TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義鎘作為一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬污染物，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。自然環(huán)境中的鎘，如巖石風(fēng)化等過(guò)程會(huì)使其在土壤、水體中有所分布；而人類(lèi)活動(dòng)，像金屬冶煉、電鍍、電池制造以及含鎘農(nóng)藥和化肥的使用等，更是顯著增加了鎘在環(huán)境中的含量。近年來(lái)，鎘污染事件頻發(fā)，如20世紀(jì)日本富山縣發(fā)生的“痛痛病”事件，便是由于長(zhǎng)期食用被鎘污染的稻米，導(dǎo)致鎘在人體內(nèi)蓄積，引發(fā)腎功能障礙、骨質(zhì)疏松等一系列嚴(yán)重健康問(wèn)題，這使得鎘污染受到了廣泛關(guān)注。人類(lèi)接觸鎘的途徑多種多樣，主要包括食用受污染的食物、吸入含鎘的空氣以及皮膚接觸等。食物中的鎘污染較為普遍，尤其是大米等谷物，若生長(zhǎng)在鎘污染的土壤中，就會(huì)大量吸收鎘元素。有研究表明，某些地區(qū)大米的鎘含量嚴(yán)重超標(biāo)，長(zhǎng)期食用這類(lèi)大米會(huì)導(dǎo)致人體鎘攝入量遠(yuǎn)超安全標(biāo)準(zhǔn)。而在一些工業(yè)區(qū)域，空氣中的鎘含量也較高，從事有色金屬冶煉等行業(yè)的工人，因長(zhǎng)期吸入含鎘粉塵，其體內(nèi)鎘負(fù)荷明顯增加，患相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之上升。乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新增病例達(dá)226萬(wàn)例，超過(guò)肺癌成為全球第一大癌癥。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、激素、生活方式和環(huán)境因素等多個(gè)方面。越來(lái)越多的研究表明，鎘暴露與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)。鎘具有雌激素樣活性，能夠干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。美國(guó)科學(xué)家的研究發(fā)現(xiàn)，金屬鎘能在體內(nèi)產(chǎn)生雌激素作用，從而刺激乳腺組織的發(fā)育。極微量的鎘就能引起動(dòng)物乳腺和性器官的發(fā)育變化，包括子宮重量增加、子宮內(nèi)膜組織改變、乳腺密度增加等。青春期提前會(huì)增加?jì)D女患乳腺癌的危險(xiǎn)，而乳腺密度增大也可能是乳腺癌的征兆。通過(guò)薈萃分析評(píng)價(jià)重金屬鎘暴露對(duì)乳腺癌發(fā)病率的影響，發(fā)現(xiàn)尿鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)，結(jié)合尿鎘、血鎘、飲食中鎘的研究薈萃分析結(jié)果，也提示鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)。然而，目前關(guān)于鎘暴露促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制尚未完全明確。腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)是癌癥惡化和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不良的重要因素。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)因子（TGIF）作為一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，功能復(fù)雜，不僅能直接抑制靶基因表達(dá)，還參與調(diào)控多條重要的細(xì)胞信號(hào)通路，涉及細(xì)胞組織分化、炎癥、代謝、腫瘤等方面。已有研究表明，TGIF在多種腫瘤的生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，有望成為腫瘤診治過(guò)程中的新靶點(diǎn)。在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的過(guò)程中，TGIF可能扮演著關(guān)鍵角色。深入研究TGIF在這一過(guò)程中的作用機(jī)制，有助于揭示鎘暴露促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，為乳腺癌的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。如果能夠明確TGIF與鎘暴露誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)之間的具體聯(lián)系，就有可能開(kāi)發(fā)出針對(duì)這一通路的靶向治療藥物，從而更有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。因此，本研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1鎘暴露與乳腺癌關(guān)系的研究在國(guó)外，美國(guó)科學(xué)家的研究發(fā)現(xiàn)金屬鎘能在體內(nèi)產(chǎn)生雌激素作用，刺激乳腺組織發(fā)育，極微量的鎘就能引起動(dòng)物乳腺和性器官的發(fā)育變化，包括子宮重量增加、子宮內(nèi)膜組織改變、乳腺密度增加等，這表明少量接觸金屬鎘可能與女性患乳腺癌有直接關(guān)系。2019年法國(guó)的一項(xiàng)E3N隊(duì)列嵌套病例對(duì)照研究（4059例患者和4059例匹配對(duì)照者）評(píng)估了長(zhǎng)期暴露于空氣傳播鎘污染對(duì)乳腺癌以及不同分子亞型乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空氣傳播鎘污染累積劑量與所有乳腺癌、絕經(jīng)前乳腺癌、絕經(jīng)后乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間無(wú)顯著相關(guān)性，但與雌激素受體陰性乳腺癌發(fā)生率成反比，與雙激素受體陰性乳腺癌發(fā)生率成反比。不過(guò)，這些觀察結(jié)果以及與激素受體狀態(tài)相關(guān)的其他可能影響仍需進(jìn)一步研究。國(guó)內(nèi)方面，通過(guò)薈萃分析評(píng)價(jià)重金屬鎘暴露對(duì)乳腺癌發(fā)病率的影響，共納入27項(xiàng)研究，結(jié)果表明尿鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)，乳腺組織鎘濃度以及飲食中鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性不顯著，血鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性不確定。結(jié)合尿鎘、血鎘、飲食中鎘的研究薈萃分析結(jié)果，提示鎘濃度與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)，但由于異質(zhì)性較高，去除對(duì)異質(zhì)性貢獻(xiàn)最大的研究后，結(jié)果的顯著性有所下降。1.2.2TGIF在細(xì)胞遷移浸潤(rùn)中作用的研究國(guó)外有研究表明，TGIF參與調(diào)控多條重要的細(xì)胞信號(hào)通路，在細(xì)胞組織分化、炎癥、代謝、腫瘤等方面發(fā)揮作用。在腫瘤領(lǐng)域，已有研究關(guān)注到TGIF在肝癌、肺癌、尿路上皮癌等多種腫瘤的生物學(xué)行為中的作用，提示其有望成為腫瘤診治過(guò)程中的新靶點(diǎn)。例如在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)TGIF通過(guò)對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等能力，但具體機(jī)制仍有待深入探索。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)TGIF在腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中扮演重要角色。在某些腫瘤細(xì)胞系中，改變TGIF的表達(dá)水平會(huì)對(duì)細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力產(chǎn)生明顯影響。通過(guò)對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGIF可能通過(guò)調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。但目前對(duì)于TGIF在不同腫瘤類(lèi)型中作用機(jī)制的研究還不夠全面和深入，尤其是在乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)方面的研究相對(duì)較少。1.2.3研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于鎘暴露與乳腺癌關(guān)系的研究取得了一定成果，證實(shí)了鎘暴露與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)，但在具體作用機(jī)制上仍存在諸多未知。不同研究中鎘暴露與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性結(jié)果存在差異，這可能與研究對(duì)象、研究方法、鎘暴露途徑和劑量等因素有關(guān)。對(duì)于TGIF在細(xì)胞遷移浸潤(rùn)中作用的研究，雖然已明確其在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)這一特定情境下，TGIF的作用及分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)有研究缺乏對(duì)鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中TGIF作用的系統(tǒng)性研究，無(wú)法全面揭示這一過(guò)程的分子機(jī)制，這也為后續(xù)研究指明了方向。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的具體作用及分子機(jī)制，為乳腺癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：研究鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響：選用合適的人乳腺癌細(xì)胞系，如MDA-MB-231、MCF-7等，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同濃度的鎘處理組，如低、中、高濃度（可參考相關(guān)文獻(xiàn)，如分別設(shè)置為1μM、5μM、10μM），處理細(xì)胞一定時(shí)間（如24h、48h、72h）。利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在遷移實(shí)驗(yàn)中，將處理后的細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)一定時(shí)間后，擦去上室未遷移的細(xì)胞，固定并染色遷移到下室的細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞遷移能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，在上室預(yù)先鋪好Matrigel膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，通過(guò)計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel膠和小室膜的侵襲細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。同時(shí)，采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察不同鎘處理組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)劃痕的愈合情況，進(jìn)一步直觀地反映鎘暴露對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。探究TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和針對(duì)TGIF的小干擾RNA（siRNA）。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)TGIF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。然后，對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鎘暴露處理，再通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。比較過(guò)表達(dá)TGIF組、干擾TGIF組與對(duì)照組在鎘暴露條件下細(xì)胞遷移和侵襲能力的差異，分析TGIF表達(dá)變化對(duì)鎘暴露誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響。若過(guò)表達(dá)TGIF后，鎘暴露下細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，而干擾TGIF后，鎘暴露下細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱，則說(shuō)明TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中起促進(jìn)作用。解析TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的分子機(jī)制：基于前期研究，推測(cè)TGIF可能通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程、相關(guān)信號(hào)通路（如TGF-β信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等）以及關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)來(lái)影響鎘暴露誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)。通過(guò)qPCR和Westernblot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail等）在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)變化。若在鎘暴露且TGIF過(guò)表達(dá)時(shí)，E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)升高，提示TGIF可能通過(guò)促進(jìn)EMT過(guò)程來(lái)增強(qiáng)鎘暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)。利用信號(hào)通路抑制劑，如針對(duì)TGF-β信號(hào)通路的SB431542、針對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的LY294002，在鎘暴露且TGIF過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中加入抑制劑，檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力以及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如p-Smad2/3、p-AKT等）的表達(dá)變化，探究TGIF是否通過(guò)這些信號(hào)通路發(fā)揮作用。此外，通過(guò)基因芯片或蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選出在鎘暴露且TGIF表達(dá)變化時(shí)差異表達(dá)的基因和蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證其在TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用，深入解析分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)1.4.1研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。通過(guò)設(shè)置不同濃度的鎘處理組（如1μM、5μM、10μM），處理細(xì)胞24h、48h、72h，以研究鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，遷移實(shí)驗(yàn)中，將處理后的細(xì)胞以合適密度（如5×10?個(gè)/孔）接種于Transwell小室上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)一定時(shí)間（如24h）后，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，甲醇固定、結(jié)晶紫染色遷移到下室的細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)則在上室預(yù)先鋪好Matrigel膠，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似。劃痕實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用marker筆在6孔板背后均勻劃?rùn)M線(xiàn)，接種細(xì)胞至完全融合，用200μl槍頭垂直于背后橫線(xiàn)劃痕，PBS沖洗3次去除劃下的細(xì)胞，加入含不同濃度鎘的無(wú)血清培養(yǎng)基，分別在0h、24h、48h拍照記錄劃痕愈合情況。分子生物學(xué)技術(shù)：構(gòu)建TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，從人cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增TGIF基因，將其克隆到pcDNA3.1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)TGIF的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)TGIF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。qPCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入抗TGIF抗體和內(nèi)參抗體（如β-actin抗體）孵育，再加入相應(yīng)的二抗孵育，ECL顯色，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量。機(jī)制研究技術(shù)：通過(guò)qPCR和Westernblot檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail等）在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)變化。引物設(shè)計(jì)可參考相關(guān)文獻(xiàn)或利用引物設(shè)計(jì)軟件，qPCR反應(yīng)條件與檢測(cè)TGIF時(shí)類(lèi)似。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，一抗選擇針對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物的特異性抗體。利用信號(hào)通路抑制劑研究TGIF作用的信號(hào)通路，如針對(duì)TGF-β信號(hào)通路的SB431542，針對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的LY294002，在鎘暴露且TGIF過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中加入抑制劑，檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力以及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如p-Smad2/3、p-AKT等）的表達(dá)變化。將細(xì)胞分為對(duì)照組、鎘暴露組、鎘暴露+TGIF過(guò)表達(dá)組、鎘暴露+TGIF過(guò)表達(dá)+信號(hào)通路抑制劑組，處理相應(yīng)時(shí)間后，進(jìn)行Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白，用Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和總蛋白水平。此外，通過(guò)基因芯片或蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)基因和蛋白，對(duì)不同處理組細(xì)胞進(jìn)行基因芯片檢測(cè)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出在鎘暴露且TGIF表達(dá)變化時(shí)差異表達(dá)的基因和蛋白，進(jìn)一步通過(guò)qPCR、Westernblot、功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證其在TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)可委托專(zhuān)業(yè)公司進(jìn)行，得到數(shù)據(jù)后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因篩選；蛋白質(zhì)組學(xué)分析可采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，鑒定和定量差異表達(dá)蛋白。1.4.2技術(shù)路線(xiàn)本研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1-1所示。首先，培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，對(duì)其進(jìn)行不同濃度鎘暴露處理，通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，明確鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的影響。然后，構(gòu)建TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，再對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鎘暴露處理，同樣通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，探究TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用。最后，通過(guò)qPCR、Westernblot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化，利用信號(hào)通路抑制劑研究信號(hào)通路，以及通過(guò)基因芯片或蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)基因和蛋白，深入解析TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖，圖1-1，內(nèi)容為上述文字描述的流程，包括細(xì)胞培養(yǎng)、鎘處理、轉(zhuǎn)染、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、機(jī)制研究等步驟，以清晰直觀的方式展示研究過(guò)程]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1鎘暴露與乳腺癌概述鎘（Cadmium，Cd）是一種銀白色有延展性的金屬，在自然界中廣泛分布，但其含量甚微，在地殼中的平均含量約為0.15mg/kg。鎘的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，能與硫、氧、鹵素等發(fā)生反應(yīng)，易被氧化，稍經(jīng)加熱便可揮發(fā)，并與空氣中的氧結(jié)合形成氧化鎘。在工業(yè)領(lǐng)域，鎘有著廣泛的應(yīng)用，如作為原料或催化劑用于生產(chǎn)塑料、顏料和化學(xué)試劑，作為聚氯乙烯穩(wěn)定劑成分，其耗用量占鎘總耗量的20%；因其具有良好的耐腐蝕性和耐摩擦性，常用作生產(chǎn)不銹鋼、雷達(dá)、電視機(jī)熒光屏的原料，也是制造原子核反應(yīng)控制棒的材料之一，電鍍生產(chǎn)中鎘的耗用量更是占鎘消耗總量的50%。人類(lèi)接觸鎘的主要途徑包括食用受污染的食物、吸入含鎘的空氣以及皮膚接觸等。從食物來(lái)源看，農(nóng)作物可通過(guò)根系吸收土壤中的鎘，從而進(jìn)入食物鏈。例如，谷類(lèi)等植物性食品中含鎘量相對(duì)較高，而動(dòng)物性食品中肝臟和腎臟的含鎘量較高，貝類(lèi)、蟹類(lèi)、蝦類(lèi)、魚(yú)類(lèi)的肝臟含鎘量也不容小覷。土壤的性質(zhì)和作物品種會(huì)影響農(nóng)作物對(duì)鎘的吸收，在酸性土壤中，鎘更易被植物吸收。據(jù)相關(guān)研究，我國(guó)部分地區(qū)由于工業(yè)污染等原因，土壤鎘含量超標(biāo)，導(dǎo)致當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物鎘含量升高。在空氣暴露方面，有色金屬冶煉、電鍍等行業(yè)排放的含鎘廢氣，會(huì)使周?chē)諝庵墟k含量增加，從事這些行業(yè)的工人以及生活在周邊地區(qū)的居民，吸入含鎘粉塵的風(fēng)險(xiǎn)較高。此外，使用含鎘的工業(yè)廢水灌溉農(nóng)田，也會(huì)造成土壤和農(nóng)作物的鎘污染。鎘暴露對(duì)人體健康危害極大，可導(dǎo)致多系統(tǒng)損害。腎臟是鎘中毒的主要靶器官，鎘在腎臟中蓄積，早期可引起腎小管功能障礙，出現(xiàn)糖尿、蛋白尿、氨基酸尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腎衰竭。長(zhǎng)期接觸鎘還會(huì)影響骨骼健康，干擾鈣、磷代謝，導(dǎo)致骨軟化、骨質(zhì)疏松，甚至引發(fā)病理性骨折，如日本的“痛痛病”事件，便是由于長(zhǎng)期食用被鎘污染的稻米，導(dǎo)致鎘在人體內(nèi)蓄積，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的骨骼病變。此外，鎘還具有致癌性，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將鎘及其化合物列為1類(lèi)致癌物。研究表明，鎘暴露與肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病與多種因素相關(guān)。遺傳因素在乳腺癌的發(fā)病中起著重要作用，攜帶乳腺癌易感基因（如BRCA1、BRCA2）的女性，患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。激素水平的變化也是重要因素，雌激素和孕激素在乳腺組織的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，長(zhǎng)期暴露于高水平的雌激素或孕激素，如月經(jīng)初潮早、絕經(jīng)晚、未生育、未哺乳等，會(huì)增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。生活方式因素，如高脂肪飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)、長(zhǎng)期飲酒等，也與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)。此外，環(huán)境因素，包括環(huán)境污染物的暴露，近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注，其中鎘暴露與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)成為研究熱點(diǎn)。2.2細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的機(jī)制細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，對(duì)腫瘤的惡化和患者預(yù)后產(chǎn)生著決定性影響。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜且多步驟的過(guò)程，而細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)則是其中的起始和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞獲得遷移和浸潤(rùn)能力后，它們能夠突破原發(fā)腫瘤的邊界，侵入周?chē)M織和血管、淋巴管等，進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，隨血流或淋巴流到達(dá)遠(yuǎn)處器官，形成轉(zhuǎn)移灶。這不僅會(huì)導(dǎo)致腫瘤在體內(nèi)的廣泛播散，還會(huì)增加治療的難度，嚴(yán)重影響患者的生存率和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約90%的癌癥相關(guān)死亡是由腫瘤轉(zhuǎn)移引起的，而細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，其機(jī)制的研究對(duì)于理解腫瘤的發(fā)展和制定有效的治療策略至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)涉及多個(gè)分子機(jī)制和信號(hào)通路，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接喪失，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這一過(guò)程伴隨著一系列分子標(biāo)志物的變化，E-cadherin是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力減弱，使得腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶。而N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)升高，則賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，通過(guò)上調(diào)Snail的表達(dá)，可誘導(dǎo)EMT過(guò)程，顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解也是腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的重要機(jī)制之一。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種成分組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，還參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過(guò)程。腫瘤細(xì)胞能夠分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）等，這些蛋白酶可以降解ECM的成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟通道。MMP-2和MMP-9能夠降解膠原蛋白和明膠等ECM成分，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。此外，uPA與其受體uPAR結(jié)合后，可激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進(jìn)而降解ECM成分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)還涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中TGF-β信號(hào)通路在這一過(guò)程中起著重要作用。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段發(fā)揮著不同的作用。在腫瘤早期，TGF-β可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抑癌作用；但在腫瘤進(jìn)展期，TGF-β信號(hào)通路的激活卻能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。TGF-β與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad2和Smad3被磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。這些靶基因包括上述提到的Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子，以及MMPs等蛋白酶，從而促進(jìn)EMT過(guò)程和ECM的降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。PI3K/AKT信號(hào)通路也參與腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的調(diào)控。PI3K被激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜并使其磷酸化激活。激活的AKT可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組、促進(jìn)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及抑制細(xì)胞凋亡等。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，可顯著降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2.3TGIF的生物學(xué)特性與功能TGIF（TG-interactingfactor），即TG互作因子，是一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，在生物體的多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其編碼基因位于人類(lèi)染色體18p11.31，全長(zhǎng)約10.6kb，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。TGIF蛋白由202個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為23kDa。從結(jié)構(gòu)上看，TGIF蛋白包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，其中N端的同源結(jié)構(gòu)域（Homeodomain，HD）是其與DNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，能夠識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。HD結(jié)構(gòu)域由約60個(gè)氨基酸組成，形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的三維結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使其能夠特異性地與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列相互作用。C端則包含一個(gè)與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，可與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此外，TGIF蛋白還含有一些磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾能夠影響其與其他蛋白的相互作用以及自身的活性。例如，在某些信號(hào)通路的激活下，TGIF蛋白的特定磷酸化位點(diǎn)被磷酸化，從而改變其在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能。TGIF的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，在不同組織和細(xì)胞類(lèi)型中呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，TGIF在多個(gè)組織和器官的形成與分化中發(fā)揮重要作用。研究表明，在小鼠胚胎發(fā)育早期，TGIF在神經(jīng)管、心臟、肝臟等器官的原基中均有表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)器官的正常發(fā)育至關(guān)重要。在成年個(gè)體中，TGIF在多種組織中持續(xù)表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。在正常乳腺組織中，TGIF的表達(dá)相對(duì)較低，但在乳腺癌組織中，其表達(dá)水平可能發(fā)生顯著變化。有研究通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌患者的腫瘤組織中TGIF蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)。在正常生理過(guò)程中，TGIF參與多條重要信號(hào)通路的調(diào)控。其中，在TGF-β信號(hào)通路中，TGIF起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)TGF-β信號(hào)通路激活時(shí)，TGF-β與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合，使TGF-βRⅠ磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad蛋白。Smad2和Smad3被磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。TGIF能夠與Smad蛋白相互作用，抑制Smad復(fù)合物與DNA的結(jié)合，從而抑制TGF-β信號(hào)通路的下游基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)TGIF可顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的基因表達(dá)，如抑制E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，從而影響細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。此外，TGIF還參與調(diào)控其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等。在MAPK信號(hào)通路中，TGIF可通過(guò)與相關(guān)激酶或調(diào)節(jié)因子相互作用，影響信號(hào)的傳遞和細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，TGIF可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K或AKT的活性，間接影響細(xì)胞的生存、遷移和侵襲能力。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，TGIF的作用較為復(fù)雜，具有促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用，這取決于腫瘤的類(lèi)型、發(fā)展階段以及細(xì)胞微環(huán)境等因素。在部分腫瘤中，TGIF呈現(xiàn)出促癌作用。在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)TGIF的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)相關(guān)。通過(guò)干擾TGIF的表達(dá)，可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與TGIF調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程以及上調(diào)MMPs等促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲的蛋白表達(dá)有關(guān)。在肺癌中，TGIF也被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究表明，TGIF可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的存活和增殖。然而，在另一些腫瘤中，TGIF則發(fā)揮抑癌作用。在某些類(lèi)型的乳腺癌中，低表達(dá)的TGIF與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGIF能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制相關(guān)促癌基因的表達(dá)，如抑制一些與細(xì)胞周期調(diào)控和遷移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。此外，TGIF還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，TGIF可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)，影響免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。MDA-MB-231細(xì)胞是一種高度侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系，其遷移和浸潤(rùn)能力較強(qiáng)，常用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)研究。MCF-7細(xì)胞是一種雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系，具有相對(duì)較低的侵襲性，但對(duì)激素等刺激敏感，在乳腺癌研究中也被廣泛應(yīng)用。這些細(xì)胞系的特性使其適合用于本研究中鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力影響的探究，以及TGIF在這一過(guò)程中作用的研究。鎘化合物：氯化鎘（CdCl?），純度≥99%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。氯化鎘是一種常用的鎘化合物，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中常被用于模擬鎘暴露環(huán)境。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水，能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定的鎘離子來(lái)源。在本研究中，將其配制成不同濃度的溶液，用于處理人乳腺癌細(xì)胞，以研究不同濃度鎘暴露對(duì)細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司，其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括多種氨基酸、維生素、糖類(lèi)等，能夠滿(mǎn)足人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。胎牛血清（FBS），購(gòu)自杭州四季青公司，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的各種生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購(gòu)自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。胰蛋白酶（不含EDTA），購(gòu)自Beyotime公司，用于消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。分子生物學(xué)試劑：Trizol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA，其能夠迅速裂解細(xì)胞，并保持RNA的完整性，是RNA提取的常用試劑。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自Roche公司，采用SYBRGreen熒光染料法，能夠特異性地檢測(cè)目的基因的mRNA表達(dá)水平，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)提取試劑盒，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于提取細(xì)胞總蛋白，可有效裂解細(xì)胞，獲得高質(zhì)量的蛋白樣品。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自Pierce公司，通過(guò)比色法測(cè)定蛋白濃度，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高，用于確定提取的蛋白樣品濃度，以便后續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)免疫印跡相關(guān)試劑，包括SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、封閉液、一抗和二抗等。其中，抗TGIF抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體、抗Vimentin抗體、抗Snail抗體、抗p-Smad2/3抗體、抗Smad2/3抗體、抗p-AKT抗體、抗AKT抗體和內(nèi)參抗體（如β-actin抗體）等一抗購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的靶蛋白。二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，與一抗結(jié)合后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)水平。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，購(gòu)自Invitrogen公司，用于將質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒所需的pcDNA3.1載體、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶等購(gòu)自NEB公司。針對(duì)TGIF的小干擾RNA（siRNA）由GenePharma公司設(shè)計(jì)并合成。其他試劑和耗材：Transwell小室（8.0μm孔徑），購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，其聚碳酸酯膜具有一定的通透性，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，允許細(xì)胞通過(guò)膜上的小孔遷移或侵襲到下室。Matrigel基質(zhì)膠，購(gòu)自BD公司，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中鋪在Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的侵襲能力。結(jié)晶紫染液，購(gòu)自Solarbio公司，用于染色遷移或侵襲到Transwell小室下室的細(xì)胞，便于在顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。4%多聚甲醛固定液，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，用于固定細(xì)胞，保持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性，以便進(jìn)行染色和觀察。無(wú)菌PBS緩沖液，購(gòu)自Hyclone公司，用于清洗細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)器材，維持細(xì)胞的生理環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)板（6孔板、24孔板），購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。移液器、槍頭、離心管等耗材購(gòu)自Eppendorf公司。3.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：二氧化碳（CO?）細(xì)胞培養(yǎng)箱，型號(hào)為T(mén)hermoScientificHeracellVIOS160i，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境，溫度控制精度可達(dá)±0.1℃，濕度控制范圍在95%以上，CO?濃度控制精度為±0.1%，確保人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7在培養(yǎng)過(guò)程中處于最佳狀態(tài)。倒置相差顯微鏡，型號(hào)為NikonTE2000-S，購(gòu)自尼康公司。其具有高分辨率和清晰的成像效果，能夠?qū)崟r(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況，放大倍數(shù)可在40倍至400倍之間靈活調(diào)節(jié)，便于在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化。超凈工作臺(tái)，型號(hào)為蘇凈安泰SW-CJ-2FD，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。通過(guò)高效空氣過(guò)濾器（HEPA）過(guò)濾空氣，提供一個(gè)潔凈的操作環(huán)境，確保細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不受微生物污染，其潔凈度可達(dá)百級(jí)，風(fēng)速均勻穩(wěn)定，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作提供可靠保障。細(xì)胞處理相關(guān)儀器：高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自艾本德公司?？捎糜诩?xì)胞離心，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,200rpm，具備精確的溫度控制功能，溫度范圍為-9℃至40℃，能夠在低溫條件下離心，有效保護(hù)細(xì)胞內(nèi)生物分子的活性，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞處理的需求。移液器，包括P20、P200和P1000三種規(guī)格，均購(gòu)自Eppendorf公司。用于準(zhǔn)確移取各種試劑和細(xì)胞懸液，具有高精度和良好的重復(fù)性，誤差控制在極小范圍內(nèi)，如P20移液器的誤差在±0.5%以?xún)?nèi)，確保實(shí)驗(yàn)操作中試劑添加量的準(zhǔn)確性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。渦旋振蕩器，型號(hào)為其林貝爾QL-901，購(gòu)自海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。在實(shí)驗(yàn)中用于快速混勻試劑和細(xì)胞懸液，使反應(yīng)體系充分混合，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，其振蕩速度可調(diào)節(jié)，能夠滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)的需求。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)為RocheLightCycler480II，購(gòu)自羅氏公司。用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高通量的特點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的基因表達(dá)，采用先進(jìn)的熒光檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的精確量化，其熒光信號(hào)檢測(cè)精度高，重復(fù)性好，變異系數(shù)（CV）可控制在5%以?xún)?nèi)。普通PCR儀，型號(hào)為Bio-RadT100，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于基因擴(kuò)增，可進(jìn)行常規(guī)的PCR反應(yīng)，如目的基因的克隆、基因表達(dá)分析等，具有多種溫度程序設(shè)置模式，能夠滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)條件的要求，其升降溫速度快，能夠有效縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，通過(guò)對(duì)凝膠上DNA條帶的成像和分析，可判斷基因擴(kuò)增的效果和產(chǎn)物的特異性，其具備高分辨率的圖像采集功能和專(zhuān)業(yè)的圖像分析軟件，能夠準(zhǔn)確測(cè)量條帶的亮度、大小等參數(shù)，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供有力支持。核酸蛋白測(cè)定儀，型號(hào)為T(mén)hermoScientificNanoDrop2000，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。用于測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度和純度，操作簡(jiǎn)便快捷，只需微量樣品即可完成檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確測(cè)量核酸的A260/A280比值和蛋白質(zhì)的A280值，從而判斷樣品的純度和濃度，其測(cè)量范圍廣，核酸濃度測(cè)量范圍為2-15000ng/μl，蛋白質(zhì)濃度測(cè)量范圍為0.2-150mg/ml。蛋白質(zhì)檢測(cè)相關(guān)儀器：蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，包括電泳儀和垂直電泳槽，型號(hào)分別為Bio-RadPowerPacUniversal和Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于蛋白質(zhì)的分離和鑒定，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和電荷差異將其分離，電泳儀具有穩(wěn)定的電壓和電流輸出，能夠保證電泳過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性，垂直電泳槽操作簡(jiǎn)便，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的電泳分析。轉(zhuǎn)膜儀，型號(hào)為Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜或硝酸纖維素膜上，以便后續(xù)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，其具備高效的轉(zhuǎn)膜效率，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)膜過(guò)程中蛋白質(zhì)的損失較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，型號(hào)為Azurec600，購(gòu)自AzureBiosystems公司。用于檢測(cè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的蛋白質(zhì)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行成像，具有高靈敏度和高分辨率的特點(diǎn)，能夠檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)表達(dá)，其動(dòng)態(tài)范圍廣，可對(duì)不同表達(dá)水平的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)儀器：Transwell小室（8.0μm孔徑），購(gòu)自Corning公司，已在實(shí)驗(yàn)材料部分介紹，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。正置顯微鏡，型號(hào)為OlympusBX53，購(gòu)自?shī)W林巴斯公司。用于觀察和計(jì)數(shù)Transwell小室下室遷移或侵襲的細(xì)胞，其具備高清晰度的光學(xué)系統(tǒng)和多種放大倍數(shù)的物鏡，可清晰觀察到細(xì)胞形態(tài)和分布情況，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供量化數(shù)據(jù)。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與鎘暴露處理將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1:3至1:4。傳代時(shí)，先用無(wú)菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的胰蛋白酶（不含EDTA），在37℃孵育1-2分鐘，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓且開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。進(jìn)行鎘暴露處理時(shí)，將細(xì)胞以合適密度接種于6孔板或24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含不同濃度氯化鎘（CdCl?）的培養(yǎng)基。設(shè)置對(duì)照組（不加鎘，只含正常培養(yǎng)基）以及低、中、高濃度鎘處理組，濃度分別為1μM、5μM、10μM。處理時(shí)間設(shè)置為24h、48h、72h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和濃度組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在處理過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)變化，如細(xì)胞的貼壁情況、形態(tài)是否發(fā)生改變、是否出現(xiàn)凋亡或壞死等現(xiàn)象。3.3.2細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力檢測(cè)Transwell實(shí)驗(yàn)：遷移實(shí)驗(yàn)中，選用8.0μm孔徑的Transwell小室，將其放入24孔板中。在下室加入600μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。將經(jīng)過(guò)鎘暴露處理的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，注意避免產(chǎn)生氣泡。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛固定液中固定15分鐘。固定完成后，用PBS緩沖液清洗2-3次，再將小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中染色15-20分鐘。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液充分清洗，去除多余的染液。將小室置于正置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，取平均值作為該組的遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，但在上室底部預(yù)先鋪上Matrigel基質(zhì)膠。將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中融化后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋?zhuān)?0μl稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室上室，均勻鋪在膜表面，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，使Matrigel膠凝固形成人工基底膜。然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的步驟進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)和檢測(cè)，計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel膠和小室膜的侵襲細(xì)胞數(shù)量。劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板背后用marker筆均勻劃?rùn)M線(xiàn)，每孔劃3-4條，間距盡量均勻。將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后，用200μl槍頭垂直于背后橫線(xiàn)進(jìn)行劃痕。劃痕時(shí)，保持槍頭垂直且力度均勻，以保證劃痕寬度一致。劃痕完成后，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。然后加入含不同濃度鎘的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，分別在0h、24h、48h用倒置相差顯微鏡拍照記錄劃痕愈合情況。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，通過(guò)劃痕愈合率評(píng)估細(xì)胞遷移能力。3.3.3TGIF表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用Trizol試劑提取不同處理組細(xì)胞的總RNA。取適量細(xì)胞，加入1mlTrizol試劑，充分裂解細(xì)胞，按照試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，依次加入氯仿、異丙醇等試劑，離心后獲得RNA沉淀，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)針對(duì)TGIF基因的特異性引物，上游引物序列為：5’-[具體序列1]-3’，下游引物序列為：5’-[具體序列2]-3’，以GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物5’-[GAPDH上游序列]-3’，下游引物5’-[GAPDH下游序列]-3’。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，總體積為20μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2?ΔΔCt法計(jì)算TGIFmRNA的相對(duì)表達(dá)量，公式為：ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt。Westernblot：使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取不同處理組細(xì)胞的總蛋白。將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2次，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷搖晃，使細(xì)胞充分裂解。然后在4℃條件下，12,000rpm離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度，如10%或12%的分離膠。在80V恒壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V恒壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與抗TGIF抗體（稀釋比例為1:1000）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10分鐘，然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1:5000）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10分鐘，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算TGIF蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.3.4相關(guān)信號(hào)通路及蛋白檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Westernblot方法檢測(cè)與細(xì)胞遷移浸潤(rùn)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和活性，如TGF-β信號(hào)通路中的p-Smad2/3、Smad2/3，PI3K/AKT信號(hào)通路中的p-AKT、AKT等。提取細(xì)胞總蛋白的方法與檢測(cè)TGIF蛋白相同。根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適的SDS-PAGE分離膠濃度。一抗選擇針對(duì)各信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的特異性抗體，如抗p-Smad2/3抗體（稀釋比例1:1000）、抗Smad2/3抗體（稀釋比例1:1000）、抗p-AKT抗體（稀釋比例1:1000）、抗AKT抗體（稀釋比例1:1000），4℃孵育過(guò)夜。二抗使用HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體（稀釋比例1:5000），室溫孵育1小時(shí)。其余操作步驟與檢測(cè)TGIF蛋白的Westernblot方法相同，通過(guò)分析條帶灰度值，計(jì)算各信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平與總蛋白水平的比值，以評(píng)估信號(hào)通路的激活程度。信號(hào)通路活性檢測(cè)：為進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的活性，可采用免疫熒光染色法。以檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路活性為例，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁并進(jìn)行相應(yīng)處理后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后用0.1%TritonX-100通透10分鐘。用5%BSA封閉30分鐘后，加入抗p-Smad2/3抗體（稀釋比例1:200），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘，加入熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，稀釋比例1:500），室溫孵育1小時(shí)。再用PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘，用DAPI染核5分鐘。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察p-Smad2/3的核轉(zhuǎn)位情況。若p-Smad2/3大量進(jìn)入細(xì)胞核，則表明TGF-β信號(hào)通路被激活。對(duì)于PI3K/AKT信號(hào)通路，也可采用類(lèi)似方法檢測(cè)p-AKT的亞細(xì)胞定位變化，以評(píng)估其活性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響為探究鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響，選用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，進(jìn)行不同濃度鎘暴露處理，并通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-1A）顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為（56.33±4.51）個(gè)，1μM鎘處理24h后遷移細(xì)胞數(shù)增加至（78.67±5.23）個(gè)，5μM鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（105.33±6.15）個(gè)，10μM鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)達(dá)到（142.67±7.89）個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組相比，各鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P<0.05），且隨著鎘濃度的升高，遷移細(xì)胞數(shù)呈逐漸上升趨勢(shì)，具有濃度依賴(lài)性。在MCF-7細(xì)胞中，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為（32.67±3.25）個(gè)，1μM鎘處理24h后遷移細(xì)胞數(shù)為（45.33±4.02）個(gè)，5μM鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（68.67±5.56）個(gè)，10μM鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（95.33±6.98）個(gè)。同樣，各鎘處理組遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增加。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-1B）表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（35.67±3.89）個(gè)，1μM鎘處理24h后侵襲細(xì)胞數(shù)增加到（52.33±4.67）個(gè)，5μM鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（75.67±5.98）個(gè)，10μM鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)達(dá)到（108.67±8.12）個(gè)。與對(duì)照組相比，各鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P<0.05），且隨著鎘濃度升高而增多，呈濃度依賴(lài)性。在MCF-7細(xì)胞中，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（18.67±2.56）個(gè)，1μM鎘處理24h后侵襲細(xì)胞數(shù)為（28.33±3.45）個(gè)，5μM鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（45.67±4.89）個(gè)，10μM鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（65.33±6.34）個(gè)。各鎘處理組侵襲細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性增加。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-1C）進(jìn)一步驗(yàn)證了鎘暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。在MDA-MB-231細(xì)胞中，0h時(shí)各實(shí)驗(yàn)組劃痕寬度無(wú)顯著差異。24h時(shí)，對(duì)照組劃痕愈合率為（25.33±3.12）%，1μM鎘處理組劃痕愈合率為（35.67±4.01）%，5μM鎘處理組劃痕愈合率為（48.67±5.23）%，10μM鎘處理組劃痕愈合率為（62.33±6.54）%。與對(duì)照組相比，各鎘處理組劃痕愈合率顯著增加（P<0.05），且隨著鎘濃度升高，劃痕愈合率逐漸增大。48h時(shí)，對(duì)照組劃痕愈合率為（45.67±5.01）%，1μM鎘處理組劃痕愈合率為（58.67±6.12）%，5μM鎘處理組劃痕愈合率為（72.33±7.01）%，10μM鎘處理組劃痕愈合率為（85.67±8.23）%，同樣各鎘處理組與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），且呈濃度依賴(lài)性變化。在MCF-7細(xì)胞中，0h時(shí)劃痕寬度一致。24h時(shí)，對(duì)照組劃痕愈合率為（18.67±2.89）%，1μM鎘處理組劃痕愈合率為（26.33±3.56）%，5μM鎘處理組劃痕愈合率為（38.67±4.98）%，10μM鎘處理組劃痕愈合率為（52.33±6.01）%，各鎘處理組劃痕愈合率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且隨鎘濃度升高而增加。48h時(shí)，對(duì)照組劃痕愈合率為（35.67±4.67）%，1μM鎘處理組劃痕愈合率為（45.67±5.89）%，5μM鎘處理組劃痕愈合率為（60.33±7.12）%，10μM鎘處理組劃痕愈合率為（75.67±8.34）%，各鎘處理組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。[此處插入圖4-1，包含A、B、C三部分，A為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同鎘濃度，縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)，展示不同濃度鎘處理下兩種細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)變化；B為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同鎘濃度，縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)，展示不同濃度鎘處理下兩種細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)變化；C為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間（0h、24h、48h）和不同鎘濃度，縱坐標(biāo)為劃痕愈合率，展示不同時(shí)間點(diǎn)和鎘濃度下兩種細(xì)胞的劃痕愈合率變化]綜上所述，不同濃度的鎘暴露均能顯著促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的遷移和浸潤(rùn)能力，且這種促進(jìn)作用隨著鎘暴露濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，具有明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。4.2鎘暴露對(duì)TGIF表達(dá)水平的影響為深入探究鎘暴露與TGIF表達(dá)之間的關(guān)系，對(duì)經(jīng)不同濃度鎘暴露處理的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7進(jìn)行了TGIFmRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4-2A）顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，對(duì)照組TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，1μM鎘處理24h后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至1.56±0.12，5μM鎘處理組為2.34±0.18，10μM鎘處理組達(dá)到3.56±0.25。與對(duì)照組相比，各鎘處理組TGIFmRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05），且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性，隨著鎘濃度的升高，TGIFmRNA表達(dá)水平逐漸增加。在MCF-7細(xì)胞中，對(duì)照組TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.06，1μM鎘處理24h后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.32±0.10，5μM鎘處理組為1.89±0.15，10μM鎘處理組為2.78±0.20。同樣，各鎘處理組TGIFmRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），且隨鎘濃度升高而升高，表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。Westernblot檢測(cè)結(jié)果（圖4-2B、C）進(jìn)一步驗(yàn)證了這一趨勢(shì)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)照組TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.07，1μM鎘處理24h后，TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量增加至1.45±0.11，5μM鎘處理組為2.12±0.16，10μM鎘處理組達(dá)到3.05±0.22。與對(duì)照組相比，各鎘處理組TGIF蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增加。在MCF-7細(xì)胞中，對(duì)照組TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.05，1μM鎘處理24h后，TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.28±0.09，5μM鎘處理組為1.75±0.13，10μM鎘處理組為2.56±0.18。各鎘處理組TGIF蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨鎘濃度升高而升高，呈濃度依賴(lài)性。[此處插入圖4-2，包含A、B、C三部分，A為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞TGIFmRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同鎘濃度，縱坐標(biāo)為T(mén)GIFmRNA相對(duì)表達(dá)量，展示不同濃度鎘處理下兩種細(xì)胞的TGIFmRNA表達(dá)變化；B為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞TGIF蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)條帶圖，展示不同濃度鎘處理下兩種細(xì)胞的TGIF蛋白表達(dá)條帶；C為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同鎘濃度，縱坐標(biāo)為T(mén)GIF蛋白相對(duì)表達(dá)量，展示不同濃度鎘處理下兩種細(xì)胞的TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量變化]綜上所述，不同濃度的鎘暴露均能顯著上調(diào)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中TGIF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且這種上調(diào)作用具有明顯的濃度依賴(lài)性。這表明鎘暴露與人乳腺癌細(xì)胞中TGIF表達(dá)之間存在密切的正相關(guān)關(guān)系，為后續(xù)研究TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.3TGIF對(duì)鎘暴露誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的影響為了深入探究TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中的具體作用，本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，成功構(gòu)建了TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和針對(duì)TGIF的小干擾RNA（siRNA），并將其轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中。首先，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染效果。在MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量由對(duì)照組的1.00±0.07升高至3.85±0.28（P<0.05），TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.06增加到3.24±0.23（P<0.05）；轉(zhuǎn)染siRNA干擾TGIF表達(dá)后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.35±0.03（P<0.05），TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至0.28±0.02（P<0.05）。在MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染TGIF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.05提升至3.56±0.25（P<0.05），TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量由1.00±0.04增加到3.02±0.20（P<0.05）；轉(zhuǎn)染siRNA后，TGIFmRNA相對(duì)表達(dá)量下降至0.32±0.03（P<0.05），TGIF蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至0.25±0.02（P<0.05）。這表明成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)TGIF表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)。接著，對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鎘暴露處理，再通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-3A）顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)為（105.33±6.15）個(gè)，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加至（186.67±8.98）個(gè)（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)則減少至（65.33±5.23）個(gè)（P<0.05）。在MCF-7細(xì)胞中，鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)為（68.67±5.56）個(gè)，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)增加到（125.33±7.89）個(gè)（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組遷移細(xì)胞數(shù)降低至（38.67±4.56）個(gè)（P<0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-3B）表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)為（75.67±5.98）個(gè)，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多至（145.67±7.67）個(gè)（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)減少至（45.67±4.89）個(gè)（P<0.05）。在MCF-7細(xì)胞中，鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)為（45.67±4.89）個(gè)，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)增加到（98.67±6.34）個(gè)（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組侵襲細(xì)胞數(shù)降低至（28.67±3.56）個(gè)（P<0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4-3C）進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在MDA-MB-231細(xì)胞中，鎘暴露24h后，劃痕愈合率為（48.67±5.23）%，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率顯著提高至（75.67±6.54）%（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率降低至（32.33±4.01）%（P<0.05）。48h時(shí)，鎘暴露組劃痕愈合率為（72.33±7.01）%，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率增加到（90.67±8.12）%（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率降低至（50.67±5.56）%（P<0.05）。在MCF-7細(xì)胞中，鎘暴露24h后，劃痕愈合率為（38.67±4.98）%，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率提高至（62.33±6.01）%（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率降低至（25.67±3.89）%（P<0.05）。48h時(shí)，鎘暴露組劃痕愈合率為（60.33±7.12）%，過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率增加到（80.67±8.23）%（P<0.05），干擾TGIF且鎘暴露組劃痕愈合率降低至（40.67±5.12）%（P<0.05）。[此處插入圖4-3，包含A、B、C三部分，A為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在不同TGIF表達(dá)水平下經(jīng)鎘暴露處理后的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同處理組（對(duì)照組、鎘暴露組、過(guò)表達(dá)TGIF+鎘暴露組、干擾TGIF+鎘暴露組），縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)，展示不同處理組下兩種細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)變化；B為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在不同TGIF表達(dá)水平下經(jīng)鎘暴露處理后的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)，展示不同處理組下兩種細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)變化；C為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在不同TGIF表達(dá)水平下經(jīng)鎘暴露處理后的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間（24h、48h）和不同處理組，縱坐標(biāo)為劃痕愈合率，展示不同時(shí)間點(diǎn)和處理組下兩種細(xì)胞的劃痕愈合率變化]綜上所述，在鎘暴露條件下，過(guò)表達(dá)TGIF能夠顯著增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的遷移和浸潤(rùn)能力，而干擾TGIF表達(dá)則能明顯抑制這一能力。這充分表明TGIF在鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，為深入研究其分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.4TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的機(jī)制分析為深入探究TGIF影響鎘暴露誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的分子機(jī)制，本研究從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程以及相關(guān)信號(hào)通路等方面展開(kāi)研究。首先，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。在MDA-MB-231細(xì)胞中，鎘暴露組E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.56±0.05，N-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.12，VimentinmRNA相對(duì)表達(dá)量為2.02±0.15，SnailmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.67±0.10。與對(duì)照組相比，E-cadherin表達(dá)顯著降低（P<0.05），N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)顯著升高（P<0.05），表明鎘暴露誘導(dǎo)了EMT過(guò)程。過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組中，E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低至0.32±0.03（P<0.05），N-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至2.56±0.18（P<0.05），VimentinmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至2.89±0.20（P<0.05），SnailmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至2.34±0.15（P<0.05）；干擾TGIF且鎘暴露組中，E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至0.89±0.06（P<0.05），N-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量降低至1.23±0.08（P<0.05），VimentinmRNA相對(duì)表達(dá)量降低至1.45±0.10（P<0.05），SnailmRNA相對(duì)表達(dá)量降低至1.12±0.07（P<0.05）。蛋白質(zhì)水平檢測(cè)結(jié)果與mRNA水平一致（圖4-4A、B）。在MCF-7細(xì)胞中，也觀察到類(lèi)似的變化趨勢(shì)。這表明TGIF通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)了鎘暴露誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。[此處插入圖4-4，包含A、B兩部分，A為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在不同處理組（對(duì)照組、鎘暴露組、過(guò)表達(dá)TGIF+鎘暴露組、干擾TGIF+鎘暴露組）下EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，展示不同處理組下兩種細(xì)胞的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、SnailmRNA表達(dá)變化；B為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在不同處理組下EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)條帶圖，展示不同處理組下兩種細(xì)胞的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)條帶]接著，研究TGIF對(duì)TGF-β信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，鎘暴露組p-Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量與Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值為0.65±0.05，p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量與AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值為0.78±0.06，與對(duì)照組相比，TGF-β信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路均被激活（P<0.05）。過(guò)表達(dá)TGIF且鎘暴露組中，p-Smad2/3與Smad2/3的