ICS65.020.20

CCSB05

45

廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB45/TXXXX—XXXX

百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法

TechnicalregulationsforidentificationofpassionfruitvarietiesSSR

molecularmarkermethod

（征求意見稿）

（本草案完成時間：2022.3.18）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB45/TXXXX—XXXX

1范圍

本文件規(guī)定了利用簡單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記進(jìn)行百香果品種鑒定的操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)

計、判定方法。

本文件適用于百香果品種SSR指紋數(shù)據(jù)采集及品種真實性鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T2517植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南西番蓮

NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

推薦引物recommendedprimer

品種鑒定中優(yōu)先選用一套簡單重復(fù)序列（SSR）引物，其檢測位點(diǎn)具有多態(tài)性高、重復(fù)性好等綜合

特性。

3.2

對照品種controlvariety

對照品種具有所用SSR位點(diǎn)上不同等位變異的特性。對照品種用于輔助確定待測樣品的等位變異，

校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差。

4原理

不同品種百香果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復(fù)次數(shù)存在差異，根據(jù)SSR的差異，

通過PCR擴(kuò)增及電泳技術(shù)可以鑒定百香果品種。

5材料和試劑

除另有說明外，本標(biāo)準(zhǔn)中使用分析純（含）以上試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水，其中PCR

用水要求達(dá)到一級水指標(biāo)。

1

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5.1試劑

5.1.1三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：純度＞99%。

5.1.2乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)：純度≥99.0%。

5.1.3硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm3，含量≥99.5%。

5.1.4十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：ρ=1.32g/mL，純度≥99.0%。

5.1.5氯化鈉（NaCl）：ρ=2.165g/cm3，含量≥99.5%。

5.1.6瓊脂糖。

5.1.7過硫酸銨（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm3，含量≥98.0%。

5.1.8氫氧化鈉(NaOH）：ρ=2.13g/cm3，含量≥96.0%。

5.1.9硝酸銀（AgNO3）：ρ=4.35g/cm3，含量≥98.0%。

5.1.10甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm3。

5.1.11液氮（N2）：ρ=0.81g/cm3。

5.1.12三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm3。

5.1.13無水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm3，含量≥99.7%。

5.1.14DNA分析儀用LIZ500分子量內(nèi)標(biāo)。

5.1.15去離子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。

5.1.1640%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。

5.1.17四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。

5.1.18DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmarker）：可以清楚區(qū)分50bp～500bp的DNA片段。

5.1.192×TaqPlusPCR預(yù)混試劑：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20

mmol/LTris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mMMgCl2、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑。

5.2溶液配制

5.2.15×TBE緩沖液

稱取5.4g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）和2.75g硼酸（5.1.3）

溶于70mL純水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

5.2.20.5×TBE緩沖液

量取100mL濃度5×TBE（5.2.1）緩沖液于燒杯中，加入900mL純水混勻。

5.2.3CTAB提取溶液

稱取4g十六烷基三甲基溴化銨（5.1.4）、16.38g氯化鈉（5.1.5）、1.21g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、

1.49g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）溶于70mL純水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅

菌20min。

5.2.4無菌純水

純水在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

5.2.51%瓊脂糖溶液

1g瓊脂糖（5.1.6）溶于100mL的0.5×TBE緩沖液（5.2.2），適當(dāng)加熱融化。

5.2.610%過硫酸銨溶液

2

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稱取10g過硫酸銨（5.1.7），加入100mL純水溶解。

5.2.7電泳緩沖液

稱取108g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）、55g硼酸（5.1.3）、

0.8g氫氧化鈉（5.1.8），加入10L純水溶解。

5.2.8染色液

稱取0.2g硝酸銀（5.1.9），加入400mL純水溶解。

5.2.9顯色液

稱取4g氫氧化鈉（5.1.8），加入400mL純水溶解，臨用時再加1.6mL甲醛（5.1.10）。

6儀器和設(shè)備

6.1電子天平：感量為1mg。

6.2水浴鍋。

6.3高速冷凍離心機(jī)。

6.4PCR擴(kuò)增儀。

6.5垂直板電泳系統(tǒng)。

6.6凝膠成像系統(tǒng)。

6.7毛細(xì)管電泳儀。

6.8膠片觀察燈。

7SSR引物序列信息

引物序列信息見附錄A。

8操作步驟

8.1樣品采集

用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的百香果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標(biāo)識，放入0-8℃保溫箱

中，帶回實驗室，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

8.2DNA的提取

取8.1中適量百香果葉片用自來水沖洗干凈，再用純水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎放

入研缽中，加入液氮（5.1.11）研磨成粉末狀，分取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB提取

溶液（5.2.3），渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL

的三氯甲烷（5.1.12），顛倒混勻，12000rpm離心3min，轉(zhuǎn)移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等

體積（即0.5mL）預(yù)冷至約4℃的無水乙醇（5.1.13），顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置1h，12000rpm離

心3min，去上清液，室溫下干燥沉淀。加入50μL無菌純水（5.2.4）于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法也適用于本規(guī)程。

3

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8.3PCR擴(kuò)增

8.3.1PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表1。

表1PCR反應(yīng)體系

試劑終濃度體積

滅菌純水-8.5μL

2×TaqTaqPlusPCR預(yù)混試劑1×12.5μL

10μmol/L正向引物0.4μmol/L1.0μL

10μmol/L反向引物0.4μmol/L1.0μL

25ng/μLDNA模板2.0ng/μL2.0μL

總體積25.0μL

8.3.2PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度見附錄A推薦引物表），72℃延伸30s，35個

循環(huán)；最后72℃下延伸7min。

8.4PCR產(chǎn)物檢測

8.4.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

8.4.1.1聚丙烯酰胺凝膠制備

在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液（5.2.5），讓其凝固密封。在

50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液（5.2.1），7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)（5.1.16），

攪拌并用純凈水定容至30mL；加入200μL10%過硫酸銨（5.2.6）和12μL四甲基乙二胺溶液（5.1.17），

混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min~60min內(nèi)聚合凝固，凝膠高度應(yīng)不小于10cm。

8.4.1.2電泳

將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液（5.2.7），小心拔下樣品梳。用加樣

器吸取1μL不同引物（附錄A）PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1μLDNAmarker（5.1.18）。

電泳選用的電壓梯度為1~5V/cm，2×TaqPlus預(yù)混試劑（5.1.19）的藍(lán)色指示帶從上到下分別到達(dá)膠

板1/2、2/3處（大約1h）后結(jié)束電泳。

8.4.1.3銀染顯色

將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中，加入染色液（5.2.8）

覆蓋凝膠，輕搖5min~10min進(jìn)行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液（5.2.9）中，

輕搖至顯色出清晰帶紋；取出凝膠用純水沖洗兩遍，瀝干后進(jìn)行拍照。

8.4.2毛細(xì)管電泳檢測

8.4.2.1PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備

分別取等體積的稀釋后不同引物（附錄A）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號加入

到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量內(nèi)標(biāo)（5.1.14）和8.9μL

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去離子甲酰胺（5.1.15）。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于碎冰塊上，冷卻10-15min。

將整個96孔板置于離心機(jī)中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。

8.4.2.2電泳檢測

按照儀器操作規(guī)程，編輯樣品表及運(yùn)行程序，執(zhí)行運(yùn)行程序，儀器自動給出檢測結(jié)果，保存并記錄

數(shù)據(jù)。

9數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計

9.1樣品每個SSR位點(diǎn)等位變異采用擴(kuò)增片段長度表示；對于毛細(xì)管電泳檢測方法，使用對照品種消

除DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取位點(diǎn)等位變異。

9.2對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，將待檢樣品與對照品種的等位變異片段進(jìn)行比較，明

確待檢樣品位點(diǎn)等位變異。

9.3純合位點(diǎn)結(jié)合等位變異大小數(shù)據(jù)記為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變

異大小數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上的2個等位變異的大小，小片段數(shù)據(jù)在前、大片段

數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為0/0。

示例1：樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn)1個等位變異，大小為160bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/160。

示例2：樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn)2個等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/165。

10判定方法

10.1當(dāng)待檢樣品和對照品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，則判定為“不同品種”；

10.2當(dāng)待檢樣品和對照品種間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“近似品種”；

10.3當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為“極近似品種或相同品種”。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

推薦引物

推薦引物見表A.1

表A.1引物編號及引物擴(kuò)增信息

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列（5’-3’）

號（bp）（℃）

正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT

1PeRM1000195-10750

反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA

正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT

2PeRM1000598-14050

反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA

正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT

3PeRM10006149-19050

反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA

正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA

4PeRM1000795-10650

反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT

正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC

5PeRM10008105-12350

反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA

正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT

6PeRM10009135-14550

反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT

120-130正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’

7PeRM1001155

109反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT

135-180正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC

8PeRM1001250

151反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC

正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA

9PeRM10014130-14050

反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT

正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC

10PeRM1001614950

反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG

正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG

11PeRM10017146-17650

反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA

正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT

12PeRM10018160-17050

反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC

正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA

13PeRM10019142-15050

反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA

正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG

14PeRM10020132-14250

反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC

正向：TGGAATGTGATTTGCATGG

15Pa_F-P10A1022050

反向：TAGGTATTGCTGGCGAAG

正向：CTTGCCTCTCTCCCTCTC

16Pa_F+R-Contig11429050

反向：GGGTTTTGGGTTTGACAG

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表A.1引物編號及引物擴(kuò)增信息（續(xù)）

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列（5’-3’）

號（bp）（℃）

正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG

17Pa_F-Contig1329350

反向：CCCCATCATCATCACTTTC

正向：TTAATGCCACAGCCCAAC

18Pa_F-P7E10240-25550

反向：TGACCCAAAATCAAACACC

正向：TGTTCAAGCCCATCTTCG

19Pa_F+R-Contig80360-38055

反向：GCTCTCGCTCTTGTCGTAG

正向：GAATAGGGTCAGCAGGAGG

20Pa_F-P6H04280-29555

反向：GAGTGTGTCATCGGAGTCC

正向：GATCGGTCCTCGGTTAGAC

21PE222353

反向：AGTCACACAGCATGAGAAATC

正向：GCAATTTCACCATCTTCTGCT

22PE625853

反向：CCACGGTCATGGATGTTC

正向：TTGCTCATTGCACTCATCCT

23PE10145-15055

反向：GCAGACATTTCCTGGAGCA

正向：CCATAGTCCCAACAAGCATC

24PE12260-29055

反向：GCTGTGGACCCTAACTCAGTC

正向：TCAGGAAGATTGCATGTTAGT

25PE1326050

反向：CTGGGTTTTGTTTATGTTGC