第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡一、動(dòng)物細(xì)胞的程序性死亡細(xì)胞的死亡有三種不同形式：一種是壞死（性）或意外（性）死亡（necrosis），它是由某些外界因素比如局部貧血，高熱以及物理、化學(xué)損傷和生物侵襲等造成細(xì)胞急速死亡，是一種被動(dòng)性死亡。另一種稱(chēng)之為程序性死亡（programmedcelldeathPCD）是由基因控制的自殺程序引起的主動(dòng)性死亡。主要發(fā)生在胚胎發(fā)育過(guò)程中。還有一種自噬，是與細(xì)胞凋亡不同的另一種程序性細(xì)胞死亡。（一）細(xì)胞凋亡1.細(xì)胞凋亡的概念和特征

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。形態(tài)學(xué)3個(gè)階段：◆凋亡的起始◆凋亡小體的形成◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化。細(xì)胞凋亡的生化特征◆細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180～200bp特征性的DNAladders◆凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）積累并達(dá)到較高水平細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker2.細(xì)胞凋亡生理意義：細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用：1）蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡，2）脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育3）發(fā)育過(guò)程中手和足的成形過(guò)程4)細(xì)胞凋亡的失調(diào)（不恰當(dāng)?shù)募せ罨蛞种疲┘?xì)胞凋亡不足：FasligandandFasproteinmutation,Tlymphocytedonotapoptosis,induceALPS細(xì)胞過(guò)度凋亡將會(huì)導(dǎo)致免疫功能喪失，AIDS3.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)◆形態(tài)學(xué)觀測(cè)：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測(cè)定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法◆彗星電泳法（cometassay）◆流式細(xì)胞分析根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。4.細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制1）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線(xiàn)（紫外線(xiàn)，

射線(xiàn)等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等?！艋瘜W(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子

（TNF

），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等。Caspase依賴(lài)性細(xì)胞凋亡不依賴(lài)Caspase的細(xì)胞凋亡2）

Caspase·Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱(chēng)為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase(Caenorbabditis

Elegans)1090個(gè)細(xì)胞，131個(gè)細(xì)胞凋亡找到一系列與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因ced-3、ced-4誘發(fā)、啟動(dòng)凋亡，ced-9抑制凋亡①ced-3、ced-4基因突變或缺失，使凋亡受阻②移入ced-9使凋亡受阻③失去ced-9使細(xì)胞凋亡Ced3哺乳類(lèi)同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1?！馽ed-3和ced-4是細(xì)胞殺手;●ced-9可抵消ced-3和ced-4的作用，防止細(xì)胞被殺死，因此是存活因子.caspase家族成員基本功能Caspase1Caspase11不直接參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)Caspase4Caspase2Caspase8Caspase9Caspase10Caspase3Caspase6caspase7參與細(xì)胞凋亡的起始對(duì)執(zhí)行者的前體切割，產(chǎn)生有活性的執(zhí)行者參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行：切割結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白激活期：應(yīng)答死亡信號(hào)，起始caspase活化，同型活化執(zhí)行期：執(zhí)行細(xì)胞死亡，異型活化細(xì)胞凋亡3）Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡?！は掠蜟aspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬;導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。Bcl-2,Bcl-x,Bcl-w,抑制細(xì)胞凋亡，Bax,Bak,Noxa促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2,Bcl-x與Bax,Bak形成異二聚體，通過(guò)抑制Bax和Bak寡聚體化來(lái)抑制膜通道的開(kāi)啟。凋亡信號(hào)Bax,Bak聚集、轉(zhuǎn)移到Mt膜上與VDAC作用通道開(kāi)放，Cytc釋放啟動(dòng)細(xì)胞凋亡４）Caspase非依賴(lài)的細(xì)胞調(diào)亡５）生死抉擇：細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞中存在Caspase抑制因子，能夠直接與Caspase

活性分子結(jié)合，抑制其底物的切割作用。如：c-IAP，BARIAP特異性地與執(zhí)行Caspase-3和Caspase-7的活化形式結(jié)合，發(fā)揮抑制作用XIAP,ILP-2和Linvin能抑制起始Caspase-9c-FLIP,BAR,ARC能夠抑制死亡受體對(duì)Caspase-8的激活。IAP家族成員的抗凋亡作用也能被特異的抑制因子解除。凋亡啟動(dòng)后，Smac/DIABLO和Omi/HtrA2與Cytc一起從Mt中釋放出來(lái)，與IAP結(jié)合并釋放被IAP封閉的Caspase.天花病毒CrmA抑制Caspase-8桿病毒p35對(duì)大多數(shù)Caspase有較強(qiáng)的抑制作用。皰疹病毒和痘病毒c-FLIP,含有兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域，可與死亡受體Fas的接頭蛋白FADD作用，阻止Caspase-8與FADD結(jié)合及活化，來(lái)抑制凋亡。6）細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)NF-kB是細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子它的靶基因是TRAF，IAPS等，這些基因的表達(dá)蛋白能抑制Caspase8的活性從而抑制細(xì)胞凋亡。Ras活化NF-Kb，NF-kB通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)蛋白，抑制Caspase8的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。p53是腫瘤抑制基因，可以阻斷細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞在DNA損傷后便停止DNA復(fù)制，這是P53蛋白表達(dá)、聚集并進(jìn)一步上調(diào)一系列基因表達(dá)的結(jié)果。P21便是其中之一,P21具有抑制細(xì)胞周期素/細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶的底物磷酸化作用，導(dǎo)致G1期阻滯，使細(xì)胞贏得時(shí)間，在進(jìn)入S期前修復(fù)損傷的DNA。如果損傷不能修復(fù)，P53就激活那些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。當(dāng)P53基因發(fā)生缺失或異常時(shí)，P53失去對(duì)細(xì)胞的監(jiān)視作用，帶著損傷的DNA進(jìn)入S期，其結(jié)果是細(xì)胞因遺傳不穩(wěn)定性而產(chǎn)生突變和染色體畸變，最后導(dǎo)致細(xì)胞癌變。P53基因產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可提供一種防護(hù)機(jī)制，使DNA損傷的細(xì)胞不能存活，而走向程序性死亡。（二）細(xì)胞壞死：可能是細(xì)胞程序性死亡的另一種形式。壞死的早期階段,染色體形成串狀片段,細(xì)胞器膨脹，壞死的最后階段,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞解體,內(nèi)容物散逸。（三）細(xì)胞自噬：細(xì)胞中出現(xiàn)大的來(lái)自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中雙層膜包裹的自噬泡，成為自噬小體。自噬小體包裹著整個(gè)細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)，且與容酶體融合后，內(nèi)含物被容酶體中的水解酶消化。二、植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡（一）植物細(xì)胞的程序性死亡1）概述：導(dǎo)管的分化、通氣組織的形成，糊粉層的退化，絨氈細(xì)胞的死亡，胚胎發(fā)育過(guò)程中胚柄的退化，單性植物中花器官的程序性退化等過(guò)程以及對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)，均存在細(xì)胞程序性死亡。另細(xì)胞在受到某些真菌或細(xì)菌感染后主動(dòng)、快速死亡，也是細(xì)胞的程序性死亡2）特征：死亡細(xì)胞的殘余物被細(xì)胞壁固定在原位。在過(guò)敏反應(yīng)中：染色質(zhì)凝縮，DNA降解為50kb片段，細(xì)胞質(zhì)膜與液泡膜皺縮破裂，質(zhì)壁分離，內(nèi)涵物泄露。管狀細(xì)胞分化：細(xì)胞壁增厚，液泡膜破裂，核DNA被迅速降解，內(nèi)涵物被水解，最后僅剩下細(xì)胞壁。3）誘導(dǎo)因素：活性氧和植物激素（二）酵母細(xì)胞的程序性死亡特征：DNA凝聚、邊緣化和斷裂，Cytc從Mt中的釋放。Yca1的缺失降低了酵母細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性。Nma111在核內(nèi)聚集，引發(fā)凋亡?！爸鲃?dòng)自殺”清除適應(yīng)不良的個(gè)體以及控制群體數(shù)量，比較項(xiàng)目細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死外形細(xì)胞變圓、變小細(xì)胞膨脹，外形不規(guī)則細(xì)胞膜完整，細(xì)胞膜內(nèi)陷，將胞內(nèi)物質(zhì)分割包圍成凋亡小體破壞，導(dǎo)致胞漿外溢細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)成分密度增高，發(fā)生凝集，最初細(xì)胞器保持完整性細(xì)胞器被破壞，溶酶體膜破壞，水解酶破壞胞內(nèi)成分細(xì)胞核染色質(zhì)斷裂成一定大小的片斷、凝縮、邊緣化，形成凋亡小體，產(chǎn)生DNAladder整個(gè)核濃縮，核膜破裂，核溶解，DNA被切碎，沒(méi)有DNAladderCa2+濃度增高沒(méi)發(fā)現(xiàn)變化核酸內(nèi)切酶被活化沒(méi)發(fā)現(xiàn)變化基因控制由相關(guān)基因控制無(wú)基因控制與周?chē)M織的關(guān)系凋亡小體被周?chē)募?xì)胞吞噬，胞內(nèi)含物不外溢，周?chē)话l(fā)生炎癥細(xì)胞外溢成分侵襲影響周?chē)M織，經(jīng)常引起炎癥比較細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死

第二節(jié)細(xì)胞衰老一、細(xì)胞衰老的概念及特征現(xiàn)代人類(lèi)面臨著3種衰老：◆生理性衰老◆病理性衰老◆心理性衰老●衰老(senescing，aging)是機(jī)體在退化時(shí)期生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn),是不可逆的生命過(guò)程。人的衰老與細(xì)胞的衰老相關(guān)聯(lián)。Hayflick界限概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞。細(xì)胞來(lái)源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來(lái)源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來(lái)自胎兒：可傳代50次（與供體年齡來(lái)自成人；可傳代20次有關(guān)）來(lái)自小鼠：可傳代14－28次（與供體物種來(lái)自烏龜：可傳代90－125次特性有關(guān)）物種的壽命與體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞傳代次數(shù)的關(guān)系

Hayflick的一些經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1.從胎兒肺取到的成纖維細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下傳代50次。而從成人肺取到的成纖維細(xì)胞只能傳代20次，可見(jiàn)細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)。2.1961年Hayflick等觀察到在人二倍體成纖維細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，增殖能力有一定限度。正常細(xì)胞培養(yǎng)到一定時(shí)期，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，漸漸失去有絲分裂的能力并在細(xì)胞內(nèi)積累大量碎片和顆粒，最終難免死亡。海弗立克認(rèn)為這是人的壽命在細(xì)胞水平的表示。Hayflick還比較取自壽命長(zhǎng)度不同的生物的胚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的傳代次數(shù)和壽命的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著確定的相互關(guān)系。3、早老癥病人細(xì)胞培養(yǎng)只傳代2-4次4.用巴氏小體做標(biāo)記老男和少女細(xì)胞的培養(yǎng)，證明細(xì)胞內(nèi)部決定衰老5.胞質(zhì)體和完整細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)證明是細(xì)胞核決定衰老Hayflick得出這樣的結(jié)論細(xì)胞、至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的而是有一定壽命的。它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有一定界限的。這就是有名的Hayflick界限。細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見(jiàn)的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生;人體和動(dòng)物的各種器官和組織都是由細(xì)胞組成的，整體水平的老化是機(jī)體各部分組織細(xì)胞老化的總的反映。從五官的感覺(jué)功能的老年性退化，如人眼的視力調(diào)節(jié)能力隨年齡而降低，到老年性疾病引起死亡率的提高，如腎、心、腦組織中血管的故障、骨質(zhì)疏松、肺功能和免疫功能的缺陷等等，都是以細(xì)胞發(fā)生的變化為基礎(chǔ)的。一名男子從36歲到75歲味覺(jué)喪失64％腎小球減少44％腎小球過(guò)濾率減少31％脊神經(jīng)元減少37％神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢10％腦供血量減少20％肺活量減少

44％1小鼠的表皮移植表皮移植7-8年，說(shuō)明體內(nèi)環(huán)境因素影響了細(xì)胞的壽命2骨髓移植說(shuō)明骨髓干細(xì)胞的衰老至少是緩慢的（一）衰老過(guò)程中細(xì)胞核的變化在衰老變化中細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的最明顯變化是核膜內(nèi)折。電鏡檢測(cè)可見(jiàn)衰老細(xì)胞核形狀不規(guī)則、內(nèi)陷和斷裂。在體內(nèi)細(xì)胞中也觀察到核膜的不同程度的內(nèi)折，神經(jīng)細(xì)胞尤為明顯，這種內(nèi)折隨年齡增長(zhǎng)而增加，最后可能導(dǎo)致核膜崩解。染色體固縮化是衰老細(xì)胞核中另一個(gè)重要變化。在衰老細(xì)胞中，細(xì)胞核固縮，還常常出現(xiàn)核內(nèi)容物，核質(zhì)染色加深，核的細(xì)致結(jié)構(gòu)逐漸消失，核仁也發(fā)生明顯的變化。

（二）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化在衰老細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列變得無(wú)序，膜腔膨脹擴(kuò)大甚至崩解，膜面上核糖體數(shù)量減少。（三）衰老過(guò)程中線(xiàn)粒體的變化多數(shù)研究工作表明，細(xì)胞中線(xiàn)粒體的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，而其體積則隨著年齡的增長(zhǎng)而增大。衰老的神經(jīng)元，肝臟細(xì)胞和肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體數(shù)目減少，但體積增大。同時(shí)，線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，腫脹空泡化，內(nèi)部嵴大大減少。線(xiàn)粒體崩解是細(xì)胞衰老變化的重要標(biāo)志。線(xiàn)粒體變化主要是自由基損傷的結(jié)果，因?yàn)榫€(xiàn)粒體的呼吸鏈?zhǔn)菗p傷性自由基的發(fā)源地。線(xiàn)粒體DNA成為自由基的主要攻擊目標(biāo)，使線(xiàn)粒體DNA呈逐漸減少或使線(xiàn)粒體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物逐漸減少，直接影響與線(xiàn)粒體呼吸和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成，造成ATP合成和細(xì)胞能量供應(yīng)不足，引起細(xì)胞功能紊亂，直到細(xì)胞死亡。（四）致密體的生成是衰老細(xì)胞中常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)。（五）膜體系的變化1.細(xì)胞的間隙連接明顯減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小，這種變化使細(xì)胞間代謝協(xié)作減少了。2.細(xì)胞膜上的微絨毛數(shù)目增加，補(bǔ)償了衰老時(shí)細(xì)胞間聯(lián)系的衰退，以利于保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。3.膜脂相發(fā)生改變，不飽和脂肪酸含量增加，膜流動(dòng)性下降。膜的微粘度增加，從而影響膜表面受體的移動(dòng)和特異性生物化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)。二、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制細(xì)胞的衰老（senescence）現(xiàn)在關(guān)于細(xì)胞衰老的分子機(jī)制的研究，引起人們關(guān)注的有染色體端粒復(fù)制和線(xiàn)粒體自由基的假說(shuō)。（一