的陽(yáng)性樣本進(jìn)行研究，肺炎鏈球菌包括1、2、3、35F型，流感嗜血桿菌包括有莢膜型a、有莢膜型b、有莢膜型c、有莢膜型d、有莢膜型e、有莢膜型f、無(wú)莢膜型，卡他莫拉菌包括BRO-1型、BRO-2型。結(jié)果表明試劑盒對(duì)不同型別的病原體均能正確檢出，試劑盒包容性良好。在特異性研究中，申請(qǐng)人采用三批成品試劑盒，選取與檢測(cè)目標(biāo)核酸序列具有同源性病原體、近源菌、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體作為交叉反應(yīng)研究對(duì)象。結(jié)果表明：針對(duì)可能與檢測(cè)樣本產(chǎn)生交叉的其他病原菌（濃度水平為106CFU/mL~107CFU/mL的銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、百日咳桿菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、表皮葡萄球菌、諾卡菌、檸檬酸桿菌、唾液鏈球菌、化膿性鏈球菌、副流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、白色念珠菌、黃曲霉菌、新型隱球菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、緩癥鏈球菌、嵴鏈球菌、副溶血嗜血桿菌、杜克嗜血桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、產(chǎn)氣克雷伯菌、口腔鏈球菌、溶血嗜血桿菌；濃度水平為106PFU/mL的甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、EB病毒、腸道病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人鼻病毒、腺病毒；濃度水平為107copies/mL的耶氏肺孢子菌、新型冠狀病毒），無(wú)交叉反應(yīng)。試劑盒目標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)病原微生物的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明除了目標(biāo)病原體對(duì)應(yīng)的通道檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性外，其余非目標(biāo)病原體通道均為陰性，表明試劑盒內(nèi)的三種病原體之間無(wú)交叉，試劑盒特異性良好。在干擾性研究中，申請(qǐng)人采用三批成品試劑盒，進(jìn)行了內(nèi)源/外源干擾物質(zhì)研究，對(duì)樣本中可能含有的干擾物質(zhì)分別進(jìn)行人基因組DNA、15%唾液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未產(chǎn)生顯著影響；針對(duì)106CFU/mL濃度水平的口腔細(xì)菌：唾液鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、乳酸桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，針對(duì)治療呼吸道感染的抗菌藥物：阿奇霉素、頭孢地尼、慶大霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿莫西林、利巴韋林、奧司他韋、多西環(huán)素、羥甲唑啉、氯化鈉（0.45%）、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、氟康唑、腎上腺素、倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松、莫匹羅星、鹽酸組胺、妥布霉素進(jìn)行驗(yàn)證，均未對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。同時(shí)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性干擾研究，檢測(cè)結(jié)果表明：高濃度病原對(duì)低濃度的病原檢測(cè)無(wú)影響，混合感染樣本之間不會(huì)相互干擾檢（四）陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間研究對(duì)收集的不同地域、不同來(lái)源的417例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，包括各病原菌的不同型別、不同濃度的臨床樣本，獲得原始的Ct值用于制定各指標(biāo)的陽(yáng)性判斷值。對(duì)于含有陽(yáng)性和陰性數(shù)據(jù)的指標(biāo)，采用ROC曲線法制定各指標(biāo)的陽(yáng)性判斷值。并進(jìn)行了陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果最終確定了試劑盒的陽(yáng)性判斷值：試劑盒肺炎鏈球菌的陽(yáng)性判斷值為Ct=36，流感嗜血桿菌的陽(yáng)性判斷值為Ct=36，卡他莫拉菌的陽(yáng)性判斷值為Ct=36。（五）穩(wěn)定性研究對(duì)實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性以及樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時(shí)間。實(shí)時(shí)穩(wěn)定性：試劑盒儲(chǔ)存于-20℃±5℃。使用三批試劑分別于不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其外觀、陰陽(yáng)性符合率、最低檢出限和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果表明試劑盒在-20℃±5℃條件下，試劑盒有效期為12個(gè)月。申請(qǐng)人對(duì)產(chǎn)品的開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性以及樣本穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均能滿足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的聲稱(chēng)。三、臨床評(píng)價(jià)概述申請(qǐng)人在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、長(zhǎng)治市人民醫(yī)院、上海市肺科醫(yī)院共3家機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。入組病例為下呼吸道感染人群（包括肺炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病等樣本類(lèi)型為痰液。針對(duì)肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌采用試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床參考方法一代測(cè)序法進(jìn)行比較確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床性能；針對(duì)肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌還采用試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比較確認(rèn)產(chǎn)品臨床針對(duì)與一代測(cè)序進(jìn)行對(duì)比的研究，臨床試驗(yàn)共計(jì)入組病例729例，其中肺炎鏈球菌陽(yáng)性病例190例，流感嗜血桿菌陽(yáng)性病例192例，卡他莫拉菌陽(yáng)性病例173例。肺炎鏈球菌陽(yáng)性符合率為100%（95%CI：98.08%，100%），陰性符合率為99.81%（95%CI：98.97，100%）；流感嗜血桿菌陽(yáng)性符合率為100%（95%CI：98.10%，100%），陰性符合率為99.81%（95%CI：98.97%，100%）；卡他莫拉菌陽(yáng)性符合率為100%（95%CI：臨床試驗(yàn)顯示試驗(yàn)體外診斷試劑與參考方法檢測(cè)結(jié)果一致性較針對(duì)與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行的比對(duì)研究，臨床試驗(yàn)共計(jì)入組病例349例，其中肺炎鏈球菌陽(yáng)性病例109例，流感嗜血桿菌陽(yáng)性病例112例。肺炎鏈球菌陽(yáng)性符合率為100%（95%CI：96.67%，100%），陰性符合率為99.17%（95%CI：97.02%，99.90%流感嗜血桿菌陽(yáng)性符合率為100%（95%100%），陰性符合率為99.16%（95%CI：96.99%，99.90%）。臨床試驗(yàn)顯示試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果一致性較好。同時(shí)針對(duì)卡他莫拉菌的檢測(cè)，申請(qǐng)人開(kāi)展了試驗(yàn)體外診斷試劑與卡他莫拉菌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的比較研究，共入組297例，臨床診斷為陽(yáng)性的病例75例，臨床診斷為陰性的病例222例。靈敏度為100%（95%CI：95.20%，100%），特異度為90.54%（95%CI：85.90%，94.05%）。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)符合《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定申請(qǐng)人對(duì)已知危險(xiǎn)（源）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，按照風(fēng)險(xiǎn)可接受準(zhǔn)則判斷每個(gè)危險(xiǎn)（源）的風(fēng)險(xiǎn)是否達(dá)到可接受水平，對(duì)合理可行降低的風(fēng)險(xiǎn)、不經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)/收益分析既判定為不可接受的風(fēng)險(xiǎn)采取控制措施，并對(duì)具體措施進(jìn)行實(shí)施驗(yàn)證，同時(shí)重新對(duì)采取措施后的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行估計(jì)，確認(rèn)其風(fēng)險(xiǎn)水平是否可接受。但為保證用械安全，基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避，需要在說(shuō)明書(shū)中提示以下信息：1.開(kāi)始檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)，本品僅用于體外診斷，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用。2.試劑保存運(yùn)輸及使用過(guò)程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過(guò)程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第739號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)對(duì)申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),申報(bào)產(chǎn)品符合安全性、有效性的要求，符合現(xiàn)有認(rèn)知水平，建議準(zhǔn)予注冊(cè)。附件：產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)肺炎鏈球菌/流感嗜血桿菌/卡他莫拉菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)本試劑盒用于體外定性檢測(cè)人痰液樣本中的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae，SP）、流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae，HI）和卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis，MC）是常見(jiàn)的條件致病菌，準(zhǔn)確及時(shí)的檢性切斷，使報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光定量PCR儀器根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)自動(dòng)繪制出實(shí)時(shí)CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌探針，在同一體系中可同時(shí)本試劑盒反應(yīng)體系含有dUTP-UDG防污染措施，可以有效地防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擴(kuò)增12+，聚合酶，UDG酶2及內(nèi)標(biāo)的引物探針NC400μL400μL400μL400μL400μL400μL12采用干冰和冰袋密封運(yùn)輸，運(yùn)輸溫度不高于0℃,運(yùn)輸時(shí)間不宜超過(guò)5天。采用無(wú)菌痰液樣本收集盒?；颊吡羧〉奶狄簶颖荆瑧?yīng)由檢驗(yàn)人員或經(jīng)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員目視檢查樣本質(zhì)量：樣本量一般在3~5mL，如為唾液樣本等不合格樣本，應(yīng)在專(zhuān)業(yè)人員的進(jìn)一步指導(dǎo)下取樣試劑盒使用前將所需組分提前取出，室溫融化，短暫震蕩取強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和處理后的待測(cè)樣本各200μL進(jìn)行提取，具體按N個(gè)（N=待測(cè)樣本數(shù)+強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照+弱陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照）反應(yīng)配制體系，反應(yīng)體系35μL×N5μL×N40μL×N將上述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管40為50μL。蓋緊PCR反應(yīng)管管蓋，瞬時(shí)離心將管壁上液對(duì)應(yīng)內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)質(zhì)控。ABI7500儀器中“QuencherDye”和“PassiveReference”均設(shè)置為None。按照樣本對(duì)應(yīng)順序設(shè)置強(qiáng)陽(yáng)和弱陽(yáng)性對(duì)照（PositiveControl）、陰性對(duì)照（NegativeControl）和樣本（Unknown并設(shè)置樣本名稱(chēng)。程序設(shè)置如下：溫度(℃)112陽(yáng)性判斷值通過(guò)對(duì)417例臨床樣本的檢球菌的陽(yáng)性判斷值為Ct=36，流感嗜血桿菌的陽(yáng)性判斷值為Ct=36，卡他莫拉菌的VIC），36則判定對(duì)應(yīng)目標(biāo)結(jié)果為陰性。（a）采樣不合格，建議重新采樣檢測(cè)b）核酸提取過(guò)程異常，導(dǎo)致核酸損失，建議重新提取檢測(cè)c）樣本中存在抑制1.本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀、體征、病史、其它實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情2.本試劑盒檢測(cè)的靶序列為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌基因的保守區(qū)域，待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)?.有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析3.1如果樣本在運(yùn)輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉4.有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析4.1不合理樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，檢測(cè)樣本中被檢測(cè)核酸濃度含量低于最低檢出限時(shí)均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。4.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR床樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，其重復(fù)性、批間差、中間精密度和再現(xiàn)性良好，各5.交叉反應(yīng)：針對(duì)可能與檢測(cè)樣本產(chǎn)生交叉的其他病原菌（濃度水平為毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人鼻病毒、腺病毒；濃度水平為107c針對(duì)106CFU/mL濃度水平的口腔細(xì)菌：唾液鏈球菌、金黃色葡萄球羥甲唑啉（25ng/mL）、氯化鈉（0.45%）、萬(wàn)古霉素（60μg/mL）、利奈唑胺（30μg/mL）、氟康唑（10μg/mL）素（0.96mg/mL）、倍氯米松（400μg）、地塞米松（0.96mg/mL）、氟尼縮松（17.