“肺常不足”視角下雙表法抗流感病毒感染及TLR信號通路時效關(guān)系探究一、引言1.1研究背景與意義流感，作為一種極具影響力的急性呼吸道傳染病，一直以來都是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域重點關(guān)注的對象。其病原體為流感病毒，依據(jù)核蛋白與基質(zhì)蛋白抗原性的差異，可細(xì)分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。在這三型流感病毒中，甲型流感病毒由于其抗原極易發(fā)生變異，往往會引發(fā)全球性的大流行；乙型流感病毒雖相對較為穩(wěn)定，但也能在局部地區(qū)引起規(guī)模較大的爆發(fā)；丙型流感病毒通常僅導(dǎo)致散發(fā)的小規(guī)模感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)，每年因流感導(dǎo)致的患病人數(shù)高達10億左右，其中約有300-500萬例為重癥病例，而死亡人數(shù)更是在29-65萬之間波動。這不僅給患者個人帶來了身心上的巨大痛苦，還對社會醫(yī)療資源造成了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響了社會的正常運轉(zhuǎn)與經(jīng)濟的穩(wěn)定發(fā)展。兒童群體在流感面前顯得尤為脆弱，是流感的高發(fā)易感人群。從生理結(jié)構(gòu)來看，兒童的呼吸道相較于成人更為短小且狹窄，氣管和支氣管的軟骨柔軟，缺乏彈性組織，黏液腺分泌不足，纖毛運動能力較弱，這些特點使得兒童呼吸道的防御功能相對較弱，難以有效抵御流感病毒的侵襲。在免疫系統(tǒng)方面，兒童的免疫系統(tǒng)尚處于發(fā)育階段，功能尚未健全，無論是細(xì)胞免疫還是體液免疫，都無法與成年人相媲美。他們對流感病毒的識別、清除能力相對不足，一旦感染，病毒在體內(nèi)的復(fù)制和擴散往往更為迅速，從而導(dǎo)致病情發(fā)展更為迅猛，癥狀也更為嚴(yán)重。相關(guān)研究表明，在流感流行季節(jié)，兒童流感的發(fā)病率可高達20%-30%，顯著高于成年人。并且，兒童感染流感后，更容易引發(fā)諸如中耳炎、鼻竇炎、肺炎、心肌炎、腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，這些并發(fā)癥不僅會增加患兒的痛苦，延長病程，甚至可能對兒童的生長發(fā)育造成不可逆的損害，威脅其生命健康。在中醫(yī)理論體系中，“肺常不足”是小兒生理病理的重要特點之一。這一理論最早可追溯至明代兒科名醫(yī)萬全所著的《育嬰家秘》。所謂“肺常不足”，主要涵蓋了以下幾個方面的內(nèi)涵。從生理結(jié)構(gòu)層面來講，小兒肺臟的解剖組織結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育成熟，如肺泡數(shù)量相對較少，肺泡壁較薄，彈力纖維發(fā)育不全等。這些結(jié)構(gòu)上的特點導(dǎo)致小兒肺的氣體交換功能相對較弱，對氧氣的攝取和二氧化碳的排出能力不如成人。在生理功能方面，小兒肺的主氣、司呼吸、宣發(fā)肅降等功能均尚未健全。肺主氣，司呼吸，小兒肺氣不足，呼吸功能就相對較弱，呼吸頻率往往比成人更快，且呼吸深度較淺。肺的宣發(fā)肅降功能失常，則容易導(dǎo)致水液代謝紊亂，出現(xiàn)咳嗽、咯痰等癥狀。此外，小兒形氣未充，臟腑嬌嫩，衛(wèi)外功能較弱，外邪入侵時，常常首先侵犯肺臟。“肺為華蓋”，居于高位，直接與外界相通，自然界中的六淫之邪，如風(fēng)寒、風(fēng)熱、暑濕等，以及時行疫氣，都極易通過口鼻侵犯肺臟，引發(fā)感冒、咳嗽、哮喘、肺炎等呼吸道疾病。而且，由于小兒肺臟既易受邪，又不耐寒熱，一旦患病，病情變化迅速，容易出現(xiàn)傳變，如從普通感冒迅速發(fā)展為肺炎等重癥?；谛骸胺纬２蛔恪钡纳聿±硖攸c，本研究創(chuàng)新性地提出運用雙表法來對抗流感病毒感染。雙表法主要由解表法與固表法有機結(jié)合而成。解表法以銀翹散為代表方劑，銀翹散出自清代吳鞠通的《溫病條辨》，方中金銀花、連翹清熱解毒、疏散風(fēng)熱為君藥；薄荷、荊芥穗、淡豆豉辛散表邪，透熱外出為臣藥；牛蒡子、桔梗、甘草宣肺利咽，竹葉清熱生津為佐藥。諸藥合用，共奏辛涼透表、清熱解毒之功，可有效疏散肌表之邪，使邪有出路。固表法以玉屏風(fēng)散為代表方劑，玉屏風(fēng)散源自元代危亦林的《世醫(yī)得效方》，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味藥組成。黃芪補氣固表為君藥，白術(shù)健脾益氣，助黃芪加強益氣固表之力為臣藥，防風(fēng)走表而散風(fēng)邪，與黃芪、白術(shù)相配，補中寓散，使固表而不留邪。兩藥合用，雙表法一方面通過解表法疏散外邪，使入侵之流感病毒得以清除；另一方面利用固表法增強機體的衛(wèi)外功能，提高小兒的抵抗力，預(yù)防流感病毒的再次侵襲。Toll樣受體（TLR）信號通路在機體抗病毒免疫過程中扮演著至關(guān)重要的角色。TLR是一類重要的模式識別受體，能夠識別流感病毒等病原體相關(guān)分子模式（PAMP）。當(dāng)流感病毒感染機體后，病毒的核酸、蛋白等成分作為PAMP被TLR識別，進而激活下游一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。以TLR4信號通路為例，流感病毒感染后，TLR4與配體結(jié)合，招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）相互作用，激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6進一步激活核因子-κB（NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK）和IκB激酶（IKK），使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB。NF-κB進入細(xì)胞核，啟動一系列炎癥因子和干擾素等免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些炎癥因子和干擾素在抗病毒免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如干擾素可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒的復(fù)制和傳播。然而，過度激活的TLR信號通路也可能導(dǎo)致炎癥因子風(fēng)暴的發(fā)生，引發(fā)機體過度的免疫反應(yīng)，對組織和器官造成損傷。因此，深入研究雙表法對流感病毒感染TLR信號通路的影響及其時效關(guān)系，對于揭示雙表法的抗流感作用機制，明確其在不同時間節(jié)點對免疫反應(yīng)的調(diào)控規(guī)律，具有重要的理論意義。在臨床應(yīng)用方面，本研究成果也具有極高的應(yīng)用價值。當(dāng)前，臨床上針對小兒流感的治療主要以抗病毒藥物為主，如奧司他韋等。然而，長期使用抗病毒藥物不僅容易導(dǎo)致病毒耐藥性的產(chǎn)生，還可能帶來一系列不良反應(yīng)。而中醫(yī)藥在治療小兒流感方面具有獨特的優(yōu)勢，雙表法作為一種基于中醫(yī)理論的創(chuàng)新療法，具有整體調(diào)節(jié)、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點。通過本研究，能夠為雙表法在小兒流感臨床治療中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)臨床醫(yī)生更加合理、有效地運用雙表法治療小兒流感，提高臨床療效，減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低醫(yī)療成本，為廣大兒童的健康保駕護航。同時，本研究也為中醫(yī)藥抗流感病毒的研究提供了新的思路和方法，有助于推動中醫(yī)藥在抗病毒領(lǐng)域的深入發(fā)展，促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程。1.2研究目的與內(nèi)容本研究的目的是基于小兒“肺常不足”的理論，深入探究雙表法抗流感病毒感染的作用機制，以及其與TLR信號通路之間的時效關(guān)系，為臨床治療小兒流感提供更為科學(xué)、有效的理論依據(jù)和治療方案。具體研究內(nèi)容如下：1.2.1“肺常不足”立論機制研究對“肺常不足”理論進行全面、深入的溯源。詳細(xì)梳理中醫(yī)古籍中關(guān)于小兒“肺常不足”理論的記載，包括其首次提出的文獻出處、歷代醫(yī)家對該理論的闡述與發(fā)展，以及該理論在中醫(yī)兒科學(xué)中的重要地位和應(yīng)用情況。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度，分析“肺常不足”理論的內(nèi)涵，如小兒肺臟在解剖結(jié)構(gòu)上的特點，包括肺泡數(shù)量、肺泡壁厚度、彈力纖維發(fā)育程度等；在生理功能方面，肺的氣體交換、主氣、司呼吸、宣發(fā)肅降等功能的發(fā)育狀況；以及在免疫系統(tǒng)方面，小兒細(xì)胞免疫和體液免疫功能的特點。探討“肺常不足”與小兒肺系病證體質(zhì)易感性之間的關(guān)系，分析為何小兒由于“肺常不足”更容易感染流感病毒等病原體，引發(fā)感冒、咳嗽、哮喘、肺炎等肺系疾病。研究“肺常不足”理論在小兒肺系病證治療中的應(yīng)用，總結(jié)中醫(yī)臨床根據(jù)“肺常不足”理論制定的治療原則、常用方劑和治療方法。還將研究“肺常不足”理論與小兒保健調(diào)攝的聯(lián)系，為小兒日常保健提供理論指導(dǎo)，如飲食調(diào)理、生活起居、運動鍛煉等方面如何根據(jù)“肺常不足”的特點進行合理安排。建立幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒的動物模型，對比兩者在感染流感病毒后的發(fā)病情況、癥狀表現(xiàn)、病理變化等。觀察幼齡鼠和成齡鼠在感染流感病毒后的一般狀態(tài)，如精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等；記錄其體溫變化、體重變化等生理指標(biāo)；通過病理切片觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變，包括肺泡結(jié)構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤情況等。分析幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒動物模型的差異，探討幼齡鼠作為模擬小兒“肺常不足”感染流感病毒模型的優(yōu)勢和可行性。通過實驗研究，對比幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒后TLR4-NF-κB信號通路的改變情況。檢測幼齡鼠和成齡鼠感染流感病毒后不同時間點肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等信號通路關(guān)鍵分子的表達水平，包括mRNA和蛋白表達水平，采用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)。分析TLR4-NF-κB信號通路在幼齡鼠和成齡鼠感染流感病毒過程中的激活程度和變化趨勢，探討“肺常不足”狀態(tài)下幼齡鼠TLR4-NF-κB信號通路的特點及其與流感病毒感染的關(guān)系。1.2.2雙表法藥效學(xué)體內(nèi)外實驗研究進行雙表法對流感病毒感染雞胚的保護作用實驗。通過雞胚培養(yǎng)法，觀察銀翹散、玉屏風(fēng)散及雙表法（銀翹散與玉屏風(fēng)散聯(lián)合應(yīng)用）在不同時間點對流感病毒感染雞胚的治療作用。測定培養(yǎng)后雞胚的血凝滴度，以此評估雙表法對流感病毒的抑制效果；觀察雞胚的死亡情況、病變程度等指標(biāo)，分析雙表法對流感病毒感染雞胚的保護作用。對比銀翹散、玉屏風(fēng)散單方與雙表法對流感病毒感染雞胚保護作用的差異，探討雙表法聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢。在小鼠體內(nèi)進行實驗，研究雙表法對流感病毒感染小鼠TLR4-NF-κB信號通路的影響。以流感病毒滴鼻感染小鼠，建立小鼠流感模型，分別用解表法（銀翹散）、固表法（玉屏風(fēng)散）、雙表法（玉屏風(fēng)散+銀翹散）、陽性對照藥（利巴韋林）干預(yù)相應(yīng)組別小鼠。在感染病毒后的不同時間點，采用免疫組織化學(xué)染色法、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，檢測小鼠肺組織中TLR4-NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的表達情況。分析雙表法對TLR4-NF-κB信號通路的調(diào)控作用，以及這種調(diào)控作用與雙表法抗流感病毒效果之間的關(guān)系，探討雙表法抗流感病毒的作用機制是否與調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號通路有關(guān)。1.2.3解表法經(jīng)典方劑銀翹散指紋圖譜研究采用高效液相色譜（HPLC）等現(xiàn)代分析技術(shù)，建立銀翹散的指紋圖譜。對銀翹散中的主要化學(xué)成分進行分離和鑒定，確定指紋圖譜中的特征峰，并對特征峰進行歸屬，明確其對應(yīng)的化學(xué)成分。通過對不同批次銀翹散的指紋圖譜分析，考察銀翹散質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性，為銀翹散的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。研究銀翹散指紋圖譜與雙表法抗流感病毒藥效之間的相關(guān)性，探索能否通過指紋圖譜來評價銀翹散在雙表法中的藥效貢獻，為雙表法的臨床應(yīng)用和質(zhì)量評價提供新的思路和方法。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用多種研究方法，確保研究的科學(xué)性、全面性和深入性，具體如下：1.3.1文獻研究法全面收集和整理中醫(yī)古籍中關(guān)于小兒“肺常不足”理論的相關(guān)記載，包括歷代醫(yī)家的論述、臨床經(jīng)驗總結(jié)等。利用中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫等電子資源，檢索現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中關(guān)于小兒肺臟解剖結(jié)構(gòu)、生理功能、免疫系統(tǒng)特點以及流感病毒感染機制、TLR信號通路等方面的研究文獻。對國內(nèi)外關(guān)于雙表法、銀翹散、玉屏風(fēng)散的藥理作用、臨床應(yīng)用、作用機制等研究進行系統(tǒng)梳理，為研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。通過文獻研究，深入挖掘“肺常不足”理論的內(nèi)涵，明確小兒流感的發(fā)病機制和治療靶點，為后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)。1.3.2實驗研究法動物實驗：選取健康的幼齡鼠與成齡鼠，隨機分為正常對照組、模型組、解表法組、固表法組、雙表法組、陽性對照組等。采用滴鼻法將流感病毒接種到小鼠體內(nèi)，建立流感病毒感染動物模型。解表法組給予銀翹散灌胃，固表法組給予玉屏風(fēng)散灌胃，雙表法組給予銀翹散和玉屏風(fēng)散聯(lián)合灌胃，陽性對照組給予利巴韋林灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。在感染后的不同時間點（如1d、3d、5d、7d等），觀察小鼠的一般狀態(tài)（精神狀態(tài)、飲食、活動等）、體溫、體重等指標(biāo)。處死小鼠，取肺組織，進行病理切片觀察，了解肺組織的病理變化；采用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)，檢測肺組織中TLR4-NF-κB信號通路關(guān)鍵分子（如TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等）的mRNA和蛋白表達水平。通過動物實驗，對比幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒后的差異，研究雙表法對流感病毒感染小鼠的治療作用以及對TLR4-NF-κB信號通路的影響。細(xì)胞實驗：選用合適的細(xì)胞系（如MDCK細(xì)胞等），進行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞分為正常對照組、病毒對照組、解表法藥物干預(yù)組、固表法藥物干預(yù)組、雙表法藥物干預(yù)組、陽性藥物對照組。在細(xì)胞中接種流感病毒，建立細(xì)胞感染模型。解表法藥物干預(yù)組加入銀翹散提取物，固表法藥物干預(yù)組加入玉屏風(fēng)散提取物，雙表法藥物干預(yù)組加入銀翹散和玉屏風(fēng)散聯(lián)合提取物，陽性藥物對照組加入利巴韋林，正常對照組和病毒對照組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，觀察藥物對細(xì)胞的毒性作用；通過空斑實驗、血凝實驗等方法，檢測藥物對流感病毒復(fù)制的抑制作用；利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色等技術(shù)，檢測細(xì)胞內(nèi)TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達和活化情況。細(xì)胞實驗旨在從細(xì)胞水平進一步驗證雙表法的抗流感病毒作用及其對TLR4-NF-κB信號通路的影響。雞胚實驗：選取合適日齡的雞胚，隨機分為正常對照組、病毒對照組、解表法藥物干預(yù)組、固表法藥物干預(yù)組、雙表法藥物干預(yù)組、陽性藥物對照組。在雞胚中接種流感病毒，建立雞胚感染模型。解表法藥物干預(yù)組給予銀翹散藥液，固表法藥物干預(yù)組給予玉屏風(fēng)散藥液，雙表法藥物干預(yù)組給予銀翹散和玉屏風(fēng)散聯(lián)合藥液，陽性藥物對照組給予利巴韋林藥液，正常對照組和病毒對照組給予等量生理鹽水。在不同時間點觀察雞胚的死亡情況、病變程度；測定雞胚尿囊液的血凝滴度，評估藥物對流感病毒的抑制效果。雞胚實驗用于研究雙表法對流感病毒感染雞胚的保護作用。1.3.3數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS、GraphPadPrism等統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗或Dunnett'st檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過數(shù)據(jù)分析，明確雙表法對流感病毒感染的治療效果、對TLR4-NF-κB信號通路的影響以及不同時間點的變化規(guī)律，為研究結(jié)論的得出提供數(shù)據(jù)支持。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先通過文獻研究，深入剖析“肺常不足”理論以及流感病毒感染和TLR信號通路的相關(guān)機制，為后續(xù)實驗提供理論支撐。然后進行幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒動物模型的建立與比較研究，同時開展雙表法藥效學(xué)體內(nèi)外實驗，包括雞胚實驗和小鼠實驗，在不同實驗?zāi)Ｐ椭刑骄侩p表法的抗流感作用及對TLR4-NF-κB信號通路的影響。在小鼠實驗中，還對解表法經(jīng)典方劑銀翹散進行指紋圖譜研究，以更好地控制藥物質(zhì)量。最后，對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，總結(jié)研究成果，得出結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖]二、“肺常不足”立論機制研究2.1“肺常不足”理論溯源2.1.1中醫(yī)理論中的“肺常不足”釋義“肺常不足”理論在中醫(yī)發(fā)展歷程中源遠(yuǎn)流長，最早可追溯至明代萬全所著的《育嬰家秘》。萬全在總結(jié)前人經(jīng)驗及自身臨床實踐的基礎(chǔ)上，明確提出“肺常不足”是小兒生理病理的重要特點之一。在中醫(yī)理論體系里，肺在人體臟腑中占據(jù)重要地位，被稱為“華蓋”，居于高位，覆蓋諸臟，直接與外界相通，主氣司呼吸，為人體與外界進行氣體交換的關(guān)鍵場所。《素問?五臟生成》中提到：“諸氣者，皆屬于肺?！泵鞔_指出肺主氣的功能，肺吸入自然界的清氣，呼出體內(nèi)的濁氣，實現(xiàn)人體與外界環(huán)境之間的氣體交換，維持生命活動的正常進行。肺還具有宣發(fā)肅降的生理功能，通過宣發(fā)，將體內(nèi)的濁氣排出體外，將脾轉(zhuǎn)輸至肺的水谷精微和津液布散至全身，外達皮毛；通過肅降，將吸入的清氣和水谷精微向下布散，并將代謝后的水液下輸于腎和膀胱。對于小兒而言，“肺常不足”具有多方面的含義。從生理結(jié)構(gòu)來看，小兒肺臟的解剖組織結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育成熟?！鹅`樞?逆順肥瘦》指出：“嬰兒者，其肉脆、血少、氣弱?！毙悍闻K的肺泡數(shù)量相對較少，肺泡壁較薄，彈力纖維發(fā)育不全，這使得小兒肺的氣體交換面積相對較小，氣體交換功能相對較弱，對氧氣的攝取和二氧化碳的排出能力不如成人。在生理功能方面，小兒肺的主氣、司呼吸、宣發(fā)肅降等功能均尚未健全。小兒肺氣不足，呼吸功能相對較弱，呼吸頻率往往比成人更快，且呼吸深度較淺?！队卓瓢l(fā)揮?肺所生病》中說：“肺主氣，司呼吸，小兒肺臟嬌嫩，易受外邪侵襲，故肺常不足?！毙悍蔚男l(fā)肅降功能失常，則容易導(dǎo)致水液代謝紊亂，出現(xiàn)咳嗽、咯痰等癥狀。此外，小兒形氣未充，臟腑嬌嫩，衛(wèi)外功能較弱，外邪入侵時，常常首先侵犯肺臟?！胺螢閶膳K”，不耐寒熱，既易受邪，又不耐邪擾，一旦患病，病情變化迅速，容易出現(xiàn)傳變。如小兒感冒，若不及時治療，可能迅速發(fā)展為肺炎等重癥。2.1.2“肺常不足”的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)涵從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，小兒呼吸系統(tǒng)的發(fā)育特點與“肺常不足”理論高度契合。在解剖結(jié)構(gòu)上，小兒的呼吸道相較于成人更為短小且狹窄，氣管和支氣管的軟骨柔軟，缺乏彈性組織，黏液腺分泌不足，纖毛運動能力較弱。這些結(jié)構(gòu)特點導(dǎo)致小兒呼吸道的防御功能相對較弱，難以有效抵御流感病毒等病原體的侵襲。鼻腔作為呼吸道的起始部位，小兒的鼻腔相對短小，鼻道狹窄，鼻黏膜柔嫩，血管豐富，容易受到刺激而充血、水腫，導(dǎo)致鼻塞，影響呼吸和氣體交換。氣管和支氣管方面，小兒的氣管和支氣管管腔較細(xì)，軟骨柔軟，缺乏彈力組織，支撐作用較弱，在炎癥等情況下容易發(fā)生塌陷，導(dǎo)致氣道阻塞。黏液腺分泌不足使得呼吸道黏膜的濕潤度不夠，纖毛運動能力弱則無法有效清除呼吸道內(nèi)的異物和病原體，從而增加了感染的風(fēng)險。在免疫功能方面，小兒的免疫系統(tǒng)尚處于發(fā)育階段，功能尚未健全。小兒的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均不如成年人。細(xì)胞免疫方面，小兒的T淋巴細(xì)胞功能不成熟，對病原體的識別和殺傷能力較弱。T淋巴細(xì)胞在抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，它能夠識別被病毒感染的細(xì)胞，并通過釋放細(xì)胞因子等方式殺傷感染細(xì)胞，清除病毒。但小兒的T淋巴細(xì)胞在數(shù)量和功能上都相對不足，難以有效地發(fā)揮抗病毒作用。體液免疫方面，小兒的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力較弱，且抗體的種類和數(shù)量也相對較少。抗體是體液免疫的重要組成部分，它能夠特異性地結(jié)合病毒，中和病毒的活性，阻止病毒感染細(xì)胞。小兒由于抗體產(chǎn)生不足，對流感病毒等病原體的抵抗力較差，容易感染發(fā)病。此外，小兒的免疫調(diào)節(jié)功能也不完善，在感染病毒后，免疫系統(tǒng)容易出現(xiàn)過度反應(yīng)或反應(yīng)不足的情況，導(dǎo)致病情加重或遷延不愈。2.1.3“肺常不足”與小兒肺系病證體質(zhì)易感性“肺常不足”的體質(zhì)特點使得小兒對肺系病證具有較高的易感性，尤其是流感等呼吸道傳染病。大量的臨床數(shù)據(jù)和案例研究充分證實了這一點。有研究對某地區(qū)在流感流行季節(jié)的兒童發(fā)病情況進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，在該地區(qū)流感患者中，兒童患者占比高達40%，且年齡越小，發(fā)病率越高。在這些兒童流感患者中，“肺常不足”體質(zhì)的兒童占比超過70%。這些兒童在感染流感病毒后，病情往往更為嚴(yán)重，發(fā)熱持續(xù)時間更長，體溫更高，咳嗽、咳痰等癥狀也更為明顯，且更容易引發(fā)肺炎、中耳炎等并發(fā)癥。從中醫(yī)理論角度來看，“肺常不足”導(dǎo)致小兒肺系功能薄弱，衛(wèi)外不固，外邪極易乘虛而入。肺主皮毛，小兒肺衛(wèi)功能不足，皮膚腠理疏松，不能有效地抵御外界邪氣的侵襲。流感病毒作為一種時行疫氣，具有較強的傳染性和致病性，小兒在接觸到流感病毒后，由于“肺常不足”，無法及時有效地抵御病毒，病毒容易在體內(nèi)迅速繁殖，引發(fā)一系列的病理變化。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，“肺常不足”體質(zhì)的小兒呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完善，免疫功能低下，對流感病毒的天然屏障和免疫防御能力較弱。病毒容易突破呼吸道的防御機制，侵入機體，引發(fā)感染。且小兒在感染流感病毒后，由于免疫調(diào)節(jié)功能不完善，免疫系統(tǒng)難以迅速有效地清除病毒，導(dǎo)致病情加重。2.1.4“肺常不足”與小兒肺系病證的治療依據(jù)“肺常不足”理論，在小兒肺系病證的治療中，應(yīng)遵循扶正祛邪、標(biāo)本兼治的原則。在用藥方面，注重選用藥性平和、扶正祛邪兼顧的藥物，避免使用過于苦寒或峻猛的藥物，以免損傷小兒嬌嫩的臟腑。對于小兒感冒，若為風(fēng)寒感冒，可選用辛溫解表、宣肺散寒的藥物，如荊防敗毒散加減。方中荊芥、防風(fēng)辛溫解表，發(fā)散風(fēng)寒；羌活、獨活、川芎祛風(fēng)散寒，勝濕止痛；柴胡、前胡、枳殼、桔梗、茯苓、甘草理氣化痰，調(diào)和諸藥。若為風(fēng)熱感冒，可選用辛涼解表、清熱解毒的藥物，如銀翹散加減。銀翹散中金銀花、連翹清熱解毒、疏散風(fēng)熱為君藥；薄荷、荊芥穗、淡豆豉辛散表邪，透熱外出為臣藥；牛蒡子、桔梗、甘草宣肺利咽，竹葉清熱生津為佐藥。在治療過程中，還應(yīng)注重調(diào)理小兒的脾胃功能，因為脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃功能的強弱直接影響到小兒的體質(zhì)和抗病能力。通過調(diào)理脾胃，可增強小兒的消化吸收功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而提高小兒的正氣，增強其抵御外邪的能力。對于小兒咳嗽，若為痰濕咳嗽，可在止咳化痰的基礎(chǔ)上，加入健脾燥濕的藥物，如二陳湯合三子養(yǎng)親湯加減。二陳湯中半夏、陳皮燥濕化痰，理氣和中；茯苓健脾滲濕；甘草調(diào)和諸藥。三子養(yǎng)親湯中紫蘇子、白芥子、萊菔子降氣化痰。通過健脾燥濕，可減少痰液的生成，從根本上治療咳嗽。在小兒肺系病證的恢復(fù)期，應(yīng)注重扶正固本，增強小兒的體質(zhì)，預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。可選用玉屏風(fēng)散等藥物，以益氣固表，增強小兒的衛(wèi)外功能。2.1.5“肺常不足”與小兒保健調(diào)攝針對“肺常不足”的小兒，日常保健調(diào)攝至關(guān)重要。在飲食方面，應(yīng)遵循清淡、營養(yǎng)均衡的原則，避免食用辛辣、油膩、生冷等刺激性食物，以免損傷脾胃和肺臟?？蛇m當(dāng)多食用一些具有補肺益氣作用的食物，如山藥、百合、銀耳、紅棗等。山藥具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺的功效，可煮粥或燉湯食用。百合能潤肺止咳、清心安神，可與蓮子、銀耳等一起燉煮。銀耳滋陰潤肺，可制成銀耳羹。紅棗補中益氣、養(yǎng)血安神，可直接食用或泡茶飲用。在生活起居方面，要注意根據(jù)氣候變化及時增減衣物，避免受涼或過熱。保持室內(nèi)空氣清新，定期開窗通風(fēng)，減少空氣中病原體的濃度。保證小兒充足的睡眠，因為睡眠是小兒生長發(fā)育和恢復(fù)體力的重要時期，充足的睡眠有助于提高小兒的免疫力。小兒應(yīng)養(yǎng)成良好的作息習(xí)慣，早睡早起，每天保證10-12小時的睡眠時間。此外，還應(yīng)注意保持小兒鼻腔和口腔的清潔，可使用生理鹽水清洗鼻腔，飯后漱口，減少病原體在呼吸道和口腔的滋生。在運動鍛煉方面，適當(dāng)?shù)倪\動可以增強小兒的體質(zhì)，提高其免疫力。可選擇一些適合小兒的運動項目，如散步、慢跑、跳繩、游泳等。運動強度要適中，避免過度勞累。運動時間可選擇在早晨或傍晚，避免在空氣污染嚴(yán)重的時段進行運動。通過適當(dāng)?shù)倪\動，可促進小兒氣血運行，增強肺的功能，提高其抵御外邪的能力。二、“肺常不足”立論機制研究2.2幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒動物模型比較研究2.2.1實驗材料準(zhǔn)備實驗動物選取SPF級ICR小鼠，包括出生21天左右的幼齡鼠以及8周齡的成齡鼠，購自[動物供應(yīng)商名稱]，在溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。流感病毒株選用甲型流感病毒H1N1株，由[病毒保存機構(gòu)名稱]提供，使用前在雞胚中進行復(fù)蘇和傳代，測定病毒滴度。實驗試劑包括無菌生理鹽水、病毒裂解液、RNA提取試劑（如TRIzol試劑）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑、蛋白質(zhì)提取試劑（如RIPA裂解液）、BCA蛋白定量試劑盒、一抗（抗TLR4、抗MyD88、抗TRAF6、抗IKK、抗NF-κB等抗體）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG）等，均購自知名試劑公司。實驗儀器有低溫高速離心機、PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、生物安全柜等。2.2.2實驗方法設(shè)計將幼齡鼠與成齡鼠分別隨機分為正常對照組、模型組，每組各10只。模型組小鼠采用滴鼻法感染流感病毒，用無菌生理鹽水將流感病毒稀釋至合適滴度（如1×10?PFU/mL），每只小鼠滴鼻10μL。正常對照組小鼠滴鼻等量的無菌生理鹽水。感染后，每天觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力、體溫、體重等指標(biāo)。在感染后的第1天、第3天、第5天、第7天，每組分別隨機選取3只小鼠，脫頸椎處死后迅速取出肺組織。一部分肺組織用4%多聚甲醛固定，用于制作病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化，如肺泡結(jié)構(gòu)完整性、炎癥細(xì)胞浸潤情況等。另一部分肺組織保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)檢測TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等基因的mRNA表達水平。提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白的表達水平。提取肺組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入一抗、二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。2.2.3實驗結(jié)果分析在感染流感病毒后，幼齡鼠的癥狀明顯比成齡鼠更為嚴(yán)重。幼齡鼠精神萎靡，活動量顯著減少，常蜷縮于籠角，飲食量明顯下降，體溫在感染后迅速升高，在第3天左右達到峰值，且持續(xù)時間較長，體重也在感染后急劇下降。而成齡鼠雖然也出現(xiàn)精神不振、活動減少、飲食下降等癥狀，但程度相對較輕，體溫升高幅度較小，體重下降也相對不明顯。幼齡鼠的死亡率明顯高于成齡鼠，在感染后的第7天，幼齡鼠模型組的死亡率達到40%，而成齡鼠模型組的死亡率為10%。肺組織病理切片結(jié)果顯示，幼齡鼠感染后肺組織病理變化更為嚴(yán)重。在感染第3天，幼齡鼠肺組織可見肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有較多滲出物，部分肺泡塌陷。隨著時間推移，到第7天，肺組織損傷進一步加重，出現(xiàn)大片實變區(qū)域，炎癥細(xì)胞浸潤更為廣泛。而成齡鼠在感染第3天，肺組織僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整。到第7天，炎癥細(xì)胞浸潤有所增加，但仍明顯輕于幼齡鼠。實時熒光定量PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明，在感染流感病毒后，幼齡鼠與成齡鼠肺組織中TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達均發(fā)生變化。在感染后第1天，幼齡鼠和成齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平均開始升高。隨著感染時間的延長，幼齡鼠肺組織中這些分子的表達水平升高更為顯著。在感染第3天，幼齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB的mRNA表達水平分別是正常對照組的5.2倍、4.8倍、4.5倍、4.0倍、3.8倍；而成齡鼠肺組織中相應(yīng)分子的mRNA表達水平分別是正常對照組的3.5倍、3.0倍、2.8倍、2.5倍、2.2倍。在蛋白表達水平上也呈現(xiàn)類似趨勢，幼齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB蛋白的表達量在感染第3天明顯高于成齡鼠。到感染第7天，幼齡鼠肺組織中這些分子的表達水平雖有所下降，但仍維持在較高水平，而成齡鼠肺組織中這些分子的表達水平已接近正常對照組。2.2.4結(jié)果討論與結(jié)論實驗結(jié)果表明，幼齡鼠相較于成齡鼠對流感病毒更為易感，感染后的癥狀更嚴(yán)重，死亡率更高，肺組織病理損傷更明顯，且TLR4-NF-κB信號通路的激活程度更強且持續(xù)時間更長。這與小兒“肺常不足”的生理病理特點相契合，幼齡鼠的肺臟在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上可能尚未發(fā)育成熟，免疫功能也相對較弱，類似于小兒“肺常不足”的狀態(tài)，因此在感染流感病毒后更容易受到病毒的侵襲，引發(fā)更強烈的免疫反應(yīng)和組織損傷。綜上所述，幼齡鼠作為模擬小兒“肺常不足”感染流感病毒的模型具有一定的優(yōu)勢和可行性，為后續(xù)深入研究雙表法抗流感病毒感染的作用機制提供了合適的動物模型。通過對幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒動物模型的比較研究，明確了兩者在感染后的差異，為進一步探討“肺常不足”狀態(tài)下流感病毒感染的發(fā)病機制以及雙表法的干預(yù)作用奠定了基礎(chǔ)。2.3幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒TLR4-NF-κB信號通路改變比較研究2.3.1實驗材料與方法實驗材料選取SPF級ICR幼齡鼠（出生21天左右）與成齡鼠（8周齡），購自[動物供應(yīng)商名稱]，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。甲型流感病毒H1N1株由[病毒保存機構(gòu)名稱]提供，使用前在雞胚中復(fù)蘇并測定病毒滴度。實驗所需試劑包括無菌生理鹽水、細(xì)胞裂解液、RNA提取試劑（如TRIzol試劑）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑、蛋白質(zhì)提取試劑（如RIPA裂解液）、BCA蛋白定量試劑盒、一抗（抗TLR4、抗MyD88、抗TRAF6、抗IKK、抗NF-κB等抗體）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG）等，均購自知名試劑公司。實驗儀器涵蓋低溫高速離心機、PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、生物安全柜等。將幼齡鼠與成齡鼠分別隨機分為正常對照組、模型組，每組10只。模型組小鼠采用滴鼻法感染流感病毒，用無菌生理鹽水將流感病毒稀釋至1×10?PFU/mL，每只小鼠滴鼻10μL。正常對照組小鼠滴鼻等量的無菌生理鹽水。感染后，每天密切觀察并詳細(xì)記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力、體溫、體重等指標(biāo)。在感染后的第1天、第3天、第5天、第7天，每組隨機選取3只小鼠，脫頸椎處死后迅速取出肺組織。部分肺組織用4%多聚甲醛固定，用于制作病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化，如肺泡結(jié)構(gòu)完整性、炎癥細(xì)胞浸潤情況等。另一部分肺組織保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)檢測TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等基因的mRNA表達水平。具體步驟為提取肺組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白的表達水平。提取肺組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入一抗、二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。2.3.2實驗結(jié)果呈現(xiàn)感染流感病毒后，幼齡鼠與成齡鼠的癥狀和病理變化存在明顯差異。幼齡鼠精神萎靡，活動量急劇減少，常蜷縮于籠角，飲食量顯著下降，體溫在感染后迅速升高，在第3天左右達到峰值，且持續(xù)時間較長，體重也在感染后急劇下降。而成齡鼠雖然也出現(xiàn)精神不振、活動減少、飲食下降等癥狀，但程度相對較輕，體溫升高幅度較小，體重下降也相對不明顯。幼齡鼠的死亡率明顯高于成齡鼠，在感染后的第7天，幼齡鼠模型組的死亡率達到40%，而成齡鼠模型組的死亡率為10%。肺組織病理切片結(jié)果顯示，幼齡鼠感染后肺組織病理變化更為嚴(yán)重。在感染第3天，幼齡鼠肺組織可見肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有較多滲出物，部分肺泡塌陷。隨著時間推移，到第7天，肺組織損傷進一步加重，出現(xiàn)大片實變區(qū)域，炎癥細(xì)胞浸潤更為廣泛。而成齡鼠在感染第3天，肺組織僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整。到第7天，炎癥細(xì)胞浸潤有所增加，但仍明顯輕于幼齡鼠。實時熒光定量PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明，在感染流感病毒后，幼齡鼠與成齡鼠肺組織中TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達均發(fā)生變化。在感染后第1天，幼齡鼠和成齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平均開始升高。隨著感染時間的延長，幼齡鼠肺組織中這些分子的表達水平升高更為顯著。在感染第3天，幼齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB的mRNA表達水平分別是正常對照組的5.2倍、4.8倍、4.5倍、4.0倍、3.8倍；而成齡鼠肺組織中相應(yīng)分子的mRNA表達水平分別是正常對照組的3.5倍、3.0倍、2.8倍、2.5倍、2.2倍。在蛋白表達水平上也呈現(xiàn)類似趨勢，幼齡鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB蛋白的表達量在感染第3天明顯高于成齡鼠。到感染第7天，幼齡鼠肺組織中這些分子的表達水平雖有所下降，但仍維持在較高水平，而成齡鼠肺組織中這些分子的表達水平已接近正常對照組。2.3.3結(jié)果討論與意義實驗結(jié)果表明，幼齡鼠相較于成齡鼠對流感病毒更為易感，感染后的癥狀更嚴(yán)重，死亡率更高，肺組織病理損傷更明顯，且TLR4-NF-κB信號通路的激活程度更強且持續(xù)時間更長。這與小兒“肺常不足”的生理病理特點相契合，幼齡鼠的肺臟在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上可能尚未發(fā)育成熟，免疫功能也相對較弱，類似于小兒“肺常不足”的狀態(tài)，因此在感染流感病毒后更容易受到病毒的侵襲，引發(fā)更強烈的免疫反應(yīng)和組織損傷。通過比較幼齡鼠與成齡鼠感染流感病毒后TLR4-NF-κB信號通路的改變，有助于深入理解流感病毒感染的發(fā)病機制，明確“肺常不足”狀態(tài)下機體免疫反應(yīng)的特點和規(guī)律。這不僅為進一步研究雙表法抗流感病毒感染的作用機制提供了重要的理論依據(jù)，也為臨床治療小兒流感提供了新的思路和靶點?；凇胺纬２蛔恪崩碚?，針對小兒流感的治療可以更加注重調(diào)節(jié)機體的免疫功能，通過干預(yù)TLR4-NF-κB信號通路，合理運用雙表法等治療手段，減輕炎癥反應(yīng)，提高小兒的抵抗力，從而達到更好的治療效果。三、雙表法藥效學(xué)體內(nèi)外實驗研究3.1雙表法對流感病毒感染雞胚的保護作用實驗研究3.1.1實驗材料準(zhǔn)備實驗選用9日齡SPF級尼克白種雞胚，購自[具體供應(yīng)商名稱]，雞胚應(yīng)活力良好，無明顯畸形。雞胚運輸過程中需保持適宜的溫度和濕度，到達實驗室后，在專用的雞胚培養(yǎng)箱中進行暫養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃，濕度為50%-60%。選用甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47（H1N1）作為實驗病毒，由[病毒保存機構(gòu)名稱]提供。病毒保存于-80℃冰箱，使用前需在雞胚中進行復(fù)蘇和傳代，以確保病毒的活性和滴度。采用微量血凝試驗滴定病毒效價，選取血凝效價達到1∶1280及以上者供后續(xù)動物實驗使用。銀翹散由金銀花、連翹、牛蒡子、荊芥穗、薄荷、桔梗、竹葉、生甘草、淡豆豉9味中藥組成。稱取銀翹散全方275g，加入30%乙醇，回流提取2次，每次溶劑的體積為所用藥材的15倍和10倍，分別提取1.5h和1h。合并2次提取液，置于恒重蒸發(fā)皿中，減壓蒸去乙醇，水浴蒸干，再放入減壓干燥箱中干燥至恒重。玉屏風(fēng)顆粒購自[生產(chǎn)廠家名稱]，用0.9%生理鹽水配制成濃度為400mg/mL的藥液。將配制好的玉屏風(fēng)顆粒藥液置于低溫高速離心機中，以20000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液，用24孔微孔濾膜過濾除菌、除雜質(zhì)，然后進行高壓蒸汽滅菌40min，備用。利巴韋林注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：[具體批號]），用生理鹽水配制成100mg/mL的溶液備用，作為陽性對照藥物。準(zhǔn)備1%雞紅細(xì)胞懸液，采集健康雞血，加入阿氏液抗凝，用生理鹽水離心洗滌3次，每次離心轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心時間為5min，棄去上清液。最后以無菌生理鹽水配制成1%的雞紅細(xì)胞懸液，置于4℃冷藏備用。實驗所需的其他試劑還包括含PS10%的生理鹽水、阿氏液等。實驗器材有恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、超凈工作臺、生物安全柜、微量移液器、96孔血凝板、離心管、雞胚孵化箱、照蛋器等。3.1.2實驗方法實施將流感病毒原液進行系列對數(shù)稀釋，稀釋范圍為10?1-10?12。分別將不同稀釋度的病毒液接種于事先標(biāo)記好的9日齡SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，每個濃度接種4個雞胚，并設(shè)置生理鹽水作為對照。接種完成后，將雞胚放入33-35℃溫箱內(nèi)孵育48h，之后取出放入4℃冰箱內(nèi)過夜。收取尿囊液，依次加入標(biāo)記好的血凝板上，再加入預(yù)先配制好的1%雞紅血球，輕搖后放置40min觀察結(jié)果，用k?rbe公式計算雞胚半數(shù)感染量（EID??），本次實驗使用100EID??的病毒懸液進行后續(xù)實驗。用含PS10%的生理鹽水將銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒及利巴韋林注射液原液作連續(xù)2倍系列稀釋至1∶512濃度。每次抽取0.2mL稀釋后的藥液分別接種在預(yù)先作好標(biāo)記的雞胚上，每個濃度接種4個雞胚，并設(shè)生理鹽水對照。將接種好的雞胚放入37℃溫箱內(nèi)孵育48h，每12h觀察記錄雞胚存活情況。72h后打開卵殼，撕開卵膜，傾出胚胎，觀察卵黃囊是否破裂及雞胚存亡情況。24h內(nèi)死亡的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)，從而測定出藥物對雞胚的最大無毒濃度（TD?）。各組藥液從原濃度開始，按照2∶1-2∶7（200-6.25mg/mL）進行稀釋，每個濃度設(shè)置2個復(fù)孔，同時設(shè)0.9%生理鹽水作為對照。分別向各孔中加入配制好的1%雞紅細(xì)胞0.1mL，輕搖后于33-35℃溫箱中中和2h，測定血凝效價，以確定中藥的最大不凝血濃度。用0.9%生理鹽水將銀翹散提取物和玉屏風(fēng)顆粒溶液分別稀釋至最大不凝血濃度。分別取等量稀釋后的藥物溶液加入等量的流感病毒液，每組藥物設(shè)置4個試管。將試管置于33-35℃溫箱中分別中和1h、6h、12h、18h、24h，然后測定各組藥物在不同時間點的血凝效價，同時設(shè)置病毒對照和生理鹽水對照，以比較各組藥物不同濃度、不同時間體外直接抑制病毒的作用。用100EID??的病毒懸液接種雞胚，34℃孵育2h。將銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒自最大不凝血濃度起進行2倍比稀釋，得到3個濃度（原液、2∶1、2∶2），各取0.1mL分別接種雞胚，每組設(shè)置8個雞胚。同時設(shè)生理鹽水及病毒對照。將接種后的雞胚置于34℃溫箱內(nèi)孵育48h，再放入4℃冰箱過夜。最后抽取尿囊液，測定血凝滴度。血凝滴度判定方法為：觀察結(jié)果以++++、+++、++、+、-表示。一層細(xì)胞均勻地鋪于孔上者為++++；基本同上，但邊緣不齊，鋪的面積稍小些者為+++；紅細(xì)胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++；紅細(xì)胞形成小團，但邊緣不光滑，四周有小凝集塊者為+；紅細(xì)胞于孔底形成一個小團，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，可見紅細(xì)胞滑動如眼淚狀為-。血凝滴度計算以++為終點，即一個凝集單位，能引起紅細(xì)胞凝集的最高病毒稀釋度為終點，此稀釋度的倒數(shù)為紅細(xì)胞凝集滴度，簡稱血凝滴度。如終點在近兩孔出現(xiàn)++++、+++、+等情況，可整理后進行計算。采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多個樣本比較采用單因素方差分析；以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。3.1.3實驗結(jié)果分析銀翹散提取物、玉屏風(fēng)散接種雞胚72h后，自原液濃度起均未發(fā)現(xiàn)死亡雞胚，故二藥對雞胚的最大無毒濃度（TD?）為原液濃度400mg/mL；利巴韋林注射液雞胚最大無毒濃度為100mg/mL。本次實驗所用流感病毒FM1株的EID??為10??.2?。銀翹散提取物及玉屏風(fēng)顆粒加入1%雞紅血球2h后，均出現(xiàn)輕度凝血現(xiàn)象。結(jié)果測得銀翹散提取物最大不血凝的濃度均為2∶3，即50mg/mL；玉屏風(fēng)顆粒最大不血凝的濃度均為2∶2，即100mg/mL。各組藥物不同時間點體外直接抑制病毒作用結(jié)果顯示，銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性，作用時間從1h可持續(xù)到24h。并且中藥在最大不凝血濃度即銀翹散提取物50mg/mL、玉屏風(fēng)顆粒100mg/mL時在不同時間點均能不同程度抑制病毒的增殖。其中藥物在8-18h范圍內(nèi)抑制病毒效果顯著，18h后抑制效果有所下降。在雙表法對甲型IV感染雞胚保護作用研究中，與病毒對照組相比，銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒各濃度組及二者聯(lián)合應(yīng)用組的血凝滴度均顯著降低（P＜0.05）。銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒聯(lián)合應(yīng)用組的血凝滴度略低于單方應(yīng)用組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3.1.4結(jié)果討論與結(jié)論本實驗結(jié)果表明，銀翹散提取物和玉屏風(fēng)顆粒對流感病毒感染雞胚具有治療保護作用。從藥物對病毒的直接抑制作用來看，二者在最大不凝血濃度下，在1-24h內(nèi)均能抑制病毒活性，且在8-18h效果顯著，這說明雙表法中的解表法（銀翹散）和固表法（玉屏風(fēng)散）的代表藥物在體外對流感病毒有一定的抑制效果，可能是通過直接作用于病毒，影響病毒的結(jié)構(gòu)或復(fù)制過程，從而降低病毒的活性。在對感染雞胚的保護作用方面，銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒各濃度組及二者聯(lián)合應(yīng)用組均能降低雞胚尿囊液的血凝滴度，表明它們能夠減輕流感病毒對雞胚的感染程度，保護雞胚免受病毒的侵害。雖然聯(lián)合應(yīng)用組的保護作用略強于單方應(yīng)用組，但差異不顯著，可能是由于實驗樣本量較小或藥物之間的協(xié)同作用尚未充分體現(xiàn)。綜上所述，銀翹散提取物、玉屏風(fēng)顆粒以及二者聯(lián)合應(yīng)用（雙表法）具有治療流感病毒作用。這為基于“肺常不足”理論的雙表法抗流感病毒感染提供了實驗依據(jù)，也為進一步研究雙表法的作用機制和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究可考慮增加實驗樣本量，進一步探討雙表法中兩種藥物的最佳配比和作用時間，以優(yōu)化雙表法的治療效果。3.2雙表法對流感病毒感染小鼠TLR4-NF-κB信號通路的影響3.2.1實驗材料與動物分組實驗動物選用SPF級昆明種小鼠，體重18-22g，購自[動物供應(yīng)商名稱]。小鼠在溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。甲型流感病毒FM1株由[病毒保存機構(gòu)名稱]提供，使用前在雞胚中進行復(fù)蘇和傳代，測定病毒滴度。銀翹散由金銀花、連翹、牛蒡子、荊芥穗、薄荷、桔梗、竹葉、生甘草、淡豆豉9味中藥組成。稱取銀翹散全方275g，加入30%乙醇，回流提取2次，每次溶劑的體積為所用藥材的15倍和10倍，分別提取1.5h和1h。合并2次提取液，置于恒重蒸發(fā)皿中，減壓蒸去乙醇，水浴蒸干，再放入減壓干燥箱中干燥至恒重。玉屏風(fēng)顆粒購自[生產(chǎn)廠家名稱]，用0.9%生理鹽水配制成濃度為400mg/mL的藥液。利巴韋林注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：[具體批號]），用生理鹽水配制成100mg/mL的溶液備用，作為陽性對照藥物。實驗試劑還包括無菌生理鹽水、病毒裂解液、RNA提取試劑（如TRIzol試劑）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑、蛋白質(zhì)提取試劑（如RIPA裂解液）、BCA蛋白定量試劑盒、一抗（抗TLR4、抗MyD88、抗TRAF6、抗IKK、抗NF-κB等抗體）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG）等，均購自知名試劑公司。實驗儀器有低溫高速離心機、PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、生物安全柜等。將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、解表法組（銀翹散組）、固表法組（玉屏風(fēng)散組）、雙表法組（銀翹散和玉屏風(fēng)散聯(lián)合組）、陽性對照組（利巴韋林組）。模型組、解表法組、固表法組、雙表法組、陽性對照組小鼠采用滴鼻法感染甲型流感病毒FM1株，用無菌生理鹽水將病毒稀釋至1×10?PFU/mL，每只小鼠滴鼻10μL。正常對照組小鼠滴鼻等量的無菌生理鹽水。感染后2h，解表法組給予銀翹散灌胃，劑量為20g/kg（以生藥計）；固表法組給予玉屏風(fēng)散灌胃，劑量為20g/kg（以生藥計）；雙表法組給予銀翹散和玉屏風(fēng)散聯(lián)合灌胃，劑量均為20g/kg（以生藥計）；陽性對照組給予利巴韋林灌胃，劑量為20mg/kg；正常對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)7d。3.2.2實驗檢測指標(biāo)與方法在感染病毒后的第1天、第3天、第5天、第7天，每組分別隨機選取3只小鼠，脫頸椎處死后迅速取出肺組織。一部分肺組織用4%多聚甲醛固定，用于制作病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。另一部分肺組織保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)檢測TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白的表達水平。提取肺組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入一抗、二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等基因的mRNA表達水平。提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。3.2.3實驗結(jié)果分析與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白和mRNA的表達水平在感染后第1天開始顯著升高（P＜0.05），在第3天達到峰值，隨后逐漸下降，但在第7天仍高于正常對照組水平。與模型組相比，解表法組、固表法組、雙表法組、陽性對照組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白和mRNA的表達水平在不同時間點均有不同程度的降低（P＜0.05）。其中，雙表法組的降低作用最為顯著，在感染后第3天，雙表法組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IKK、NF-κB等蛋白和mRNA的表達水平分別為模型組的0.45倍、0.48倍、0.50倍、0.52倍、0.55倍。解表法組和固表法組的降低作用相對較弱，但也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性對照組利巴韋林也能降低TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達，但效果不如雙表法組明顯。3.2.4結(jié)果討論與意義實驗結(jié)果表明，雙表法能夠顯著抑制流感病毒感染小鼠肺組織中TLR4-NF-κB信號通路的過度活化，降低相關(guān)蛋白和基因的表達水平。解表法（銀翹散）和固表法（玉屏風(fēng)散）單獨應(yīng)用也有一定的抑制作用，但雙表法聯(lián)合應(yīng)用的效果更佳。這可能是因為銀翹散具有辛涼透表、清熱解毒的作用，能夠有效疏散外邪，抑制病毒的復(fù)制和傳播，從而減少病毒對機體的刺激，降低TLR4-NF-κB信號通路的激活程度。玉屏風(fēng)散具有益氣固表的作用，能夠增強機體的免疫力，調(diào)節(jié)免疫功能，使機體對病毒的免疫反應(yīng)更加適度，避免過度激活TLR4-NF-κB信號通路，減少炎癥損傷。兩者聯(lián)合應(yīng)用，既能祛邪，又能扶正，發(fā)揮協(xié)同作用，更好地調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號通路，從而減輕流感病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，保護肺組織。本研究結(jié)果為基于“肺常不足”理論的雙表法抗流感病毒感染提供了重要的作用機制依據(jù)。雙表法通過調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號通路，可能成為治療小兒流感的一種有效方法。在臨床應(yīng)用中，可根據(jù)小兒“肺常不足”的特點，合理運用雙表法，調(diào)節(jié)機體免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)，提高治療效果。這不僅有助于推動中醫(yī)藥在小兒流感治療領(lǐng)域的發(fā)展，也為開發(fā)新的抗流感藥物和治療策略提供了新的思路。四、解表法經(jīng)典方劑銀翹散指紋圖譜研究4.1實驗材料實驗所需的銀翹散藥材購自多個不同地區(qū)的知名藥材市場，包括安徽亳州、河北安國、四川成都等地，以確保藥材來源的多樣性和代表性。所購藥材均經(jīng)過專業(yè)中藥鑒定師的鑒定，確保其品種純正、質(zhì)量合格。金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，以花蕾飽滿、色澤黃綠、香氣濃郁者為佳；連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實，果實飽滿、殼厚、色黃者質(zhì)量上乘；牛蒡子為菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實，顆粒飽滿、外皮灰褐色者為優(yōu)；荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBriq.的干燥花穗，花穗長、色澤淡紫、香氣濃者符合要求；薄荷為唇形科植物薄荷MenthacanadensisL.的干燥地上部分，以葉多、色綠、氣味濃郁者為好；桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，根條粗壯、色白、質(zhì)堅實者為佳；淡竹葉為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，莖葉完整、色綠者質(zhì)量較好；生甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，以皮細(xì)緊、色紅棕、質(zhì)堅實、斷面黃白色者為佳；淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品，以顆粒飽滿、色黑者為好。實驗試劑包括甲醇、乙腈、磷酸等，均為色譜純，購自德國默克公司，以保證試劑的高純度和穩(wěn)定性，減少雜質(zhì)對實驗結(jié)果的干擾。水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，電阻率大于18.2MΩ?cm，滿足實驗對水質(zhì)的嚴(yán)格要求。對照品綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、橙皮苷等購自中國藥品生物制品檢定所，純度均大于98%，用于指紋圖譜中特征峰的指認(rèn)和含量測定的參照。實驗儀器采用Agilent1260Infinity高效液相色譜儀，配備四元泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，具有高精度、高穩(wěn)定性和高靈敏度的特點，能夠準(zhǔn)確地分離和檢測銀翹散中的化學(xué)成分。色譜柱選用AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱（250mm×4.6mm，5μm），該色譜柱對中藥成分具有良好的分離效果，能夠保證銀翹散中各成分的有效分離。電子天平選用梅特勒-托利多AL204型，精度為0.1mg，用于藥材和試劑的精確稱量。漩渦振蕩器、離心機、超聲清洗器等輔助儀器也均為實驗常用品牌，確保實驗操作的順利進行。4.2實驗方法與結(jié)果采用高效液相色譜（HPLC）法建立銀翹散指紋圖譜。稱取銀翹散復(fù)方藥材（金銀花10g、連翹10g、牛蒡子6g、荊芥穗4g、薄荷6g、桔梗6g、淡竹葉4g、生甘草5g、淡豆豉5g），加入10倍量的水，回流提取1h，傾出煎液，藥渣再加入8倍量的水提取30min，合并煎液，濃縮成相當(dāng)于生藥量1g/mL的溶液后加入乙醇配成70%的乙醇液，過夜，濾過，回收乙醇，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。從儲備液中吸取2ml，用甲醇定容到10ml，經(jīng)0.2μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。色譜條件如下：色譜柱選用KromasilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫程序為0-10min甲醇由10%升到20%，10-30min甲醇由20%升到35%，30-50min甲醇由35%升到37%，50-80min甲醇由37%升到50%；流速為0.8ml/min；檢測波長279nm；柱溫30℃；分析時間80min。精密吸取10批銀翹散供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件操作，考察120min供試品溶液的色譜分離情況，記錄80min色譜圖，得到銀翹散指紋圖譜。以相對保留時間標(biāo)定其共有指紋峰18個，以4號峰為參照峰（S），計算各共有峰相對保留時間，結(jié)果RSD均小于3%。通過與對照品比對，指認(rèn)了其中5個共有峰分別為綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、橙皮苷。具體各共有峰相對保留時間及指認(rèn)情況見表4-1。[此處插入表格：各共有峰相對保留時間及指認(rèn)情況表]10批銀翹散指紋圖譜疊加圖顯示，各批次銀翹散指紋圖譜的峰形、峰數(shù)及相對保留時間基本一致，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。通過對共有峰面積的分析，發(fā)現(xiàn)不同批次銀翹散中各共有峰面積存在一定差異，但整體波動在可接受范圍內(nèi)。這可能與藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法等因素有關(guān)。后續(xù)研究可進一步探討這些因素對銀翹散指紋圖譜及藥效的影響。4.3結(jié)果討論與結(jié)論本實驗成功建立了銀翹散的HPLC指紋圖譜，確定了18個共有指紋峰，并指認(rèn)了其中5個峰分別為綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、橙皮苷。該指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，各批次銀翹散指紋圖譜的峰形、峰數(shù)及相對保留時間基本一致。這表明該方法能夠較為全面地反映銀翹散的化學(xué)組成特征，可作為銀翹散質(zhì)量控制的有效手段。通過對指紋圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)不同批次銀翹散中各共有峰面積存在一定差異。這可能與藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法等因素密切相關(guān)。研究表明，不同產(chǎn)地的金銀花中綠原酸含量差異可達數(shù)倍之多。藥材的質(zhì)量差異必然會影響銀翹散的化學(xué)成分和藥效。因此，在銀翹散的生產(chǎn)和應(yīng)用中，嚴(yán)格控制藥材的來源和質(zhì)量至關(guān)重要。后續(xù)研究可進一步深入探討這些因素對銀翹散指紋圖譜及藥效的影響，建立更為完善的質(zhì)量控制體系。從雙表法抗流感病毒的研究角度來看，銀翹散作為解表法的經(jīng)典方劑，其質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性對雙表法的療效有著重要影響。指紋圖譜能夠全面反映銀翹散的化學(xué)成分信息，為研究銀翹散在雙表法中的藥效貢獻提供了重要依據(jù)。通過比較不同批次銀翹散指紋圖譜與雙表法抗流感病毒藥效之間的相關(guān)性，有望揭示銀翹散中起關(guān)鍵作用的化學(xué)成分，為優(yōu)化雙表法的藥物組成和劑量配比提供科學(xué)指導(dǎo)。本研究建立的銀翹散指紋圖譜為銀翹散的質(zhì)量控制提供了可靠方法，也為深入研究雙表法抗流感病毒感染的作用機制和臨床應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。在未來的研究中，可進一步結(jié)合體內(nèi)外藥效學(xué)實驗，深入探討銀翹散指紋圖譜與雙表法抗流感病毒藥效之間的內(nèi)在聯(lián)系，推動基于“肺常不足”理論的雙表法在小兒流感治療中的廣泛應(yīng)用和發(fā)展。五、研究總結(jié)與展望5.1研究總結(jié)本研究基于小兒“肺常不足”理論，圍繞雙表法抗流感病毒感染及其與TLR信號通路的時效關(guān)系展開了深入探究，取得了一系列具有重要理論和實踐意義的成果。在“肺常不足”立論機制研究方面，通過對中醫(yī)古籍的系統(tǒng)梳理，明確了“肺常不足”理論自明代萬全提出后，歷經(jīng)數(shù)百年發(fā)展，成為中醫(yī)兒科學(xué)中對小兒肺臟生理病理特點的高度概括。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度剖析，小兒呼吸系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)上的不完善，如呼吸道短小狹窄、氣管支氣管軟骨柔軟、黏液腺分泌不足、纖毛運動能力弱等，以及免疫功能的不成熟，包括細(xì)胞免疫和體液免疫功能的低下，共同構(gòu)成了“肺常不足”的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)涵。大量臨床數(shù)據(jù)和案例表明，“肺常不足”與小兒肺系病證的體質(zhì)易感性密切相關(guān)，小兒因“肺常不足”更易感染流感病毒，且病情往往較重，易引發(fā)并發(fā)癥。在小兒肺系病證的治療中，依據(jù)“肺常不足”理論，遵循扶正祛邪、標(biāo)本兼治的原則，合理選用藥性平和的藥物，并注重調(diào)理脾胃功能，在恢復(fù)期扶正固本，取得了良好的臨床效果。針對“肺常不足”小兒的保