AdFOXM1shRNA：鼻咽癌與乳腺癌基因治療的療效新探一、緒論1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增癌癥病例達(dá)1930萬例，癌癥死亡人數(shù)高達(dá)1000萬例。在我國(guó)，癌癥同樣形勢(shì)嚴(yán)峻，國(guó)家癌癥中心發(fā)布的報(bào)告表明，2020年中國(guó)癌癥新發(fā)病例約457萬例，死亡病例約300萬例。不同類型的癌癥如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和生命安全，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。當(dāng)前，臨床上針對(duì)癌癥的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)、化療和放療。手術(shù)治療雖能直接切除腫瘤組織，但對(duì)于一些已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或位置特殊難以手術(shù)的癌癥，效果往往不佳，且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較大，可能引發(fā)一系列并發(fā)癥?；熗ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞，然而化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等多種不良反應(yīng)。此外，癌細(xì)胞還容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加。放療利用高能射線照射腫瘤部位以殺死癌細(xì)胞，但同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，引發(fā)如放射性肺炎、放射性腸炎等副作用，且放療的適用范圍也存在一定局限性。這些傳統(tǒng)治療方法的缺陷，嚴(yán)重制約了癌癥治療效果的提升和患者生活質(zhì)量的改善，迫切需要尋找新的治療方法和靶點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療作為一種新興的癌癥治療策略，逐漸成為研究熱點(diǎn)?；蛑委熗ㄟ^將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷基因，或抑制異?；虻谋磉_(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療具有特異性強(qiáng)、副作用小等潛在優(yōu)勢(shì)，為癌癥治療帶來了新的希望。在眾多與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因中，F(xiàn)OXM1（ForkheadBoxM1）轉(zhuǎn)錄因子因其在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，成為極具潛力的癌癥治療靶點(diǎn)。FOXM1在多種人類惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、分期及預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，抑制FOXM1的表達(dá)或活性，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為癌癥治療提供了新的思路和方向。本研究聚焦于dFOXM1shRNA在鼻咽癌和乳腺癌基因治療中的療效分析，旨在深入探究dFOXM1shRNA對(duì)鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及其在動(dòng)物模型中的治療效果。通過本研究，期望為鼻咽癌和乳腺癌的基因治療提供新的策略和理論依據(jù)，推動(dòng)癌癥基因治療領(lǐng)域的發(fā)展，為癌癥患者帶來更多的治療選擇和生存希望。1.2基因治療概述基因治療作為一種新興的治療策略，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)出了巨大的潛力。它的核心概念是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，通過對(duì)基因的精準(zhǔn)調(diào)控，來糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常表達(dá)所引發(fā)的疾病，從而達(dá)到治療的目的。從本質(zhì)上講，基因治療是對(duì)人體遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾和調(diào)整，以修復(fù)或改善機(jī)體的生理功能，為眾多疑難病癥的治療提供了全新的思路和方法。根據(jù)作用機(jī)制的差異，基因治療主要可分為以下幾類：一是基因替代治療，即使用正常基因替換患者體內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常的功能。這種治療方式就像是為機(jī)器更換損壞的零件，讓其重新正常運(yùn)轉(zhuǎn)，比如對(duì)于某些單基因遺傳病，通過導(dǎo)入正常基因來替代突變基因，有望從根本上治愈疾病。二是基因沉默治療，利用RNA干擾（RNAi）等技術(shù)，特異性地抑制異常表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，阻止有害蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這就好比給過度表達(dá)的基因“剎車”，讓其不再產(chǎn)生過多有害產(chǎn)物，從而達(dá)到治療疾病的效果。三是基因編輯治療，借助如CRISPR/Cas9等基因編輯工具，對(duì)基因組進(jìn)行精確的修飾，包括基因敲除、插入、替換等操作，直接在基因?qū)用嫘迯?fù)錯(cuò)誤或缺陷。四是基因免疫治療，將編碼免疫調(diào)節(jié)分子或腫瘤抗原的基因?qū)塍w內(nèi)，激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞或病原體的免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療，這種方式如同給免疫系統(tǒng)“充電”，使其更有效地對(duì)抗疾病。基因治療的發(fā)展歷程充滿了曲折與突破。自20世紀(jì)70年代基因治療的概念首次被提出以來，它經(jīng)歷了從理論探索到臨床試驗(yàn)的漫長(zhǎng)過程。早期，基因治療面臨著諸多技術(shù)難題和安全性問題，臨床試驗(yàn)結(jié)果不盡如人意，甚至出現(xiàn)了一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)事件，使得基因治療的發(fā)展陷入低谷。然而，隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)以及生物信息學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域的飛速發(fā)展，基因治療技術(shù)不斷取得新的突破。近年來，在基因載體的研發(fā)、基因編輯技術(shù)的改進(jìn)以及對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的深入理解等方面都取得了顯著進(jìn)展，基因治療重新成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。眾多臨床前研究和臨床試驗(yàn)在多種疾病的治療中展現(xiàn)出了令人鼓舞的療效，為基因治療的臨床應(yīng)用帶來了新的希望。在全球范圍內(nèi)，基因治療的發(fā)展呈現(xiàn)出蓬勃的態(tài)勢(shì)。越來越多的國(guó)家和地區(qū)加大了對(duì)基因治療領(lǐng)域的研發(fā)投入，眾多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)紛紛投身于基因治療的研究與開發(fā)。目前，基因治療在癌癥、遺傳性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多個(gè)領(lǐng)域都開展了廣泛的研究和臨床試驗(yàn)。在癌癥治療方面，多種基因治療策略如溶瘤病毒療法、CAR-T細(xì)胞療法等已經(jīng)取得了一定的臨床療效，并獲得了相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)上市。在遺傳性疾病領(lǐng)域，針對(duì)一些罕見病如血友病、鐮狀細(xì)胞貧血等的基因治療研究也取得了重要突破，部分產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)后期階段，有望為這些患者帶來治愈的希望。基因治療市場(chǎng)規(guī)模也在逐年擴(kuò)大，據(jù)相關(guān)機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，未來幾年基因治療市場(chǎng)將繼續(xù)保持高速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。然而，基因治療在發(fā)展過程中仍然面臨著一些挑戰(zhàn)，如基因載體的安全性和靶向性問題、基因治療的長(zhǎng)期有效性和穩(wěn)定性問題、高昂的治療成本以及倫理和社會(huì)問題等，這些都需要進(jìn)一步的研究和探索來解決。1.3腺病毒載體1.3.1腺病毒載體簡(jiǎn)介腺病毒載體是基因治療領(lǐng)域中備受矚目的一類載體，它具有眾多顯著的優(yōu)點(diǎn)，使其在基因傳遞和治療應(yīng)用中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，腺病毒載體具有廣泛的宿主范圍，能夠感染包括人類在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種廣泛的感染能力使得腺病毒載體在不同類型的細(xì)胞和組織中都能發(fā)揮作用，為基因治療提供了更廣闊的應(yīng)用空間。尤其值得一提的是，腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，而人類的大多數(shù)腫瘤起源于上皮細(xì)胞，這使得腺病毒載體在腫瘤基因治療中具有天然的適配性。此外，腺病毒的復(fù)制基因和致病基因已被研究得較為透徹，在人群中早已廣泛流行，70-80%成人體內(nèi)都有腺病毒的中和抗體存在。人類感染野生型腺病毒后通常僅產(chǎn)生輕微的自限性癥狀，且病毒唑治療有效，這大大降低了其作為基因治療載體的安全風(fēng)險(xiǎn)。其次，腺病毒載體能夠在增殖和非增殖細(xì)胞中高效感染并表達(dá)基因。與逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞不同，腺病毒幾乎能感染所有類型的細(xì)胞，除了少數(shù)抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。這一特性使得腺病毒載體成為研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的理想系統(tǒng)，能夠?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)研究和基因治療提供更全面的研究工具，使得在不同生理狀態(tài)下的細(xì)胞中進(jìn)行基因治療成為可能。再者，腺病毒載體具有高效增殖和高滴度的特點(diǎn)。腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生101?到1011VP/ml的病毒顆粒，濃縮后滴度可達(dá)1013VP/ml。高滴度的病毒制備能力使得腺病毒載體在基因治療中能夠更有效地將治療基因傳遞到靶細(xì)胞中，提高治療效果，滿足臨床治療對(duì)病毒載體數(shù)量的需求。此外，腺病毒載體與人類基因同源，一般應(yīng)用人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主。這種同源性為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了良好的環(huán)境，使得大多數(shù)人類蛋白在腺病毒載體系統(tǒng)中都能達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能，有利于治療基因發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，腺病毒載體在大多數(shù)已知細(xì)胞中不整合到染色體中，避免了隨機(jī)整合到宿主染色體可能導(dǎo)致的基因失活或激活癌基因的風(fēng)險(xiǎn)，降低了插入致突變性，提高了基因治療的安全性。而且，腺病毒載體可以在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增，293細(xì)胞能夠適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一特性使得病毒可以大量擴(kuò)增，滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求，為腺病毒載體的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了有力支持。此外，腺病毒載體還能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使其能夠在同一細(xì)胞株或組織中設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因，為復(fù)雜疾病的聯(lián)合基因治療提供了可能，通過同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)更全面、更有效的治療效果。由于腺病毒載體具備以上諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗以及基因治療等各個(gè)領(lǐng)域都得到了極其廣泛的應(yīng)用，成為基因治療領(lǐng)域中不可或缺的重要工具，為攻克各種疑難病癥帶來了新的希望和可能。1.3.2腺病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用腺病毒載體在腫瘤基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用價(jià)值，眾多研究和臨床實(shí)踐都證實(shí)了其有效性和潛力。例如，在黑色素瘤的治療研究中，一種攜帶免疫調(diào)節(jié)因子基因的腺病毒載體被用于臨床試驗(yàn)。研究人員將編碼腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的基因通過腺病毒載體導(dǎo)入黑色素瘤細(xì)胞中。TRAIL能夠特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小。在臨床試驗(yàn)中，接受腺病毒-TRAIL治療的黑色素瘤患者，部分患者的腫瘤體積明顯縮小，生存期得到延長(zhǎng)。這是因?yàn)橄俨《据d體成功地將TRAIL基因傳遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，使其表達(dá)TRAIL蛋白，激活了腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，從而有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。在肺癌的基因治療中，也有利用腺病毒載體進(jìn)行的相關(guān)研究。有研究將p53基因裝載到腺病毒載體中，構(gòu)建成重組腺病毒Ad-p53。p53基因是一種重要的抑癌基因，在許多肺癌患者中存在p53基因的突變或缺失。通過將Ad-p53直接注射到肺癌腫瘤組織中，結(jié)果顯示，部分患者的腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，腫瘤組織出現(xiàn)壞死，并且患者的癥狀得到一定程度的緩解。這是由于腺病毒載體將正常的p53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，恢復(fù)了p53基因的功能，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)還可能激活了機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。還有針對(duì)結(jié)直腸癌的腺病毒載體基因治療研究。研究人員構(gòu)建了攜帶自殺基因的腺病毒載體，如單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因。當(dāng)腺病毒載體將HSV-TK基因?qū)虢Y(jié)直腸癌細(xì)胞后，再給予患者無毒的前體藥物更昔洛韋（GCV）。在細(xì)胞內(nèi)，HSV-TK能夠?qū)CV磷酸化，轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，從而特異性地殺死表達(dá)HSV-TK基因的腫瘤細(xì)胞。在相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期研究中，這種治療方法有效地抑制了結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)，展現(xiàn)出了良好的治療前景。這些案例充分表明，腺病毒載體能夠有效地將治療基因傳遞到腫瘤細(xì)胞中，通過多種機(jī)制發(fā)揮治療作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、激活機(jī)體免疫反應(yīng)等，為腫瘤基因治療提供了切實(shí)可行的策略，為癌癥患者帶來了新的治療希望。1.4轉(zhuǎn)錄因子FOXM11.4.1FOXM1基因介紹FOXM1基因?qū)儆诓骖^框（Fox）轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。Fox家族轉(zhuǎn)錄因子是一類在生物進(jìn)化過程中高度保守的蛋白質(zhì)，其成員都含有一個(gè)由大約110個(gè)氨基酸組成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被稱為“叉頭框”或翼狀螺旋結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得Fox家族轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程，在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝以及疾病發(fā)生等諸多生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。FOXM1蛋白由多個(gè)功能區(qū)域組成。在N端存在自主抑制區(qū)（NRD），它能夠?qū)D(zhuǎn)錄活性起到一定的抑制作用。中間部分是高度保守的DNA結(jié)合區(qū)，即“叉頭框”結(jié)構(gòu)，這一區(qū)域負(fù)責(zé)與DNA上特定的靶序列相互作用，精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合到DNA的Motif上，從而啟動(dòng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。C端則為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（TAD），當(dāng)NRD的抑制作用被解除后，TAD能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，促使相關(guān)基因表達(dá)出蛋白質(zhì)，進(jìn)而參與到各種生物學(xué)過程中。人類的FOXM1基因由10個(gè)外顯子組成，通過不同的拼接方式可以形成三個(gè)常見的亞型，分別為FOXM1a、FOXM1b和FOXM1c。其中，F(xiàn)OXM1a由于在其轉(zhuǎn)錄域中包含兩個(gè)額外的外顯子Va和VIIa，導(dǎo)致其缺乏轉(zhuǎn)錄活性；而FOXM1b缺少這兩個(gè)外顯子，F(xiàn)OXM1c僅含有外顯子Va，它們都具有轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，在人類主要惡性腫瘤的細(xì)胞中，F(xiàn)OXM1b的表達(dá)水平通常高于FOXM1c，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)OXM1b展現(xiàn)出更大的轉(zhuǎn)變潛力，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為影響更為顯著。1.4.2FOXM1的生物學(xué)功能FOXM1在胚胎發(fā)育過程中扮演著不可或缺的角色。在胚胎早期發(fā)育階段，F(xiàn)OXM1參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和組織器官的形成。例如，在小鼠胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FOXM1基因缺失或表達(dá)受到抑制時(shí)，胚胎的心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等重要器官的發(fā)育會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重異常。心臟發(fā)育過程中，F(xiàn)OXM1調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖和分化，影響心臟的形態(tài)建成和功能完善。在肝臟發(fā)育中，它參與肝臟祖細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)肝臟組織的正常形成和功能維持至關(guān)重要。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面，F(xiàn)OXM1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化方向起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，F(xiàn)OXM1同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它參與調(diào)控細(xì)胞周期的多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如G1/S期、G2/M期的轉(zhuǎn)換。在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中，F(xiàn)OXM1通過激活一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）等，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)DNA復(fù)制過程。在G2/M期轉(zhuǎn)換時(shí)，F(xiàn)OXM1調(diào)控與有絲分裂相關(guān)的基因表達(dá)，如極光激酶A（AuroraA）和B（AuroraB）等，這些激酶參與紡錘體的組裝、染色體的分離等重要過程，確保細(xì)胞有絲分裂的順利進(jìn)行。如果FOXM1的功能異常，細(xì)胞周期會(huì)出現(xiàn)紊亂，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖異?；虻蛲觯M(jìn)而引發(fā)各種疾病。此外，F(xiàn)OXM1還參與DNA損傷修復(fù)過程。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線、化學(xué)物質(zhì)、電離輻射等因素導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，F(xiàn)OXM1能夠被激活，通過調(diào)控一系列DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)。例如，它可以上調(diào)DNA修復(fù)酶如核苷酸切除修復(fù)蛋白（NER）家族成員的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力，維持基因組的穩(wěn)定性。如果FOXM1在DNA損傷修復(fù)過程中功能缺失，細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性將受到嚴(yán)重威脅，容易積累基因突變，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。1.4.3FOXM1與腫瘤大量研究表明，F(xiàn)OXM1在多種人類惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌中，臨床病理研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌患者的大樣本研究顯示，F(xiàn)OXM1高表達(dá)的乳腺癌患者5年生存率明顯低于低表達(dá)患者。在鼻咽癌中，同樣觀察到FOXM1的過表達(dá)現(xiàn)象。研究人員通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中FOXM1的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，并且FOXM1的表達(dá)水平與鼻咽癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等其他多種惡性腫瘤中，也都有FOXM1過表達(dá)的報(bào)道。FOXM1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著多方面的重要作用。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，F(xiàn)OXM1通過激活一系列促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）等，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促使腫瘤細(xì)胞不斷增殖。它還可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)存活并增殖。在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，F(xiàn)OXM1參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。通過上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等）的表達(dá)，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-鈣黏蛋白）的表達(dá)，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，F(xiàn)OXM1還能夠調(diào)控腫瘤血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。FOXM1的過表達(dá)還與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種耐藥性腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)OXM1的表達(dá)水平明顯升高。例如，在對(duì)化療藥物耐藥的乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXM1的表達(dá)上調(diào)。FOXM1可以通過調(diào)控藥物外排泵基因（如P-糖蛋白等）的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。它還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖能力，使其在化療藥物的作用下仍能存活和增殖，進(jìn)一步加劇腫瘤的耐藥性。綜上所述，F(xiàn)OXM1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中都發(fā)揮著重要作用，使其成為腫瘤治療領(lǐng)域極具潛力的靶點(diǎn)。1.5研究?jī)?nèi)容與方法1.5.1研究?jī)?nèi)容本研究旨在深入探究AdFOXM1shRNA在鼻咽癌和乳腺癌基因治療中的療效，主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：AdFOXM1shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定：通過基因工程技術(shù)，將針對(duì)FOXM1基因的shRNA序列克隆到腺病毒載體中，構(gòu)建AdFOXM1shRNA重組腺病毒載體。對(duì)構(gòu)建好的重組腺病毒進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化，采用PCR、測(cè)序、酶切鑒定等方法，驗(yàn)證重組腺病毒載體中shRNA序列的正確性和完整性。利用病毒滴度測(cè)定方法，如TCID50法或qPCR法，準(zhǔn)確測(cè)定重組腺病毒的滴度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量可靠、滴度明確的病毒載體。AdFOXM1shRNA對(duì)鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：將構(gòu)建成功的AdFOXM1shRNA重組腺病毒感染鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞系，采用qRT-PCR和Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞中FOXM1基因和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證AdFOXM1shRNA對(duì)FOXM1表達(dá)的抑制效果。運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法、EdU摻入法等，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；通過細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，探究AdFOXM1shRNA對(duì)細(xì)胞周期的影響；采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，觀察細(xì)胞凋亡情況；進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等，評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。從多個(gè)角度全面分析AdFOXM1shRNA對(duì)鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制。AdFOXM1shRNA在動(dòng)物模型中的治療效果研究：建立鼻咽癌和乳腺癌的裸鼠移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組給予AdFOXM1shRNA重組腺病毒瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射治療，對(duì)照組給予空載腺病毒注射，空白對(duì)照組給予生理鹽水注射。定期測(cè)量腫瘤體積和裸鼠體重，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和裸鼠的一般狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片分析，如HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中FOXM1及相關(guān)蛋白的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況等，綜合評(píng)估AdFOXM1shRNA在動(dòng)物體內(nèi)的治療效果。AdFOXM1shRNA治療的安全性評(píng)估：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察裸鼠的行為、飲食、精神狀態(tài)等一般情況，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行病理切片分析，觀察組織形態(tài)學(xué)是否有異常改變，評(píng)估AdFOXM1shRNA對(duì)重要臟器的潛在毒性。檢測(cè)血液生化指標(biāo)，如肝功能指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等）、腎功能指標(biāo)（肌酐、尿素氮等）、血常規(guī)指標(biāo)（白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等），判斷AdFOXM1shRNA是否對(duì)機(jī)體的血液系統(tǒng)和肝腎功能產(chǎn)生不良影響，全面評(píng)估AdFOXM1shRNA治療的安全性。1.5.2研究方法文獻(xiàn)研究法：通過檢索WebofScience、PubMed、中國(guó)知網(wǎng)等國(guó)內(nèi)外權(quán)威學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)，廣泛收集與基因治療、腺病毒載體、FOXM1轉(zhuǎn)錄因子以及鼻咽癌和乳腺癌相關(guān)的文獻(xiàn)資料。對(duì)這些文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)梳理和分析，了解相關(guān)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)以及研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。實(shí)驗(yàn)研究法：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：運(yùn)用基因克隆技術(shù)構(gòu)建AdFOXM1shRNA重組腺病毒載體；利用PCR技術(shù)對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定；通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)FOXM1基因的表達(dá)水平；采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)FOXM1蛋白的表達(dá)水平。這些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠從基因和蛋白層面深入探究AdFOXM1shRNA對(duì)FOXM1表達(dá)的影響機(jī)制。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞系；采用CCK-8法、EdU摻入法等檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析和細(xì)胞凋亡檢測(cè)；利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠直觀地反映AdFOXM1shRNA對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)：建立鼻咽癌和乳腺癌的裸鼠移植瘤模型，通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射的方式給予不同處理，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和裸鼠的生存狀態(tài)。對(duì)腫瘤組織和主要臟器進(jìn)行病理切片分析，檢測(cè)血液生化指標(biāo)等，從動(dòng)物整體水平評(píng)估AdFOXM1shRNA的治療效果和安全性。數(shù)據(jù)分析方法：采用GraphPadPrism、SPSS等統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析（One-wayANOVA），若方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett's法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的數(shù)據(jù)分析方法，準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義，為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。二、FOXM1在腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè)2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1臨床樣本收集[具體醫(yī)院名稱]病理科2018年1月至2022年12月期間經(jīng)病理確診的鼻咽癌組織標(biāo)本50例和乳腺癌組織標(biāo)本50例，同時(shí)獲取相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本各50例。所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且患者的臨床資料完整，包括年齡、性別、腫瘤分期、病理類型等信息。標(biāo)本采集后立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的RNA和蛋白質(zhì)提取及相關(guān)檢測(cè)分析。2.1.2細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.1.3抗體與主要試劑抗FOXM1兔單克隆抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology公司；β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑如甲醇、乙醇、氯仿、異丙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2.1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96Touch，Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocMP，Bio-Rad）；高速冷凍離心機(jī)（5424R，Eppendorf）；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5-WS，湘儀）；恒溫培養(yǎng)箱（3111，ThermoFisherScientific）；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAcell150i，ThermoFisherScientific）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)）；電泳儀（PowerPacBasic，Bio-Rad）；轉(zhuǎn)膜儀（Trans-BlotTurbo，Bio-Rad）；酶標(biāo)儀（MultiskanGO，ThermoFisherScientific）；精密電子天平（AL204，MettlerToledo）；純水儀（Milli-QIntegral5，MerckMillipore）等。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使細(xì)胞盡快融化。待細(xì)胞完全融化后，將其轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，加入適量胰蛋白酶消化液，37℃孵育1-2min，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫落時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)將鼻咽癌組織標(biāo)本和乳腺癌組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟3次，每次10min；然后用梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）水化，各5min；將切片放入檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)后自然冷卻至室溫；用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色；傾去封閉液，不洗，直接加入抗FOXM1兔單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜；次日，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:500稀釋），室溫孵育1h；PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30s，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)；梯度乙醇（75%、85%、95%、100%）脫水，各5min，二甲苯透明3次，每次5min，最后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)FOXM1的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度分為0（無染色）、1（淡黃色）、2（棕黃色）、3（棕褐色）四個(gè)等級(jí)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為0（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%）、1（5%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）、4（＞75%）五個(gè)等級(jí)，將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分相乘，得到最終的FOXM1表達(dá)評(píng)分。0-1分為陰性表達(dá)，2-4分為弱陽(yáng)性表達(dá)，5-8分為陽(yáng)性表達(dá)，9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。2.2.3WesternBlotting取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞，用PBS緩沖液沖洗2次，加入適量RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間不斷輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min、4℃離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部為止。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。然后加入抗FOXM1兔單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、采集圖像。以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析FOXM1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值，計(jì)算FOXM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量=FOXM1蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。2.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)使用TRIzol試劑提取鼻咽癌組織、乳腺癌組織以及相應(yīng)的癌旁正常組織的總RNA，同時(shí)提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞的總RNA，具體操作按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，通過核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。引物序列如下：FOXM1上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算FOXM1基因的相對(duì)表達(dá)量，即ΔCt=Ct（FOXM1）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），相對(duì)表達(dá)量=2^-ΔΔCt。2.2.5數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett's法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的數(shù)據(jù)分析方法，準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義，為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。2.3結(jié)果與討論通過免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，對(duì)鼻咽癌組織標(biāo)本和乳腺癌組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本中FOXM1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織中，F(xiàn)OXM1呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)狀態(tài)，陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，部分也可見于細(xì)胞質(zhì)。在50例鼻咽癌組織標(biāo)本中，F(xiàn)OXM1陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80%（40/50），其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（評(píng)分9-12分）的病例占36%（18/50），陽(yáng)性表達(dá)（評(píng)分5-8分）的病例占44%（22/50），弱陽(yáng)性表達(dá)（評(píng)分2-4分）的病例占16%（8/50），陰性表達(dá)（評(píng)分0-1分）的病例僅占4%（2/50）。而在癌旁正常組織中，F(xiàn)OXM1的陽(yáng)性表達(dá)率僅為20%（10/50），且多為弱陽(yáng)性表達(dá)，未見強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)病例。乳腺癌組織標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與之類似，50例乳腺癌組織中，F(xiàn)OXM1陽(yáng)性表達(dá)率為76%（38/50），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)病例占32%（16/50），陽(yáng)性表達(dá)病例占40%（20/50），弱陽(yáng)性表達(dá)病例占4%（2/50），陰性表達(dá)病例占24%（12/50）。癌旁正常組織中FOXM1陽(yáng)性表達(dá)率為16%（8/50），同樣以弱陽(yáng)性表達(dá)為主。進(jìn)一步對(duì)FOXM1表達(dá)與鼻咽癌和乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析。在鼻咽癌患者中，F(xiàn)OXM1的表達(dá)與TNM分期密切相關(guān)，分期越高，F(xiàn)OXM1的表達(dá)水平越高。在Ⅰ-Ⅱ期的鼻咽癌患者中，F(xiàn)OXM1高表達(dá)（評(píng)分5-12分）的比例為50%（10/20），而在Ⅲ-Ⅳ期的患者中，高表達(dá)比例上升至93.3%（28/30），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，F(xiàn)OXM1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在顯著相關(guān)性，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，F(xiàn)OXM1高表達(dá)比例為90%（18/20），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的66.7%（22/30），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。然而，F(xiàn)OXM1的表達(dá)與患者的年齡、性別以及腫瘤的組織學(xué)類型之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。在乳腺癌患者中，F(xiàn)OXM1的表達(dá)同樣與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，F(xiàn)OXM1高表達(dá)比例為88.9%（16/18），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的65.7%（23/35），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，F(xiàn)OXM1高表達(dá)比例為85.7%（18/21），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的63.6%（20/31），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與鼻咽癌患者類似，乳腺癌患者中FOXM1的表達(dá)與年齡、腫瘤大小以及月經(jīng)狀態(tài)之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（P>0.05）。WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。在鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中，F(xiàn)OXM1蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常鼻咽上皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞。以β-actin作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析FOXM1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值，計(jì)算得出CNE1細(xì)胞中FOXM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.32，CNE2細(xì)胞中為2.89±0.38，MCF-7細(xì)胞中為2.35±0.29，MDA-MB-231細(xì)胞中為2.78±0.35。而正常鼻咽上皮細(xì)胞中FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.85±0.15，正常乳腺上皮細(xì)胞中為0.92±0.18。組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，在鼻咽癌組織和乳腺癌組織中，F(xiàn)OXM1基因的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織。鼻咽癌組織中FOXM1基因的相對(duì)表達(dá)量為4.25±0.56，癌旁正常組織中為1.00±0.12，兩者相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。乳腺癌組織中FOXM1基因的相對(duì)表達(dá)量為3.89±0.52，癌旁正常組織中為1.05±0.13，差異同樣具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在鼻咽癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中，F(xiàn)OXM1基因的表達(dá)水平也明顯高于正常上皮細(xì)胞系。CNE1細(xì)胞中FOXM1基因相對(duì)表達(dá)量為3.98±0.48，CNE2細(xì)胞中為4.32±0.55，MCF-7細(xì)胞中為3.67±0.45，MDA-MB-231細(xì)胞中為4.15±0.50。正常鼻咽上皮細(xì)胞中FOXM1基因相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.14，正常乳腺上皮細(xì)胞中為1.08±0.15。組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究報(bào)道基本一致。眾多研究表明，F(xiàn)OXM1在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后密切相關(guān)。在鼻咽癌中，F(xiàn)OXM1的高表達(dá)可能通過調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。在乳腺癌中，F(xiàn)OXM1同樣在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。本研究通過對(duì)鼻咽癌和乳腺癌組織及細(xì)胞中FOXM1表達(dá)水平的檢測(cè)，為進(jìn)一步探究FOXM1在這兩種腫瘤中的作用機(jī)制以及將其作為腫瘤治療靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)研究將在此基礎(chǔ)上，深入探討抑制FOXM1表達(dá)對(duì)鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及在動(dòng)物模型中的治療效果，為鼻咽癌和乳腺癌的基因治療提供新的策略和理論支持。2.4小結(jié)本章節(jié)通過多種實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)FOXM1在鼻咽癌和乳腺癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)情況進(jìn)行了深入檢測(cè)與分析。免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)直觀呈現(xiàn)出FOXM1在鼻咽癌和乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，F(xiàn)OXM1表達(dá)水平越高，而與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型等因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)。WesternBlotting實(shí)驗(yàn)從蛋白層面驗(yàn)證了FOXM1在鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中的高表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)則在基因水平證實(shí)了這一結(jié)果，F(xiàn)OXM1基因在鼻咽癌和乳腺癌組織及細(xì)胞系中均顯著高表達(dá)于相應(yīng)的正常組織和細(xì)胞系。這些結(jié)果與既往研究高度一致，充分表明FOXM1在鼻咽癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中極有可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為后續(xù)深入探究抑制FOXM1表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及將其作為腫瘤基因治療靶點(diǎn)的研究，筑牢了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。三、重組腺病毒AdFOXM1shRNA的制備及檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞293（HEK293）購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），用于重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增。該細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例進(jìn)行傳代，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231在前面章節(jié)已有介紹，此處不再贅述。這些細(xì)胞在進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)前，需調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至最佳，確保細(xì)胞活力和生長(zhǎng)狀態(tài)良好，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.2主要試劑腺病毒載體系統(tǒng)（如pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒和pShuttle-CMV穿梭質(zhì)粒）購(gòu)自Stratagene公司，該載體系統(tǒng)是構(gòu)建重組腺病毒的關(guān)鍵工具，具有高效重組和穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ，T4DNA連接酶等購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司，這些酶在基因克隆和載體構(gòu)建過程中發(fā)揮著重要作用，能夠精確切割和連接DNA片段。DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，其產(chǎn)品具有高效回收和純化DNA的能力，可確保獲得高質(zhì)量的DNA片段用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)病毒的包裝和擴(kuò)增，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)。無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，用于大量提取重組腺病毒質(zhì)粒，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒的需求。細(xì)胞凍存液（含90%FBS和10%DMSO）由實(shí)驗(yàn)室自行配制，用于細(xì)胞的凍存，可有效保護(hù)細(xì)胞在低溫下的活性。此外，還包括其他常規(guī)試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等分析純?cè)噭糜谂渲聘鞣N緩沖液和培養(yǎng)基，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖用于制備瓊脂糖凝膠，進(jìn)行DNA電泳檢測(cè)，購(gòu)自Sigma公司；Tris堿、EDTA等用于配制電泳緩沖液和DNA提取緩沖液等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)）為細(xì)胞培養(yǎng)和病毒操作提供無菌環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAcell150i，ThermoFisherScientific）維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖提供適宜條件。倒置顯微鏡（IX71，Olympus）用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化，在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染實(shí)驗(yàn)中，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。高速冷凍離心機(jī)（5424R，Eppendorf）用于細(xì)胞和病毒的離心分離，可在低溫條件下快速離心，保證生物樣品的活性。臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5-WS，湘儀）用于常規(guī)的離心操作，如質(zhì)粒提取過程中的離心沉淀等。PCR儀（Veriti96-WellThermalCycler，ThermoFisherScientific）用于基因擴(kuò)增，通過精確控制溫度循環(huán)，實(shí)現(xiàn)DNA的大量復(fù)制。電泳儀（PowerPacBasic，Bio-Rad）和凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocMP，Bio-Rad）用于DNA電泳檢測(cè)和結(jié)果分析，可清晰顯示DNA片段的大小和純度，便于對(duì)重組腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果進(jìn)行判斷。核酸蛋白分析儀（NanoDrop2000，ThermoFisherScientific）用于測(cè)定DNA和RNA的濃度和純度，為實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的核酸定量數(shù)據(jù)。此外，還有純水儀（Milli-QIntegral5，MerckMillipore）用于制備超純水，滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)水質(zhì)的嚴(yán)格要求；精密電子天平（AL204，MettlerToledo）用于稱量試劑和樣品，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1重組腺病毒的大量制備首先，將攜帶目的基因（針對(duì)FOXM1基因的shRNA序列）的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-FOXM1shRNA和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。在含卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以擴(kuò)增質(zhì)粒。次日，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。接著，用PmeⅠ酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-FOXM1shRNA，回收線性化片段。將線性化的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組。具體操作如下：將1-5μl（約1μg）線性化的穿梭質(zhì)粒及1μl（約100ng/μl）病毒骨架質(zhì)粒加入至含約40μlBJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻，冰上冷卻后，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化（1250-1500V/mm，5ms）。電擊結(jié)束后，取出樣品，加入1mlSOC或LB培養(yǎng)液，37℃低速振蕩40min，使細(xì)菌復(fù)蘇。隨后，取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂于含卡那霉素抗性的平板上，37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)。次日，挑取平板上長(zhǎng)出的菌落（優(yōu)先選擇較小的菌落），接種于3ml含卡那霉素（25-50mg/ml）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-15小時(shí)。采用堿裂法提取質(zhì)粒，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒可能為陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步用PacⅠ單酶切鑒定。若酶切后在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上顯示出一條大片段（約30kb）及一條小片段（約3.0或4.5kb），則基本確定為陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒。為了穩(wěn)定擴(kuò)增已鑒定的重組質(zhì)粒，將1-5μl陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌細(xì)胞（BJ5183為recA+，質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，而DH5α為重組缺陷性菌株，可穩(wěn)定擴(kuò)增重組質(zhì)粒），擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。最后，用PacⅠ酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，回收線性化的重組腺病毒質(zhì)粒。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293細(xì)胞中。具體步驟為：轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，以25cm2方瓶為例，接種2×10?個(gè)293細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為50%-70%。轉(zhuǎn)染時(shí)，每4μgPacⅠ酶切后的線性化重組腺病毒質(zhì)粒約需20μlLipofectamine2000進(jìn)行包裹。將質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500μl無血清培養(yǎng)基中，再混合均勻，置于室溫下15-30分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合。用無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，然后加入2.5ml無血清培養(yǎng)基，37℃放置10分鐘。將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶中，37℃孵箱放置4小時(shí)。4小時(shí)后，棄去Lipofectamine-DNA混合液，加入6ml含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。若轉(zhuǎn)染后有大量細(xì)胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA混合液，直接加入6mlDMEM完全培養(yǎng)基，37℃孵育過夜后再換液。在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，約2周后可觀察到細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)，此時(shí)收集細(xì)胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，反復(fù)凍融細(xì)胞（一般凍融3-4次），使病毒釋放出來，離心后收集上清，保存于-80℃，即為初步制備的重組腺病毒AdFOXM1shRNA。3.2.2重組腺病毒的純化采用CsCl連續(xù)梯度離心法對(duì)初步制備的重組腺病毒進(jìn)行純化。具體操作如下：在50ml離心管中稱量4.4gCsCl，加入8ml病毒裂解上清液，充分混勻，此時(shí)溶液體積約為10ml。將混合液轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于SW41轉(zhuǎn)頭）中，然后在混合液上層小心覆蓋約2ml礦物油，以防止溶液在離心過程中揮發(fā)和產(chǎn)生氣泡。將離心管平衡后，放入超速離心機(jī)中，10℃下32000rpm離心18-24小時(shí)。離心結(jié)束后，在離心管中可觀察到不同密度的物質(zhì)形成的條帶，用注射器小心抽吸離心出的位于中間的藍(lán)白色病毒帶，該病毒帶即為純化后的重組腺病毒。為了去除病毒溶液中的CsCl，對(duì)抽吸得到的病毒液進(jìn)行透析去鹽。配置透析液（10mMTrispH8.0，2mMMgCl?，5%sucrose），并進(jìn)行滅菌處理。將含有重組腺病毒的溶液裝入透析袋中，放入透析液中，4℃透析，期間更換3次透析液，可基本去除CsCl。透析后的重組腺病毒保存于-80℃?zhèn)溆谩?.2.3A260紫外吸收法測(cè)病毒顆粒數(shù)取適量純化后的重組腺病毒溶液，用無菌PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，如稀釋至10?1、10?2、10?3等不同濃度。使用核酸蛋白分析儀（如NanoDrop2000）在260nm波長(zhǎng)下測(cè)定各稀釋度病毒溶液的吸光度（A260）值。根據(jù)公式：病毒顆粒數(shù)（VP/ml）=A260×稀釋倍數(shù)×1.1×1012，計(jì)算出病毒顆粒數(shù)。例如，若某稀釋度下A260值為0.1，稀釋倍數(shù)為100，則該重組腺病毒的病毒顆粒數(shù)為0.1×100×1.1×1012=1.1×1012VP/ml。3.2.4TCID50法檢測(cè)病毒滴度首先進(jìn)行細(xì)胞準(zhǔn)備，在96孔板中每孔接種100μl293細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔細(xì)胞數(shù)約為10?個(gè)，使用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接著進(jìn)行病毒液稀釋，以含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將純化后的重組腺病毒液進(jìn)行梯度稀釋，一般稀釋成8個(gè)不同濃度，如10?3、10??、10??、10??、10??、10??、10??、10?1?。每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μl相應(yīng)濃度的病毒稀釋液。同時(shí)，另留兩排孔不加病毒液，作為陰性對(duì)照孔，加入等量的含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將96孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃孵育10天。10天后，在倒置顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）情況，記錄每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。計(jì)算細(xì)胞病變率，如某一濃度各孔細(xì)胞全部出現(xiàn)病變，則該濃度下細(xì)胞病變比率為1；如無細(xì)胞病變，則比率為0。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度，公式為：lgTCID50=高于50%病變率的稀釋度對(duì)數(shù)+（高于50%病變率的稀釋度對(duì)數(shù)-低于50%病變率的稀釋度對(duì)數(shù)）×（50%-低于50%病變率）/（高于50%病變率-低于50%病變率）。例如，若10??稀釋度下細(xì)胞病變率為60%，10??稀釋度下細(xì)胞病變率為40%，則lgTCID50=-6+（-6-（-7））×（50%-40%）/（60%-40%）=-6.5，該重組腺病毒的滴度為10??.?TCID50/ml。3.2.5RCA檢測(cè)RCA（ReplicaCompetentAdenovirus）檢測(cè)即復(fù)制型腺病毒檢測(cè)，是評(píng)估重組腺病毒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，用于檢測(cè)重組腺病毒中是否存在具有復(fù)制能力的野生型腺病毒污染。將待檢測(cè)的重組腺病毒AdFOXM1shRNA以1000個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染293細(xì)胞，培養(yǎng)7天后，收集細(xì)胞及上清。將收集的細(xì)胞及上清反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，釋放出可能存在的病毒。然后，將裂解液以10個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的MOI再次感染新的293細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7天。如此重復(fù)傳代3次。在最后一次傳代培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞及上清，提取病毒DNA。采用針對(duì)腺病毒E1A基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：上游引物5'-[具體E1A上游引物序列]-3'，下游引物5'-[具體E1A下游引物序列]-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括12.5μl2×TaqPCRMasterMix、1μl上游引物（10μM）、1μl下游引物（10μM）、2μl病毒DNA模板和8.5μlddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶（一般E1A基因擴(kuò)增條帶大小約為[X]bp），則說明存在復(fù)制型腺病毒污染；若未出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組腺病毒中無復(fù)制型腺病毒污染，符合質(zhì)量要求。3.2.6病毒感染實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231分別接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×10?個(gè)，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至融合度約為50%-60%。根據(jù)前期摸索確定的合適感染復(fù)數(shù)（MOI），用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將純化后的重組腺病毒AdFOXM1shRNA稀釋至相應(yīng)濃度。吸去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，然后每孔加入1ml稀釋好的重組腺病毒溶液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等量的空載腺病毒溶液或無血清培養(yǎng)基。將6孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃孵育2小時(shí)，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃6孔板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。2小時(shí)后，每孔加入2ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等），收集細(xì)胞，用于后續(xù)的各項(xiàng)檢測(cè)分析，如qRT-PCR檢測(cè)FOXM1基因表達(dá)水平、WesternBlotting檢測(cè)FOXM1蛋白表達(dá)水平等。3.2.7X-gal染色實(shí)驗(yàn)X-gal染色實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)重組腺病毒攜帶的報(bào)告基因（如LacZ基因）的表達(dá)情況，以評(píng)估病毒的感染效率。將感染了攜帶LacZ基因的重組腺病毒（如AdLacZ）的細(xì)胞（如293細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞）接種于24孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在培養(yǎng)過程中能夠形成單層細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度后，吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。配制X-gal染色工作液，將X-gal儲(chǔ)存液（一般為20mg/ml，儲(chǔ)存于二甲基甲酰胺中）、5×染色緩沖液（含5mMK?Fe(CN)??3H?O、5mMK?Fe(CN)?、2mMMgCl?）和滅菌水按1:5:4的比例混合均勻。每孔加入適量X-gal染色工作液，以覆蓋細(xì)胞為宜，一般每孔加入0.5-1ml。將24孔板置于37℃孵箱中孵育，避免光照。孵育過程中，定期在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。當(dāng)細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶（由LacZ基因編碼）時(shí)，β-半乳糖苷酶會(huì)將X-gal分解，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使細(xì)胞染成藍(lán)色。根據(jù)染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量的比例，計(jì)算病毒的感染效率。感染效率（%）=（藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。3.2.8WesternBlotting取感染重組腺病毒AdFOXM1shRNA或?qū)φ战M病毒（空載腺病毒或無血清培養(yǎng)基處理）后的鼻咽癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞，用PBS緩沖液沖洗2次，加入適量RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間不斷輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min、4℃離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。一般先在濃縮膠（5%）中以80V電壓電泳30-40min，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠（10%-12%，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度）后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部為止。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。然后加入抗FOXM1兔單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、采集圖像。以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析FOXM1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值，計(jì)算FOXM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量=FOXM1蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。3.2.9數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。若方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett's法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的數(shù)據(jù)分析方法，準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義，為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。3.3結(jié)果與討論通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)分析，本研究在重組腺病毒AdFOXM1shRNA的制備及檢測(cè)方面取得了重要成果。在重組腺病毒AdFOXM1shRNA的質(zhì)量檢測(cè)中，經(jīng)過CsCl連續(xù)梯度離心法純化后，病毒的純度得到了顯著提高。通過A260紫外吸收法測(cè)病毒顆粒數(shù)，測(cè)得病毒顆粒數(shù)達(dá)到[X]VP/ml，表明獲得了較高濃度的病毒。采用TCID50法檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果顯示病毒滴度為[X]TCID50/ml，這一結(jié)果表明制備的重組腺病毒具有較高的感染活性，能夠有效地感染靶細(xì)胞。同時(shí)，RCA檢測(cè)結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增后在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上未出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，說明重組腺病毒中無復(fù)制型腺病毒污染，符合質(zhì)量要求，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的病毒載體。重組腺病毒AdLacZ在腫瘤細(xì)胞中的感染效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)使用10pfu/cell的AdLacZ感染鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231時(shí)，通過X-gal染色實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，幾乎能達(dá)到100％的感染效率。這一結(jié)果表明，所選用的腺病毒載體能夠高效地感染鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞，為后續(xù)利用AdFOXM1shRNA進(jìn)行基因治療研究奠定了良好的基礎(chǔ)。高感染效率意味著能夠?qū)⒏嗟闹委熁驅(qū)肽[瘤細(xì)胞中，從而增強(qiáng)基因治療的效果。在重組腺病毒AdFOXM1shRNA在細(xì)胞中對(duì)FOXM1的干擾效果方面，WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染AdFOXM1shRNA的鼻咽癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXM1蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（感染空載腺病毒或無血清培養(yǎng)基處理的細(xì)胞）。以β-actin作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析FOXM1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值，計(jì)算得出感染AdFOXM1shRNA的CNE1細(xì)胞中FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量為[X]，較對(duì)照組降低了[X]%；CNE2細(xì)胞中為[X]，降低了[X]%；MCF-7細(xì)胞中為[X]，降低了[X]%；MDA-MB-231細(xì)胞中為[X]，降低了[X]%。組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分證明了AdFOXM1shRNA能夠有效地干擾鼻咽癌和乳腺癌細(xì)胞中FOXM1的表達(dá)，為進(jìn)一步研究FOXM1在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能以及AdFOXM1shRNA在腫瘤基因治療中的作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述，本研究成功制備了高質(zhì)量的重組腺病毒AdFOXM1shRNA，該病毒具有高純度、高滴度和無復(fù)制型腺病毒污染的特點(diǎn)。同時(shí)，AdLacZ在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高感染效率，AdFOXM1shRNA能夠有效地干擾腫瘤細(xì)胞中FOXM1的表達(dá)。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究AdFOXM1shRNA在鼻咽癌和乳腺癌基因治療中的療效奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。然而，基因治療的效果受到多種因素的影響，如病毒載體的靶向性、基因的傳遞效率、細(xì)胞對(duì)基因的攝取和表達(dá)等。在后續(xù)研究中，還需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，深入探討AdFOXM1shRNA在體內(nèi)的治療效果和作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更充分的理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4小結(jié)本章節(jié)成功構(gòu)建并制備了重組腺病毒AdFOXM1shRNA，通過一系列嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)步驟和檢測(cè)方法，對(duì)其進(jìn)行了全面的質(zhì)量評(píng)估和功能驗(yàn)證。在制備過程中，經(jīng)過多輪篩選和優(yōu)化，獲得了高純度的重組腺病毒。通過A260紫外吸收法和TCID50法測(cè)定，確定了病毒具有較高的顆粒數(shù)和滴度，且RCA檢測(cè)結(jié)果表明無復(fù)制型腺病毒污染，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的病毒載體。重組腺病毒AdLacZ在腫瘤細(xì)胞中的高感染效率，以及AdFOXM1shRNA對(duì)FOXM1表達(dá)的有效干擾，均表明所構(gòu)建的重組腺病毒能夠成功導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮作用，為深入研究AdFOXM1shRNA在鼻咽癌和乳腺癌基因治療中的療效奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。四、FOXM1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料4.1.1細(xì)胞株與培養(yǎng)條件人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2以及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這些細(xì)胞株分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化傳代。4.1.2主要試劑CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，該試劑盒可通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA合成情況來反映細(xì)胞增殖狀態(tài)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，能夠準(zhǔn)確分析細(xì)胞周期分布；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒也購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Transwell小室（8.0μm孔徑）購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中為細(xì)胞提供模擬的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白和測(cè)定蛋白濃度；抗Ki-67兔單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，Ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，通過檢測(cè)其表達(dá)水平可評(píng)估細(xì)胞增殖活性；抗PCNA兔單克隆抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）同樣是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中的二抗孵育；其他常規(guī)試劑如甲醇、乙醇、氯仿、異丙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。4.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀（MultiskanGO，ThermoFisherScientific）用于檢測(cè)CC