仿生微流控芯片構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的關(guān)鍵技術(shù)與應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對人體生理和病理過程的深入理解以及高效的藥物研發(fā)一直是研究的核心目標(biāo)。微流控芯片作為一種新興的技術(shù)平臺，近年來展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。它能夠在微小的尺度上精確操控流體，集成多種生物醫(yī)學(xué)分析功能，為生物醫(yī)學(xué)研究帶來了全新的視角和方法。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，源于人們對傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究方法局限性的突破需求。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型雖然在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，但它們存在著諸多不足。例如，傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)無法真實模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的三維微環(huán)境，細(xì)胞在這種環(huán)境下的行為和功能與體內(nèi)情況存在較大差異，使得研究結(jié)果的可靠性和臨床轉(zhuǎn)化價值受到限制。而動物模型由于物種差異，其生理和病理反應(yīng)與人類并不完全相同，導(dǎo)致在藥物研發(fā)過程中，基于動物實驗的結(jié)果往往難以準(zhǔn)確預(yù)測藥物在人體中的療效和安全性，這不僅增加了藥物研發(fā)的成本和時間，也使得許多在動物實驗中表現(xiàn)良好的藥物在臨床試驗中失敗。微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了新的途徑。它能夠在芯片上構(gòu)建出類似于人體組織和器官的微環(huán)境，實現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)和多種細(xì)胞之間的相互作用模擬。通過精確控制微流道中的流體流動，可以模擬體內(nèi)的血液循環(huán)、物質(zhì)運輸和代謝過程，使得細(xì)胞在芯片上的行為和功能更加接近體內(nèi)真實情況。這種高度仿生的特性，使得微流控芯片在藥物篩選、疾病模型構(gòu)建、個性化醫(yī)療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在藥物研發(fā)過程中，準(zhǔn)確預(yù)測藥物的療效和安全性是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，藥物研發(fā)的成功率較低，很大程度上是因為缺乏能夠準(zhǔn)確模擬人體生理和病理過程的模型。構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型對于藥物研發(fā)具有重要意義。腸道和肝臟是人體藥物代謝和解毒的主要器官，口服藥物首先通過腸道吸收進入血液循環(huán)，然后經(jīng)過肝臟的代謝轉(zhuǎn)化。因此，一個能夠準(zhǔn)確模擬腸肝系統(tǒng)生理功能和相互作用的模型，對于研究藥物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過程，預(yù)測藥物的療效和毒性，優(yōu)化藥物設(shè)計具有重要價值。通過在微流控芯片上構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型，可以在體外模擬藥物在體內(nèi)的代謝過程，為藥物研發(fā)提供更加真實可靠的實驗數(shù)據(jù)，從而加速藥物研發(fā)進程，降低研發(fā)成本。腸道和肝臟在維持人體健康中扮演著不可或缺的角色，它們之間存在著緊密的聯(lián)系，形成了所謂的“腸肝軸”。腸道微生物群落的失衡、腸道屏障功能的受損以及肝臟的代謝異常等都與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如炎癥性腸病、非酒精性脂肪性肝病、肝硬化、肝癌等。深入研究腸肝系統(tǒng)的生理病理機制，對于揭示這些疾病的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療方法具有重要意義?；诜律⒘骺匦酒哪c肝系統(tǒng)模型能夠在體外模擬腸肝軸的生理病理過程，為研究這些疾病的發(fā)病機制提供了一個理想的平臺。通過在芯片上構(gòu)建疾病模型，可以深入研究疾病的發(fā)生發(fā)展過程，探索潛在的治療靶點和治療策略，為疾病的治療提供新的思路和方法。本研究致力于基于仿生微流控芯片構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型，旨在利用微流控芯片的優(yōu)勢，精確模擬腸肝系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)和功能，以及它們之間的相互作用。通過該模型，深入研究藥物在腸肝系統(tǒng)中的代謝過程，為藥物研發(fā)提供更加準(zhǔn)確可靠的體外模型；同時，利用該模型研究腸肝相關(guān)疾病的發(fā)病機制，為疾病的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。這一研究不僅具有重要的科學(xué)意義，也具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出積極貢獻。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，仿生微流控芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究取得了顯著進展，吸引了國內(nèi)外眾多科研團隊的關(guān)注。在國外，哈佛大學(xué)Wyss生物啟發(fā)工程研究所的DonaldE.Ingber團隊一直處于該領(lǐng)域的前沿。他們率先開發(fā)出了多種器官芯片，如肺芯片、肝芯片等，通過精確控制微流道中的流體流動和細(xì)胞微環(huán)境，成功模擬了器官的生理功能和病理過程。例如，他們在肺芯片的研究中，通過在微流控芯片上構(gòu)建肺泡-毛細(xì)血管界面，實現(xiàn)了對肺部氣體交換、炎癥反應(yīng)和藥物傳輸?shù)冗^程的模擬，為肺部疾病的研究和藥物開發(fā)提供了重要的工具。在腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建方面，國外也有許多重要的研究成果。加州大學(xué)洛杉磯分校的研究團隊利用微流控芯片構(gòu)建了腸-肝共培養(yǎng)模型，該模型能夠模擬藥物在腸道中的吸收和肝臟中的代謝過程。他們通過在芯片上培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，實現(xiàn)了兩種細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信號傳遞，研究了藥物在腸肝軸中的代謝動力學(xué)和毒性效應(yīng)。此外，荷蘭的Mimetas公司專注于類器官技術(shù)與微流控芯片的結(jié)合，開發(fā)出了能夠長期穩(wěn)定培養(yǎng)腸類器官和肝類器官的微流控平臺，為研究腸肝系統(tǒng)的發(fā)育、疾病發(fā)生機制和藥物篩選提供了更加真實的模型。國內(nèi)在仿生微流控芯片和腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建方面的研究也發(fā)展迅速。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的秦建華團隊在微流控芯片的設(shè)計、制備和應(yīng)用方面取得了一系列成果。他們開發(fā)了多種用于細(xì)胞培養(yǎng)和分析的微流控芯片，通過優(yōu)化芯片的結(jié)構(gòu)和材料，提高了細(xì)胞培養(yǎng)的效率和穩(wěn)定性。在腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建方面，上海交通大學(xué)的研究團隊利用3D打印技術(shù)制備了具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微流控芯片，并在芯片上成功構(gòu)建了腸-肝-腎多器官模型，實現(xiàn)了對藥物在多器官中的代謝和毒性的綜合研究。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。首先，目前的仿生微流控芯片雖然能夠在一定程度上模擬器官的生理功能，但與真實的人體器官相比，仍存在較大差距。例如，芯片中的細(xì)胞微環(huán)境還不夠復(fù)雜，缺乏體內(nèi)器官中存在的多種細(xì)胞類型和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。其次，在腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建方面，大多數(shù)研究僅關(guān)注了腸道和肝臟的代謝功能，而對腸肝軸中復(fù)雜的信號通路和免疫調(diào)節(jié)機制的研究還相對較少。此外，現(xiàn)有模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性有待提高，這限制了其在藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用中的推廣。最后，微流控芯片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化進程還面臨諸多挑戰(zhàn)，如芯片的制備成本高、檢測技術(shù)不夠完善等，這些問題需要進一步解決，以推動該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究的核心目標(biāo)是基于仿生微流控芯片構(gòu)建一個高度仿真的腸肝系統(tǒng)模型，該模型能夠精確模擬腸肝系統(tǒng)的生理功能、物質(zhì)交換以及相互作用機制，為藥物研發(fā)和腸肝相關(guān)疾病研究提供創(chuàng)新且有效的工具。在具體研究內(nèi)容方面，首先是進行仿生微流控芯片的設(shè)計與制備?；趯δc肝系統(tǒng)生理結(jié)構(gòu)和功能的深入理解，運用先進的微加工技術(shù)，設(shè)計并制備具有特定微通道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞培養(yǎng)腔室的微流控芯片。通過優(yōu)化芯片的材料選擇和結(jié)構(gòu)參數(shù)，確保芯片能夠為細(xì)胞提供穩(wěn)定且適宜的生長環(huán)境，同時實現(xiàn)對流體流動和物質(zhì)傳輸?shù)木_控制。例如，精確設(shè)計微通道的尺寸和形狀，使其能夠模擬體內(nèi)的血液循環(huán)和物質(zhì)運輸速度，為細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和代謝廢物清除環(huán)境。其次是細(xì)胞培養(yǎng)與接種。選擇合適的腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞系，建立高效的細(xì)胞培養(yǎng)體系。通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、濕度和氣體環(huán)境等，確保細(xì)胞在體外能夠保持良好的活性和功能。采用先進的細(xì)胞接種技術(shù)，將腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞精確地接種到微流控芯片的相應(yīng)腔室中，構(gòu)建腸肝共培養(yǎng)體系。例如，利用微流控芯片的微納結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞按照特定的方式排列和生長，形成類似于體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞層，增強細(xì)胞之間的相互作用和信號傳遞。再者是模型功能驗證與優(yōu)化。對構(gòu)建的腸肝系統(tǒng)模型進行全面的功能驗證，通過檢測細(xì)胞的代謝活性、基因表達水平、蛋白質(zhì)分泌等指標(biāo)，評估模型對腸肝系統(tǒng)生理功能的模擬程度。研究藥物在模型中的吸收、代謝和排泄過程，與體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)進行對比分析，驗證模型在藥物研發(fā)方面的有效性。根據(jù)驗證結(jié)果，對模型進行優(yōu)化和改進，進一步提高模型的準(zhǔn)確性和可靠性。例如，利用先進的檢測技術(shù)，如高分辨率顯微鏡、質(zhì)譜分析、基因測序等，對模型中的細(xì)胞和分子進行全面分析，深入了解模型的功能特性和潛在問題，從而有針對性地進行優(yōu)化。此外，本研究的創(chuàng)新點在于多方面的突破。在芯片設(shè)計上，創(chuàng)新性地引入了微納結(jié)構(gòu)和多功能材料，實現(xiàn)了對細(xì)胞微環(huán)境的精確調(diào)控。例如，利用納米材料的特殊性質(zhì)，構(gòu)建具有仿生表面的微流控芯片，增強細(xì)胞與芯片表面的相互作用，促進細(xì)胞的黏附和生長。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)上，采用了三維培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)相結(jié)合的方法，使細(xì)胞能夠在更接近體內(nèi)的環(huán)境中生長和分化，提高了細(xì)胞的功能活性和穩(wěn)定性。在模型應(yīng)用方面，首次將該腸肝系統(tǒng)模型應(yīng)用于腸肝軸相關(guān)疾病的發(fā)病機制研究，通過模擬疾病狀態(tài)下的微環(huán)境變化，深入探究疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為疾病的治療提供新的靶點和策略。二、仿生微流控芯片及腸肝系統(tǒng)原理基礎(chǔ)2.1仿生微流控芯片概述2.1.1微流控芯片工作原理微流控芯片是一種能夠在微小尺度（通常為微米級）上精確操控和處理微小體積流體的技術(shù)平臺，其工作原理基于微流體力學(xué)和微機電系統(tǒng)（MEMS）技術(shù)。芯片上集成了微通道、微閥門、微泵等多種微流控元件，這些元件協(xié)同工作，實現(xiàn)了對微流體的精確操控。微通道是微流控芯片的核心結(jié)構(gòu)，其尺寸通常在微米甚至亞微米級別。在微通道中，流體的流動遵循微流體力學(xué)原理，與傳統(tǒng)的宏觀流體流動有著顯著的差異。由于微通道的尺寸極小，流體在其中流動時具有低雷諾數(shù)的特點，這使得流體的流動狀態(tài)更加穩(wěn)定，層流現(xiàn)象明顯。例如，在宏觀尺度下，當(dāng)水流通過管道時，可能會出現(xiàn)湍流，導(dǎo)致流體的混合和傳輸較為復(fù)雜；而在微流控芯片的微通道中，由于雷諾數(shù)低，流體主要以層流的形式流動，這使得流體的流動可以被精確控制，有利于實現(xiàn)精確的化學(xué)反應(yīng)和生物分析。微閥門在微流控芯片中起著關(guān)鍵的控制作用，它可以通過外部信號（如電壓、磁場、溫度等）來控制通道的開閉，從而實現(xiàn)對流體的切換、混合和分配等操作。例如，電磁式微閥門利用電磁力來控制閥門的開合，當(dāng)施加電壓時，電磁力使閥門打開，流體得以通過；當(dāng)電壓撤銷時，閥門關(guān)閉，阻止流體流動。這種精確的控制能力使得微流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜的流體操作，如在生物醫(yī)學(xué)檢測中，精確控制不同試劑的加入順序和量，以實現(xiàn)對生物分子的高效檢測。微泵則是為微流控芯片提供流體動力的裝置，常見的微泵類型包括微注射泵、氣動泵、壓電泵等。微注射泵通過精確控制活塞的運動來實現(xiàn)對流體的定量輸送，適用于需要精確控制流量的實驗；氣動泵則利用氣體壓力來驅(qū)動流體流動，具有結(jié)構(gòu)簡單、易于操作的優(yōu)點；壓電泵則基于壓電效應(yīng)，通過壓電材料的振動來產(chǎn)生流體的驅(qū)動力，具有響應(yīng)速度快、能耗低等特點。以細(xì)胞培養(yǎng)實驗為例，微泵可以精確地將含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基輸送到細(xì)胞培養(yǎng)腔室中，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，同時將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物及時排出，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，微流控芯片的獨特優(yōu)勢使其得到了廣泛的應(yīng)用。它能夠?qū)崿F(xiàn)對生物樣品的快速、高效分析，大大縮短了檢測時間。例如，在疾病診斷中，傳統(tǒng)的檢測方法可能需要數(shù)小時甚至數(shù)天才能得到結(jié)果，而微流控芯片可以在幾分鐘內(nèi)完成對病原體、癌細(xì)胞等的檢測。微流控芯片還具有高通量的特點，可以同時對多個樣品進行分析，提高了實驗效率。此外，由于芯片的體積小、所需樣品量少，降低了實驗成本，減少了對珍貴生物樣品的消耗。同時，微流控芯片的集成化程度高，可以將樣品處理、反應(yīng)、檢測等多個步驟集成在一個芯片上，實現(xiàn)了“芯片實驗室”的概念，為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷提供了便捷、高效的工具。2.1.2仿生設(shè)計理念仿生設(shè)計理念是將自然界中生物體的結(jié)構(gòu)、功能和行為等特點融入到微流控芯片的設(shè)計中，旨在構(gòu)建更加貼近生物體內(nèi)真實環(huán)境的微流控系統(tǒng)，從而提高模型的仿生度和研究的準(zhǔn)確性。在微流控芯片的仿生設(shè)計中，模仿生物體的生理結(jié)構(gòu)是一個重要方面。例如，腸道具有復(fù)雜的絨毛和微絨毛結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)極大地增加了腸道的表面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在設(shè)計仿生腸道微流控芯片時，可以通過微加工技術(shù)在芯片表面構(gòu)建類似絨毛和微絨毛的微納結(jié)構(gòu)。利用光刻、蝕刻等工藝，在芯片表面制造出高度和密度可控的微小突起，模擬腸道絨毛的形態(tài)。這些微納結(jié)構(gòu)不僅增加了芯片與細(xì)胞或生物分子的接觸面積，還能改變流體在芯片內(nèi)的流動模式，使其更接近腸道內(nèi)的流體動力學(xué)環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞在這種具有仿生結(jié)構(gòu)的芯片上培養(yǎng)時，能夠更好地感知和響應(yīng)周圍環(huán)境的信號，從而維持其正常的生理功能和代謝活動。模仿生物體的功能也是仿生微流控芯片設(shè)計的關(guān)鍵。以肝臟為例，肝臟具有強大的代謝和解毒功能，這依賴于肝細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)和功能以及肝臟內(nèi)復(fù)雜的血液循環(huán)系統(tǒng)。為了在微流控芯片上模擬肝臟的功能，需要構(gòu)建合適的肝細(xì)胞培養(yǎng)體系和流體循環(huán)系統(tǒng)?？梢圆捎萌S培養(yǎng)技術(shù)，將肝細(xì)胞培養(yǎng)在具有特定結(jié)構(gòu)的支架材料上，使其形成類似于肝臟組織的三維結(jié)構(gòu)，促進肝細(xì)胞之間的相互作用和信號傳遞。同時，設(shè)計微通道網(wǎng)絡(luò)來模擬肝臟內(nèi)的血液循環(huán)，通過精確控制流體的流速和成分，為肝細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并及時清除代謝廢物。這樣的仿生設(shè)計能夠使芯片上的肝細(xì)胞更好地發(fā)揮代謝和解毒功能，為研究藥物代謝和肝臟疾病提供更真實的模型。仿生微流控芯片還注重模仿生物體的動態(tài)變化和自適應(yīng)調(diào)節(jié)機制。在生物體內(nèi)，生理過程是動態(tài)變化的，并且能夠根據(jù)環(huán)境的變化進行自適應(yīng)調(diào)節(jié)。例如，腸道在消化過程中，會根據(jù)食物的種類和攝入量調(diào)整消化液的分泌和腸道蠕動的頻率。在微流控芯片的設(shè)計中，可以引入反饋控制系統(tǒng)，根據(jù)芯片內(nèi)的實時監(jiān)測數(shù)據(jù)（如細(xì)胞代謝產(chǎn)物的濃度、流體的流速等）自動調(diào)節(jié)微泵的流速、微閥門的開閉等參數(shù)，以模擬生物體的自適應(yīng)調(diào)節(jié)過程。通過這種動態(tài)和自適應(yīng)的設(shè)計，仿生微流控芯片能夠更準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的生理和病理過程，為深入研究生物醫(yī)學(xué)問題提供更有效的工具。2.2腸肝系統(tǒng)生理特性剖析2.2.1腸道生理功能腸道作為人體消化系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)著消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)以及維持機體屏障功能等關(guān)鍵作用。從消化功能來看，食物在口腔和胃中經(jīng)過初步機械和化學(xué)消化后，進入小腸。小腸內(nèi)存在多種消化酶，這些酶由胰腺分泌后進入小腸，對食物進行進一步的化學(xué)分解。例如，胰淀粉酶將淀粉分解為麥芽糖，胰蛋白酶將蛋白質(zhì)分解為多肽和氨基酸，胰脂肪酶將脂肪分解為甘油和脂肪酸，使得食物能夠被充分消化，為后續(xù)的吸收過程做好準(zhǔn)備。腸道的吸收功能主要由小腸完成，小腸黏膜上存在大量絨毛和微絨毛結(jié)構(gòu)。絨毛是小腸黏膜向腸腔內(nèi)的細(xì)小突起，而微絨毛則是絨毛上皮細(xì)胞游離面的細(xì)胞膜突起，它們極大地增加了小腸的表面積，使得小腸的吸收面積可達200-400平方米。這種龐大的表面積為營養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供了充足的空間，使得葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)能夠高效地通過小腸上皮細(xì)胞進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)。以葡萄糖的吸收為例，小腸上皮細(xì)胞通過主動運輸?shù)姆绞?，利用載體蛋白和鈉-鉀泵，將葡萄糖從腸腔轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，再通過協(xié)助擴散的方式進入血液，為機體提供能量。腸道還具有重要的屏障功能，它是機體抵御病原體入侵的第一道防線。腸道黏膜由上皮細(xì)胞緊密連接而成，形成了物理屏障，阻止病原體和有害物質(zhì)進入體內(nèi)。腸道內(nèi)還存在大量的免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們構(gòu)成了免疫屏障。腸道菌群也在屏障功能中發(fā)揮著重要作用，它們與腸道上皮細(xì)胞相互作用，維持腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌的生長。當(dāng)腸道屏障功能受損時，病原體和有害物質(zhì)容易進入體內(nèi)，引發(fā)腸道炎癥、感染等疾病，甚至可能導(dǎo)致全身性的病理反應(yīng)。腸道的細(xì)胞組成也與其功能密切相關(guān)。小腸上皮細(xì)胞是腸道的主要細(xì)胞類型，包括吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞等。吸收細(xì)胞具有微絨毛結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；杯狀細(xì)胞分泌黏液，保護腸道黏膜，潤滑腸道，有助于食物的運輸；潘氏細(xì)胞則分泌抗菌物質(zhì)，如防御素等，參與腸道的免疫防御。此外，腸道內(nèi)還存在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，它們能夠分泌多種激素，如胃泌素、胰高血糖素樣肽-1等，調(diào)節(jié)腸道的消化、吸收和蠕動等生理功能。2.2.2肝臟生理功能肝臟作為人體最大的實質(zhì)性器官，在代謝、解毒、分泌膽汁等方面發(fā)揮著不可替代的重要作用，對維持機體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在代謝方面，肝臟參與了碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的三大物質(zhì)代謝過程。在碳水化合物代謝中，肝臟通過糖原合成與分解以及糖異生作用來維持血糖的穩(wěn)定。當(dāng)血糖濃度升高時，胰島素分泌增加，促使肝臟將葡萄糖合成肝糖原儲存起來；當(dāng)血糖濃度降低時，胰高血糖素分泌增加，刺激肝臟分解肝糖原，釋放葡萄糖進入血液，以維持血糖水平。在脂肪代謝中，肝臟合成和分泌脂蛋白，參與脂肪的運輸和代謝。同時，肝臟也是脂肪酸β-氧化的主要場所，通過氧化脂肪酸產(chǎn)生能量。肝臟還能將多余的糖類和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪儲存起來。在蛋白質(zhì)代謝中，肝臟合成多種血漿蛋白，如白蛋白、凝血因子等，這些蛋白質(zhì)對于維持血漿膠體滲透壓、凝血功能等具有重要意義。肝臟還參與氨基酸的代謝，通過轉(zhuǎn)氨基、脫氨基等作用，合成非必需氨基酸，同時將含氮廢物轉(zhuǎn)化為尿素排出體外。肝臟的解毒功能是其重要生理特性之一。肝臟能夠?qū)M入體內(nèi)的各種有害物質(zhì)，如藥物、毒物、酒精等進行代謝轉(zhuǎn)化，使其毒性降低或易于排出體外。肝臟中的細(xì)胞色素P450酶系是參與解毒過程的關(guān)鍵酶類，它們能夠催化多種化學(xué)反應(yīng)，將脂溶性的有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)，便于通過尿液或膽汁排出。例如，許多藥物在肝臟中經(jīng)過細(xì)胞色素P450酶的代謝后，其活性和毒性發(fā)生改變。對于一些藥物，肝臟的代謝作用可以使其轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，發(fā)揮治療作用；而對于另一些藥物或毒物，肝臟的代謝則可以降低其毒性。肝臟分泌膽汁是其另一重要生理功能。膽汁由肝細(xì)胞產(chǎn)生，主要成分包括膽汁酸、膽色素、膽固醇等。膽汁通過膽管系統(tǒng)排入小腸，在脂肪消化和吸收過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。膽汁酸具有乳化脂肪的作用，能夠?qū)⒅救榛癁槲⒌?，增加脂肪與脂肪酶的接觸面積，促進脂肪的消化。膽汁酸還能促進脂肪分解產(chǎn)物以及脂溶性維生素（如維生素A、D、E、K）的吸收。此外，膽汁中的膽色素（主要是膽紅素）是血紅蛋白分解代謝的產(chǎn)物，通過膽汁排出體外，有助于維持體內(nèi)膽紅素的平衡。肝臟的獨特結(jié)構(gòu)——肝小葉，與其功能密切相關(guān)。肝小葉是肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位，呈多角棱柱體。每個肝小葉中央有一條中央靜脈，肝細(xì)胞單層排列成板狀結(jié)構(gòu)，以中央靜脈為中心呈放射狀分布，稱為肝板。肝板之間是肝血竇，肝血竇壁由內(nèi)皮細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞（庫普弗細(xì)胞）組成。內(nèi)皮細(xì)胞具有窗孔結(jié)構(gòu)，通透性較大，有利于肝細(xì)胞與血液之間進行物質(zhì)交換。肝巨噬細(xì)胞則具有吞噬和清除病原體、衰老細(xì)胞及異物等功能，參與肝臟的免疫防御。相鄰肝細(xì)胞局部凹陷形成膽小管，肝細(xì)胞分泌的膽汁進入膽小管，再通過各級膽管排出。這種獨特的結(jié)構(gòu)使得肝臟能夠高效地進行物質(zhì)代謝、解毒和膽汁分泌等生理功能。2.2.3腸肝循環(huán)機制腸肝循環(huán)是指藥物、膽汁酸等物質(zhì)在腸道和肝臟之間進行循環(huán)代謝的過程，這一過程對維持體內(nèi)物質(zhì)的平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要影響。以膽汁酸的腸肝循環(huán)為例，肝臟合成初級膽汁酸，如膽酸和鵝脫氧膽酸，這些初級膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸，然后隨膽汁排入小腸。在小腸中，膽汁酸參與脂肪的消化和吸收。大部分膽汁酸（約95%）在回腸末端通過主動重吸收進入門靜脈，重新回到肝臟。肝臟對重吸收的膽汁酸進行加工處理后，再與新合成的膽汁酸一起分泌入膽汁，再次排入小腸，形成膽汁酸的腸肝循環(huán)。這種循環(huán)機制使得有限的膽汁酸能夠反復(fù)利用，提高了脂肪消化和吸收的效率。據(jù)研究，人體每天進行約6-12次膽汁酸的腸肝循環(huán)，確保了膽汁酸在脂肪消化中的持續(xù)作用。藥物的腸肝循環(huán)也具有重要意義。一些藥物在肝臟代謝后，其代謝產(chǎn)物通過膽汁排入腸道。在腸道中，這些代謝產(chǎn)物可能被腸道菌群進一步代謝，或者被腸道上皮細(xì)胞重新吸收進入門靜脈，再次回到肝臟。藥物的腸肝循環(huán)會影響藥物的藥代動力學(xué)特性，延長藥物在體內(nèi)的作用時間。例如，氯霉素在肝內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合后，排入腸道，在腸道細(xì)菌酶的作用下水解釋放出原型藥物，又被腸道吸收進入肝臟，從而延長了氯霉素在體內(nèi)的作用時間。然而，藥物的腸肝循環(huán)也可能帶來一些問題，如增加藥物的毒性風(fēng)險。如果藥物的代謝產(chǎn)物在腸道中積累，可能會對腸道黏膜產(chǎn)生刺激，引發(fā)不良反應(yīng)。腸肝循環(huán)對體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。它不僅保證了膽汁酸等物質(zhì)的有效利用，維持了脂肪消化和吸收的正常進行，還影響著藥物的療效和毒性。在病理情況下，如腸道菌群失調(diào)、肝臟疾病等，腸肝循環(huán)可能會受到干擾，導(dǎo)致膽汁酸代謝異常、藥物代謝紊亂等問題，進而影響機體的健康。因此，深入研究腸肝循環(huán)機制，對于理解人體生理病理過程，以及藥物研發(fā)和疾病治療具有重要的理論和實踐意義。三、腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)3.1芯片材料與制作工藝3.1.1常用芯片材料特性在微流控芯片的制作中，材料的選擇至關(guān)重要，不同的材料具有各自獨特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，這些特性直接影響著芯片的性能、制作工藝以及應(yīng)用范圍。目前，聚二甲基硅氧烷（PDMS）、玻璃和塑料是微流控芯片制作中最為常用的材料。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一種有機硅高分子聚合物，因其卓越的綜合性能而在微流控芯片領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。PDMS具有良好的生物相容性，這使得它在與生物樣品和細(xì)胞接觸時，不會對其產(chǎn)生明顯的毒性和不良影響，能夠保證細(xì)胞的正常生長和功能發(fā)揮。在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，PDMS芯片為細(xì)胞提供了一個相對安全和適宜的生長環(huán)境，細(xì)胞在其上能夠保持良好的活性和代謝能力。PDMS具有較高的光學(xué)透明度，尤其是在可見光和近紅外光范圍內(nèi)，其透光率較高，這使得它非常適合用于基于光學(xué)檢測的微流控芯片，如熒光檢測、吸收光譜檢測等。通過PDMS芯片，研究人員可以方便地觀察和分析細(xì)胞的形態(tài)、生理活動以及生物分子的反應(yīng)過程。PDMS還具有良好的透氣性，能夠允許氣體分子自由通過，這對于需要氣體交換的細(xì)胞培養(yǎng)和生物反應(yīng)過程具有重要意義。在培養(yǎng)一些對氧氣需求較高的細(xì)胞時，PDMS芯片的透氣性能夠保證細(xì)胞獲得充足的氧氣供應(yīng)，維持其正常的呼吸代謝。PDMS易于成型，通過模塑等工藝可以快速、準(zhǔn)確地復(fù)制出各種復(fù)雜的微結(jié)構(gòu)，這大大降低了芯片的制作成本和時間。然而，PDMS也存在一些不足之處。其表面具有較強的疏水性，這可能導(dǎo)致液體在芯片表面的浸潤性較差，影響流體的流動和均勻分布。PDMS對某些有機小分子具有一定的吸附性，這可能會影響生物樣品的濃度和反應(yīng)結(jié)果。PDMS的透氣性在某些情況下也可能成為缺點，例如在需要嚴(yán)格控制氣體環(huán)境的實驗中，可能會導(dǎo)致氣體的泄漏和污染。玻璃是另一種常用的微流控芯片材料，具有許多獨特的優(yōu)勢。玻璃具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受多種化學(xué)物質(zhì)的腐蝕，在涉及強酸、強堿或有機溶劑的實驗中，玻璃芯片能夠保持結(jié)構(gòu)和性能的穩(wěn)定。玻璃表面具有一定的親水性，這使得液體在其表面能夠較好地鋪展和流動，有利于實現(xiàn)精確的流體操控。在進行微流控芯片的液體混合和反應(yīng)實驗時，玻璃芯片的親水性能夠保證液體的均勻混合和高效反應(yīng)。玻璃的光學(xué)性能優(yōu)異，具有高透明度和低熒光背景，非常適合用于高精度的光學(xué)檢測，如共聚焦顯微鏡觀察、拉曼光譜分析等。然而，玻璃芯片的制作工藝相對復(fù)雜，成本較高，需要使用光刻、蝕刻等高精度的微加工技術(shù)。玻璃的硬度較高，脆性較大，在制作和使用過程中容易出現(xiàn)破裂和損壞，這限制了其在一些對芯片柔韌性和耐用性要求較高的應(yīng)用場景中的使用。此外，玻璃與生物樣品的兼容性相對較差，需要進行表面改性等處理來提高其生物相容性。塑料材料，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等，也在微流控芯片制作中得到了一定的應(yīng)用。塑料材料具有成本低、易于加工成型的優(yōu)點，可以通過注塑、熱壓等工藝大規(guī)模生產(chǎn)微流控芯片。塑料芯片還具有較好的機械性能，柔韌性和耐用性較強，不易破裂，適合用于一些對芯片強度和穩(wěn)定性要求較高的應(yīng)用。然而，塑料的光學(xué)性能相對較差，透光率較低，熒光背景較高，這在一定程度上限制了其在光學(xué)檢測方面的應(yīng)用。塑料的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性也因材料種類而異，部分塑料可能會對生物樣品產(chǎn)生不良影響，需要進行嚴(yán)格的篩選和處理。在選擇微流控芯片材料時，需要綜合考慮芯片的應(yīng)用目的、實驗要求、制作成本等多方面因素。如果芯片主要用于細(xì)胞培養(yǎng)和生物分子檢測，且對光學(xué)檢測要求較高，PDMS可能是較為合適的選擇；如果實驗涉及復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)和高精度的光學(xué)檢測，玻璃芯片可能更具優(yōu)勢；而對于大規(guī)模生產(chǎn)和對芯片強度要求較高的應(yīng)用，塑料芯片則可能是更好的選擇。通過合理選擇芯片材料，可以制備出性能優(yōu)良、滿足不同實驗需求的微流控芯片。3.1.2光刻、模塑等制作技術(shù)光刻技術(shù)是微流控芯片制作中一項關(guān)鍵的技術(shù)，它能夠?qū)⒃O(shè)計好的圖案精確地轉(zhuǎn)移到芯片材料表面，為構(gòu)建微流控芯片的微通道、微結(jié)構(gòu)等提供了基礎(chǔ)。光刻技術(shù)的原理基于光化學(xué)反應(yīng)，主要涉及光源、掩膜版、光刻膠和芯片材料等關(guān)鍵要素。在光刻過程中，首先需要準(zhǔn)備一塊掩膜版，掩膜版上刻有與微流控芯片設(shè)計圖案相對應(yīng)的透光和不透光區(qū)域。然后，在芯片材料表面均勻涂覆一層光刻膠，光刻膠是一種對光敏感的高分子材料，根據(jù)其性質(zhì)可分為正性光刻膠和負(fù)性光刻膠。正性光刻膠在曝光后，被曝光的部分會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而變得可溶于顯影液；而負(fù)性光刻膠則相反，曝光后被曝光的部分會交聯(lián)固化，未曝光的部分可被顯影液溶解。選擇合適的光源對光刻膠進行曝光是光刻技術(shù)的核心步驟。常見的光源包括紫外光（UV）、深紫外光（DUV）和極紫外光（EUV）等，不同波長的光源具有不同的分辨率和穿透能力。紫外光波長較長，分辨率相對較低，適用于一些對圖案精度要求不高的微流控芯片制作；深紫外光波長較短，分辨率較高，能夠?qū)崿F(xiàn)更精細(xì)的圖案轉(zhuǎn)移，目前在微流控芯片制作中應(yīng)用較為廣泛；極紫外光波長極短，具有極高的分辨率，主要用于制造超大規(guī)模集成電路等對精度要求極高的領(lǐng)域，在微流控芯片制作中應(yīng)用相對較少。在曝光過程中，光源發(fā)出的光線透過掩膜版，照射到光刻膠上。光刻膠中的光敏成分吸收光子能量，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而改變其溶解性。對于正性光刻膠，被曝光的部分在顯影液中溶解，形成與掩膜版透光區(qū)域相對應(yīng)的圖案；對于負(fù)性光刻膠，未曝光的部分被顯影液溶解，留下與掩膜版不透光區(qū)域相對應(yīng)的圖案。通過光刻技術(shù)，可以在芯片材料表面形成微米甚至納米級別的精確圖案，為后續(xù)構(gòu)建微流控芯片的微通道、微閥門、微泵等結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。模塑技術(shù)是另一種在微流控芯片制作中廣泛應(yīng)用的技術(shù)，尤其適用于復(fù)制具有復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的模具。模塑技術(shù)的基本原理是將液態(tài)的芯片材料注入到具有特定微結(jié)構(gòu)的模具中，經(jīng)過固化后，芯片材料復(fù)制出模具的微結(jié)構(gòu)，從而得到所需的微流控芯片。在模塑技術(shù)中，模具的制作是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。模具通常采用光刻、蝕刻等微加工技術(shù)在硅片、玻璃等材料上制作而成。以PDMS模塑為例，首先需要制作一個具有微結(jié)構(gòu)的硅基模具。通過光刻技術(shù)在硅片表面形成所需微結(jié)構(gòu)的圖案，然后利用蝕刻技術(shù)去除不需要的硅材料，從而得到具有微結(jié)構(gòu)的硅模具。將液態(tài)的PDMS倒入硅模具中，PDMS會填充到模具的微結(jié)構(gòu)中。通過加熱或紫外線照射等方式使PDMS固化，固化后的PDMS復(fù)制了硅模具的微結(jié)構(gòu)。將固化后的PDMS從模具中剝離出來，就得到了具有微結(jié)構(gòu)的PDMS微流控芯片。模塑技術(shù)具有制作工藝簡單、成本低、生產(chǎn)效率高的優(yōu)點，能夠快速、大量地制備具有相同微結(jié)構(gòu)的微流控芯片。它還能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜三維微結(jié)構(gòu)的復(fù)制，為構(gòu)建具有復(fù)雜功能的微流控芯片提供了可能。然而，模塑技術(shù)也存在一些局限性，例如模具的制作過程較為復(fù)雜，對設(shè)備和技術(shù)要求較高；在脫模過程中，可能會對芯片的微結(jié)構(gòu)造成損傷，影響芯片的性能。光刻技術(shù)和模塑技術(shù)在微流控芯片制作中相互補充，共同為構(gòu)建高性能的微流控芯片提供了技術(shù)支持。通過光刻技術(shù)可以制作出高精度的模具，再利用模塑技術(shù)快速復(fù)制出大量的微流控芯片，這種結(jié)合方式既保證了芯片的精度和質(zhì)量，又提高了生產(chǎn)效率，降低了制作成本。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)微流控芯片的具體設(shè)計要求和應(yīng)用場景，合理選擇和優(yōu)化光刻和模塑技術(shù)，以制備出滿足需求的微流控芯片。3.2細(xì)胞培養(yǎng)與接種技術(shù)3.2.1腸、肝細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)條件在構(gòu)建基于仿生微流控芯片的腸肝系統(tǒng)模型時，選擇合適的細(xì)胞系是至關(guān)重要的一步，因為細(xì)胞的特性和功能直接影響模型的準(zhǔn)確性和可靠性。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）和人肝癌細(xì)胞（HepG2）分別是模擬腸道上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的常用細(xì)胞系，它們具有獨特的生物學(xué)特性，使其成為構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的理想選擇。Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌，在特定的培養(yǎng)條件下，它能夠自發(fā)分化為腸上皮細(xì)胞單層，其結(jié)構(gòu)和功能與小腸上皮細(xì)胞高度相似。Caco-2細(xì)胞具有典型的小腸上皮細(xì)胞特征，如表面存在微絨毛結(jié)構(gòu)，這極大地增加了細(xì)胞的表面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運。細(xì)胞之間形成緊密連接，構(gòu)建起有效的屏障功能，能夠阻止有害物質(zhì)的滲透，與小腸上皮的屏障功能類似。Caco-2細(xì)胞還表達多種與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶，如堿性磷酸酶、蔗糖酶等，這些酶在腸道的消化和吸收過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。由于Caco-2細(xì)胞具備這些特性，它能夠在細(xì)胞水平上較為準(zhǔn)確地反映藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝及轉(zhuǎn)運過程，因此被廣泛應(yīng)用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗，用于預(yù)測藥物在人小腸中的吸收情況，以及評價藥物的口服吸收。為了維持Caco-2細(xì)胞的正常生長和功能，需要提供適宜的培養(yǎng)條件。在培養(yǎng)基方面，通常使用含有10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）。胎牛血清中富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠為細(xì)胞的生長和增殖提供必要的支持。DMEM培養(yǎng)基則提供了細(xì)胞生長所需的氨基酸、維生素、糖類等基本營養(yǎng)成分。培養(yǎng)環(huán)境的溫度一般控制在37℃，這是人體的正常體溫，有利于細(xì)胞維持其生理功能。培養(yǎng)箱中的氣體環(huán)境也十分關(guān)鍵，通常需要維持5%的二氧化碳（CO?）濃度。CO?能夠溶解在培養(yǎng)基中，形成碳酸和碳酸氫根離子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其保持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，還需要定期更換培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補充新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，保證細(xì)胞的健康生長。一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長達到80%-90%融合時，需要進行傳代培養(yǎng)，以避免細(xì)胞過度生長導(dǎo)致接觸抑制，影響細(xì)胞的活性和功能。傳代時，使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）消化液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，然后按照適當(dāng)?shù)谋壤臃N到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞系，它具有許多與正常肝細(xì)胞相似的功能和特性，使其成為研究肝臟生理和病理過程以及藥物代謝的常用細(xì)胞模型。HepG2細(xì)胞能夠表達多種肝臟特異性的酶和轉(zhuǎn)運蛋白，如細(xì)胞色素P450酶系、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽等。細(xì)胞色素P450酶系在藥物代謝中起著核心作用，能夠催化多種藥物的氧化、還原和水解等代謝反應(yīng)。有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽則參與了藥物和內(nèi)源性物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運過程。HepG2細(xì)胞還能夠合成和分泌多種血漿蛋白，如白蛋白、凝血因子等，這些蛋白對于維持肝臟的正常功能和體內(nèi)的生理平衡至關(guān)重要。由于HepG2細(xì)胞具備這些肝臟相關(guān)的功能，它能夠較好地模擬肝臟在藥物代謝和解毒過程中的作用，為研究藥物在肝臟中的代謝途徑、代謝產(chǎn)物以及毒性效應(yīng)提供了有效的工具。HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)條件與Caco-2細(xì)胞有一定的相似性，但也存在一些差異。培養(yǎng)基通常選擇含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。RPMI1640培養(yǎng)基是一種廣泛應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它含有豐富的營養(yǎng)成分，能夠滿足HepG2細(xì)胞生長和代謝的需求。培養(yǎng)溫度同樣控制在37℃，氣體環(huán)境維持5%的CO?濃度。與Caco-2細(xì)胞類似，HepG2細(xì)胞也需要定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次。當(dāng)細(xì)胞生長達到80%-90%融合時進行傳代培養(yǎng)。傳代過程中，使用Trypsin-EDTA消化液消化細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中。在某些研究中，為了進一步模擬肝臟的生理環(huán)境，可能會在培養(yǎng)基中添加一些特殊的添加劑，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等，這些添加劑能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和功能，使其更接近體內(nèi)肝細(xì)胞的狀態(tài)。3.2.2細(xì)胞接種方法與優(yōu)化在將腸上皮細(xì)胞（如Caco-2細(xì)胞）和肝細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞）接種到微流控芯片上時，選擇合適的接種方法并對其進行優(yōu)化是確保細(xì)胞在芯片上良好生長和功能發(fā)揮的關(guān)鍵。目前，常用的細(xì)胞接種方法主要包括靜態(tài)接種和動態(tài)接種，它們各自具有獨特的優(yōu)缺點，適用于不同的實驗需求。靜態(tài)接種是一種較為簡單且常用的細(xì)胞接種方法。其操作過程通常是先將微流控芯片進行預(yù)處理，如清洗、消毒和表面改性等，以提高芯片表面的親水性和細(xì)胞黏附性。然后，將含有一定濃度細(xì)胞的培養(yǎng)液緩慢注入微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)腔室中。在注入過程中，需要注意避免產(chǎn)生氣泡，因為氣泡可能會干擾細(xì)胞的分布和生長。注入完成后，將芯片放置在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使細(xì)胞自然沉降并黏附在芯片表面。靜態(tài)接種的優(yōu)點是操作簡便，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)，成本較低。它適用于對細(xì)胞分布均勻性要求不是特別高的實驗，例如一些初步的細(xì)胞培養(yǎng)和功能驗證實驗。然而，靜態(tài)接種也存在一些明顯的缺點。由于細(xì)胞是自然沉降黏附，其在芯片表面的分布往往不夠均勻，容易出現(xiàn)局部細(xì)胞密度過高或過低的情況。這可能會導(dǎo)致細(xì)胞之間的相互作用不均勻，影響細(xì)胞的正常生長和功能。靜態(tài)接種過程中，細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸相對有限，可能會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足和代謝廢物積累，從而影響細(xì)胞的活性和存活率。動態(tài)接種則是一種能夠改善細(xì)胞分布均勻性和提高細(xì)胞活性的接種方法。動態(tài)接種通常借助外部設(shè)備，如微泵、蠕動泵等，在接種過程中使含有細(xì)胞的培養(yǎng)液在微流控芯片的微通道中持續(xù)流動。通過精確控制泵的流速和流量，可以使細(xì)胞在流動的培養(yǎng)液中均勻分布，并在芯片表面實現(xiàn)較為均勻的黏附。在動態(tài)接種過程中，流動的培養(yǎng)液能夠不斷為細(xì)胞提供新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時及時帶走細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，為細(xì)胞創(chuàng)造一個更接近體內(nèi)生理環(huán)境的培養(yǎng)條件，有利于提高細(xì)胞的存活率和功能。動態(tài)接種適用于對細(xì)胞分布均勻性和功能要求較高的實驗，如構(gòu)建高精度的腸肝系統(tǒng)模型用于藥物代謝研究和疾病機制探討等。然而，動態(tài)接種也存在一些不足之處。它需要額外的設(shè)備，如微泵等，增加了實驗成本和操作的復(fù)雜性。如果流速控制不當(dāng)，過高的流速可能會對細(xì)胞造成機械損傷，影響細(xì)胞的活性和功能；而過低的流速則可能無法達到預(yù)期的細(xì)胞分布效果。為了優(yōu)化細(xì)胞接種條件，提高細(xì)胞的存活率和功能，可以從多個方面進行考慮。在接種前，對芯片表面進行適當(dāng)?shù)母男蕴幚硎欠浅Ｖ匾?。例如，通過化學(xué)修飾或物理吸附等方法，在芯片表面引入一些親水性基團或細(xì)胞黏附分子，如膠原蛋白、纖連蛋白等。這些分子能夠增強細(xì)胞與芯片表面的親和力，促進細(xì)胞的黏附，提高細(xì)胞的接種效率。研究表明，在PDMS芯片表面修飾膠原蛋白后，Caco-2細(xì)胞的黏附率明顯提高，細(xì)胞在芯片上的生長狀態(tài)也得到了改善。優(yōu)化接種時的細(xì)胞濃度也是關(guān)鍵因素之一。細(xì)胞濃度過高可能會導(dǎo)致細(xì)胞之間過度擁擠，競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間，從而影響細(xì)胞的生長和功能；而細(xì)胞濃度過低則可能會導(dǎo)致細(xì)胞無法形成有效的細(xì)胞層，影響模型的構(gòu)建和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要通過預(yù)實驗來確定最佳的細(xì)胞接種濃度。對于Caco-2細(xì)胞接種到微流控芯片上，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞濃度為5×10?-1×10?個/mL時，能夠在芯片上形成較為均勻且功能良好的細(xì)胞層。接種過程中的流速和時間也需要進行優(yōu)化。對于動態(tài)接種，需要根據(jù)細(xì)胞類型和芯片結(jié)構(gòu)，精確調(diào)整流速。一般來說，較低的流速（如0.1-1μL/min）有利于細(xì)胞的黏附，避免對細(xì)胞造成過大的剪切力損傷。接種時間也應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的黏附情況進行調(diào)整，過長的接種時間可能會導(dǎo)致細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累，影響細(xì)胞活性；而過短的接種時間則可能導(dǎo)致細(xì)胞黏附不充分。通過實驗優(yōu)化，確定合適的接種時間為1-2小時，能夠使細(xì)胞在芯片上實現(xiàn)較好的黏附和分布。在接種后，及時對細(xì)胞的生長狀態(tài)進行監(jiān)測和評估也是優(yōu)化接種條件的重要環(huán)節(jié)。可以通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、分布和增殖情況，利用細(xì)胞活力檢測試劑盒（如CCK-8試劑盒）檢測細(xì)胞的存活率，通過檢測細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達來評估細(xì)胞的功能狀態(tài)。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，對后續(xù)的培養(yǎng)條件進行調(diào)整和優(yōu)化，以確保細(xì)胞在微流控芯片上能夠保持良好的生長和功能，為構(gòu)建高質(zhì)量的腸肝系統(tǒng)模型奠定基礎(chǔ)。3.3流體控制與微環(huán)境模擬3.3.1微流控芯片的流體驅(qū)動方式在微流控芯片中，精確的流體驅(qū)動是實現(xiàn)各種生物醫(yī)學(xué)實驗的關(guān)鍵，不同的流體驅(qū)動方式具有各自獨特的原理和特點，研究人員需要根據(jù)具體的實驗需求來選擇合適的驅(qū)動方式。壓力驅(qū)動是微流控芯片中最為常用的流體驅(qū)動方式之一，其原理基于流體在壓力差作用下的流動。根據(jù)帕斯卡定律，在封閉的流體系統(tǒng)中，施加在流體上的壓力會均勻地傳遞到流體的各個部分。在微流控芯片中，通過在微通道的兩端施加不同的壓力，形成壓力差，從而推動流體在微通道中流動。壓力驅(qū)動可以通過多種方式實現(xiàn)，常見的有利用注射器泵、壓力泵等外部設(shè)備來提供壓力。注射器泵通過精確控制活塞的運動，能夠?qū)崿F(xiàn)對流體流量的精確控制，適用于需要高精度流量控制的實驗。壓力泵則可以提供穩(wěn)定的壓力，常用于維持微流控芯片中流體的連續(xù)流動。壓力驅(qū)動具有結(jié)構(gòu)簡單、易于操作和控制的優(yōu)點。它能夠?qū)崿F(xiàn)對多種流體的驅(qū)動，包括水溶液、有機溶液等。在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，通過壓力驅(qū)動可以將含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基穩(wěn)定地輸送到細(xì)胞培養(yǎng)腔室中，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境。然而，壓力驅(qū)動也存在一些局限性。由于微通道的尺寸較小，流體在其中流動時會受到較大的阻力，這就需要較高的驅(qū)動壓力，可能會對細(xì)胞或生物分子造成一定的剪切力損傷。壓力驅(qū)動的響應(yīng)速度相對較慢，在需要快速切換流體或進行動態(tài)實驗時，可能無法滿足實驗要求。電驅(qū)動是另一種重要的微流控芯片流體驅(qū)動方式，主要包括電滲驅(qū)動和電泳驅(qū)動。電滲驅(qū)動的原理基于電滲現(xiàn)象，當(dāng)在微通道兩端施加電場時，微通道表面會形成雙電層。雙電層中的離子在電場作用下發(fā)生定向移動，帶動與之相連的流體一起流動。電滲驅(qū)動的優(yōu)點是可以實現(xiàn)無機械部件的流體驅(qū)動，減少了設(shè)備的復(fù)雜性和維護成本。它具有較高的響應(yīng)速度，能夠快速實現(xiàn)流體的切換和控制。在微流控芯片的生物分析實驗中，電滲驅(qū)動可以快速地將樣品和試劑輸送到反應(yīng)區(qū)域，提高實驗效率。電滲驅(qū)動的流體流動較為均勻，有利于實現(xiàn)精確的化學(xué)反應(yīng)和生物分析。然而，電滲驅(qū)動也有一定的局限性。它對微通道的材料和表面性質(zhì)有較高的要求，不同材料的微通道表面電荷密度和性質(zhì)不同，會影響電滲流的大小和穩(wěn)定性。電滲驅(qū)動需要較高的電壓，可能會對生物樣品產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)，影響生物分子的活性和功能。電泳驅(qū)動則是利用帶電粒子在電場中的遷移來實現(xiàn)流體的驅(qū)動。在微流控芯片中，當(dāng)在微通道兩端施加電場時，帶電粒子會在電場力的作用下向相反電極方向移動，從而帶動周圍的流體一起流動。電泳驅(qū)動主要應(yīng)用于生物分子的分離和分析，如DNA、蛋白質(zhì)等生物分子在電場中的遷移速度與其電荷、大小和形狀等因素有關(guān)，通過電泳驅(qū)動可以實現(xiàn)對不同生物分子的分離和檢測。電泳驅(qū)動具有分離效率高、分辨率高的優(yōu)點，能夠快速、準(zhǔn)確地分離和分析生物分子。但它同樣對樣品的性質(zhì)和電場條件有較高的要求，需要精確控制電場強度和方向，以保證分離效果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在選擇微流控芯片的流體驅(qū)動方式時，需要綜合考慮多個因素。如果實驗對流量控制的精度要求較高，且對剪切力較為敏感，如細(xì)胞培養(yǎng)和生物分子檢測實驗，壓力驅(qū)動中的注射器泵可能是較好的選擇；如果實驗需要快速切換流體和實現(xiàn)動態(tài)控制，且對微通道材料和表面性質(zhì)有一定的可控性，電驅(qū)動中的電滲驅(qū)動可能更適合；而對于生物分子的分離和分析實驗，電泳驅(qū)動則是首選的驅(qū)動方式。通過合理選擇流體驅(qū)動方式，能夠優(yōu)化微流控芯片的性能，滿足不同生物醫(yī)學(xué)實驗的需求。3.3.2模擬生理流體環(huán)境與物質(zhì)傳輸在基于仿生微流控芯片構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的過程中，精確模擬體內(nèi)的生理流體環(huán)境以及實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)、藥物等物質(zhì)的有效傳輸是模型成功的關(guān)鍵，這需要對微流控芯片中的流速、流量等參數(shù)進行精細(xì)調(diào)節(jié)。人體腸道和肝臟中的流體環(huán)境是復(fù)雜且動態(tài)變化的，具有特定的流速和流量范圍。在腸道中，食糜的流動速度和流量會隨著消化過程的進行而發(fā)生變化。在小腸中，食糜的平均流速約為0.1-1cm/s，流量則根據(jù)進食量和消化階段的不同而有所差異。在肝臟中，肝血竇內(nèi)的血液流速相對較低，約為0.01-0.1cm/s，這有利于肝細(xì)胞與血液之間進行充分的物質(zhì)交換。為了在微流控芯片中模擬這些生理流體環(huán)境，需要精確調(diào)節(jié)微流控芯片中流體的流速和流量。通過調(diào)節(jié)微流控芯片的驅(qū)動壓力或電壓，可以實現(xiàn)對流速和流量的精確控制。在壓力驅(qū)動的微流控芯片中，根據(jù)泊肅葉定律，流體在微通道中的流速與驅(qū)動壓力成正比，與微通道的半徑的四次方成正比，與流體的黏度成反比。因此，可以通過改變驅(qū)動壓力來調(diào)節(jié)流速。當(dāng)需要模擬腸道中較快的流體流速時，可以適當(dāng)增加驅(qū)動壓力；而當(dāng)模擬肝臟中較慢的流速時，則降低驅(qū)動壓力。通過選擇不同內(nèi)徑的微通道，也可以調(diào)節(jié)流速。較小內(nèi)徑的微通道會增加流體的阻力，降低流速；而較大內(nèi)徑的微通道則會減小阻力，提高流速。在電驅(qū)動的微流控芯片中，通過調(diào)節(jié)施加的電壓可以控制電滲流或電泳流的速度，從而實現(xiàn)對流體流速和流量的調(diào)節(jié)。模擬生理流體環(huán)境不僅要考慮流速和流量，還需要模擬流體的脈動性。在體內(nèi)，心臟的跳動使得血液呈現(xiàn)脈動性流動，這種脈動性對細(xì)胞的生理功能和物質(zhì)傳輸具有重要影響。在微流控芯片中，可以通過使用脈沖式壓力泵或周期性變化的電場來模擬流體的脈動性。通過周期性地改變壓力泵的輸出壓力，使流體在微通道中產(chǎn)生脈動流動，能夠更真實地模擬體內(nèi)的生理流體環(huán)境，促進細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信號傳遞。實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)、藥物等物質(zhì)在微流控芯片中的傳輸是構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的重要目標(biāo)之一。營養(yǎng)物質(zhì)和藥物在體內(nèi)的傳輸過程受到多種因素的影響，如流體的流速、細(xì)胞的攝取能力、物質(zhì)的擴散系數(shù)等。在微流控芯片中，通過調(diào)節(jié)流速和流量，可以控制營養(yǎng)物質(zhì)和藥物在芯片內(nèi)的傳輸速度和濃度分布。較高的流速可以加快物質(zhì)的傳輸速度，但可能會導(dǎo)致物質(zhì)與細(xì)胞的接觸時間過短，影響細(xì)胞對物質(zhì)的攝??；較低的流速則可以增加物質(zhì)與細(xì)胞的接觸時間，但可能會導(dǎo)致物質(zhì)在芯片內(nèi)的擴散不均勻。因此，需要根據(jù)具體的實驗需求，優(yōu)化流速和流量，以實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和藥物的有效傳輸。為了進一步提高物質(zhì)傳輸?shù)男屎蜏?zhǔn)確性，可以在微流控芯片中引入一些特殊的結(jié)構(gòu)和機制。在微通道表面修飾一些具有特異性結(jié)合能力的分子，如抗體、受體等，可以實現(xiàn)對特定物質(zhì)的選擇性傳輸和富集。在芯片中設(shè)置一些微混合器或微反應(yīng)器，能夠促進物質(zhì)之間的混合和反應(yīng)，提高物質(zhì)傳輸?shù)男?。利用微流控芯片的微納結(jié)構(gòu)，還可以實現(xiàn)對物質(zhì)的分級傳輸和分離，模擬體內(nèi)復(fù)雜的物質(zhì)代謝過程。通過精確調(diào)節(jié)微流控芯片中的流速、流量等參數(shù)，以及引入特殊的結(jié)構(gòu)和機制，可以在芯片上成功模擬體內(nèi)的生理流體環(huán)境，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)、藥物等物質(zhì)的有效傳輸，為構(gòu)建高度仿生的腸肝系統(tǒng)模型奠定堅實的基礎(chǔ)。這不僅有助于深入研究腸肝系統(tǒng)的生理病理機制，還為藥物研發(fā)和疾病治療提供了更真實、有效的實驗平臺。四、基于仿生微流控芯片的腸肝系統(tǒng)模型構(gòu)建實例4.1模型設(shè)計思路與架構(gòu)4.1.1雙流體通道三維芯片設(shè)計本研究構(gòu)建的基于仿生微流控芯片的腸肝系統(tǒng)模型采用了多層細(xì)胞的雙流體通道三維PDMS芯片設(shè)計，其設(shè)計圖如圖1所示。該芯片主要由上下兩層微通道和中間的細(xì)胞培養(yǎng)層組成，通過巧妙的結(jié)構(gòu)設(shè)計，實現(xiàn)了對腸肝系統(tǒng)生理功能的有效模擬。上層微通道主要用于模擬腸道環(huán)境，其內(nèi)部流體流動模擬腸道內(nèi)食糜的運輸過程。微通道表面經(jīng)過特殊處理，構(gòu)建了類似腸道絨毛和微絨毛的微納結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)極大地增加了微通道的表面積，有利于細(xì)胞的黏附和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在實際制作過程中，利用光刻和蝕刻技術(shù)，在PDMS芯片表面精確制造出高度為5-10μm、密度為100-200個/mm2的微絨毛狀突起，這些突起的尺寸和分布與真實腸道絨毛具有相似性。上層微通道中培養(yǎng)的是腸上皮細(xì)胞，如Caco-2細(xì)胞，它們在微納結(jié)構(gòu)的表面生長，形成緊密連接的細(xì)胞單層，模擬腸道上皮的屏障功能。下層微通道則用于模擬肝臟的血液循環(huán)，其流體流動模擬肝血竇內(nèi)血液的流動。微通道的設(shè)計考慮了肝臟內(nèi)血液流速較低的特點，通過優(yōu)化通道尺寸和形狀，控制流體流速在0.01-0.1cm/s的范圍內(nèi)，與肝臟內(nèi)的實際流速相匹配。下層微通道中培養(yǎng)的是肝細(xì)胞，如HepG2細(xì)胞，這些細(xì)胞在微通道周圍生長，能夠充分接觸到流動的培養(yǎng)液，獲取營養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝廢物。中間的細(xì)胞培養(yǎng)層是連接上下兩層微通道的關(guān)鍵部分，它通過一系列微納孔道實現(xiàn)上下層之間的物質(zhì)交換。這些微納孔道的直徑在1-5μm之間，既保證了營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和信號分子等能夠在腸肝細(xì)胞之間有效傳輸，又避免了細(xì)胞的遷移和混合。在細(xì)胞培養(yǎng)層中，腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間通過微納孔道進行物質(zhì)交換和信號傳遞，模擬腸肝軸的生理功能。例如，腸道細(xì)胞吸收的營養(yǎng)物質(zhì)可以通過微納孔道運輸?shù)礁闻K細(xì)胞，供其代謝利用；肝臟細(xì)胞產(chǎn)生的膽汁酸等物質(zhì)也可以通過微納孔道返回腸道，參與脂肪的消化和吸收。通過這種雙流體通道三維芯片設(shè)計，實現(xiàn)了腸道和肝臟微環(huán)境的獨立控制與精確模擬，同時保證了腸肝細(xì)胞之間的有效相互作用，為構(gòu)建高度仿生的腸肝系統(tǒng)模型奠定了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。[此處插入雙流體通道三維PDMS芯片設(shè)計圖]4.1.2芯片中細(xì)胞的排布與功能分工在上述雙流體通道三維芯片中，Caco-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞等按照特定的方式進行排布，各自發(fā)揮獨特的功能，協(xié)同模擬腸肝系統(tǒng)的功能。Caco-2細(xì)胞接種于上層微通道的表面，在培養(yǎng)過程中，這些細(xì)胞逐漸分化并形成緊密連接的單層細(xì)胞，類似于小腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。Caco-2細(xì)胞表面具有豐富的微絨毛，這些微絨毛極大地增加了細(xì)胞的表面積，使其能夠高效地吸收營養(yǎng)物質(zhì)。研究表明，Caco-2細(xì)胞對葡萄糖的吸收速率可達到5-10nmol/(mgprotein?min)，與小腸上皮細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力相近。Caco-2細(xì)胞之間形成的緊密連接構(gòu)建起了有效的屏障功能，能夠阻止有害物質(zhì)的滲透。通過檢測跨上皮電阻（TEER）值可以評估Caco-2細(xì)胞單層的屏障功能，一般來說，當(dāng)Caco-2細(xì)胞形成良好的單層時，其TEER值可達到1000-2000Ω?cm2。此外，Caco-2細(xì)胞還表達多種轉(zhuǎn)運蛋白和酶，參與藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝過程。例如，P-糖蛋白（P-gp）是一種重要的藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白，Caco-2細(xì)胞高表達P-gp，能夠?qū)⑦M入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，影響藥物的吸收和分布。HepG2細(xì)胞則接種于下層微通道周圍，它們在微通道的支撐下形成三維結(jié)構(gòu)，更接近肝臟組織中肝細(xì)胞的排列方式。HepG2細(xì)胞具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器，這些細(xì)胞器為其進行物質(zhì)代謝和解毒功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在代謝方面，HepG2細(xì)胞能夠合成和分泌多種血漿蛋白，如白蛋白、凝血因子等。研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，白蛋白的分泌量可達到10-20μg/(10?cells?24h)。HepG2細(xì)胞還參與藥物的代謝過程，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶系能夠催化多種藥物的氧化、還原和水解等代謝反應(yīng)。以硝苯地平為例，HepG2細(xì)胞能夠通過細(xì)胞色素P4503A4酶將其代謝為氧化產(chǎn)物，代謝轉(zhuǎn)化率可達到30%-50%。在解毒功能方面，HepG2細(xì)胞能夠?qū)M入細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)進行代謝轉(zhuǎn)化，降低其毒性。例如，對乙酰氨基酚在體內(nèi)過量時會產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物，HepG2細(xì)胞能夠通過谷胱甘肽結(jié)合等方式對其進行解毒，保護細(xì)胞免受損傷。在芯片中，Caco-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞通過中間的細(xì)胞培養(yǎng)層進行物質(zhì)交換和信號傳遞。腸道吸收的營養(yǎng)物質(zhì)、藥物等通過微納孔道運輸?shù)礁闻K，由HepG2細(xì)胞進行代謝和解毒。肝臟代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物，如膽汁酸、藥物代謝產(chǎn)物等，又通過微納孔道返回腸道，參與后續(xù)的生理過程。這種細(xì)胞之間的協(xié)同作用，有效地模擬了腸肝系統(tǒng)的功能，為研究藥物在腸肝系統(tǒng)中的代謝過程和腸肝相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供了有力的工具。4.2模型構(gòu)建實驗過程4.2.1芯片制作流程芯片制作是構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的基礎(chǔ)，本研究采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作為芯片材料，利用光刻和模塑等技術(shù)制備微流控芯片，具體流程如下：芯片掩模設(shè)計：根據(jù)腸肝系統(tǒng)模型的設(shè)計需求，使用專業(yè)的繪圖軟件（如AutoCAD、SolidWorks等）進行芯片掩模的設(shè)計。在設(shè)計過程中，精確規(guī)劃微通道的尺寸、形狀和布局，以及細(xì)胞培養(yǎng)腔室的位置和大小。對于上層模擬腸道的微通道，設(shè)計其寬度為200-500μm，高度為100-200μm，長度為1-2cm，以模擬腸道內(nèi)的流體環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)傳輸路徑。微通道表面的微絨毛狀突起高度設(shè)計為5-10μm，密度為100-200個/mm2。下層模擬肝臟血液循環(huán)的微通道，寬度設(shè)計為100-300μm，高度為50-100μm，長度為1-2cm，流速控制在0.01-0.1cm/s。細(xì)胞培養(yǎng)腔室的尺寸根據(jù)接種細(xì)胞的數(shù)量和生長需求進行設(shè)計，確保細(xì)胞有足夠的生長空間。將設(shè)計好的掩模圖案輸出為高分辨率的圖像文件，用于后續(xù)的光刻工藝。光刻工藝：光刻是將掩模圖案轉(zhuǎn)移到硅片上的關(guān)鍵步驟。首先，在清洗干凈的硅片表面均勻涂覆一層光刻膠。選擇合適的光刻膠類型，如正性光刻膠S1813，其具有較高的分辨率和良好的光刻性能。使用旋涂機以2000-3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度將光刻膠均勻地涂覆在硅片上，形成厚度約為1-2μm的光刻膠層。涂覆完成后，將硅片放入烘箱中進行前烘，溫度設(shè)置為90-110℃，時間為1-2分鐘，以去除光刻膠中的溶劑，增強光刻膠與硅片的附著力。將帶有掩模圖案的光掩膜版與涂覆有光刻膠的硅片對準(zhǔn)，放入光刻機中進行曝光。選擇合適的曝光光源，如紫外光（UV），波長為365nm，曝光時間根據(jù)光刻膠的特性和掩模圖案的復(fù)雜程度進行調(diào)整，一般為10-30秒。曝光完成后，將硅片進行后烘，溫度設(shè)置為110-130℃，時間為1-2分鐘，以促進光刻膠的交聯(lián)反應(yīng)。將后烘后的硅片放入顯影液中進行顯影，顯影液選擇與光刻膠匹配的型號，如MF-319顯影液。顯影時間為30-60秒，使曝光區(qū)域的光刻膠溶解，從而在硅片上形成與掩模圖案一致的光刻膠圖案。模塑工藝：模塑是將光刻后的硅片作為模具，復(fù)制出PDMS芯片的過程。將PDMS預(yù)聚物和交聯(lián)劑按照10:1的質(zhì)量比混合均勻，倒入真空干燥箱中進行脫氣處理，以去除混合液中的氣泡。脫氣時間為15-30分鐘，確?；旌弦褐袩o氣泡殘留。將脫氣后的PDMS混合液緩慢倒入光刻后的硅片模具上，使其完全覆蓋模具表面。將裝有PDMS混合液的模具放入烘箱中進行固化，固化溫度設(shè)置為70-80℃，時間為1-2小時，使PDMS交聯(lián)固化，形成具有微結(jié)構(gòu)的PDMS芯片。固化完成后，小心地將PDMS芯片從硅片模具上剝離下來，注意避免損壞芯片的微結(jié)構(gòu)。鍵合工藝：鍵合是將PDMS芯片與玻璃基底或另一層PDMS芯片進行密封連接的過程。將PDMS芯片和玻璃基底（或另一層PDMS芯片）分別放入等離子體清洗機中進行表面處理，處理時間為3-5分鐘，功率為50-100W。等離子體處理能夠使芯片和基底表面產(chǎn)生羥基等活性基團，增強表面的親水性和黏附性。將經(jīng)過等離子體處理的PDMS芯片和玻璃基底（或另一層PDMS芯片）迅速對準(zhǔn)并貼合在一起，施加一定的壓力，使其緊密結(jié)合。在室溫下放置1-2小時，使芯片和基底之間形成牢固的化學(xué)鍵合，完成微流控芯片的制作。在整個芯片制作過程中，需要嚴(yán)格控制環(huán)境溫度、濕度和潔凈度，以確保制作過程的穩(wěn)定性和芯片質(zhì)量。操作人員應(yīng)佩戴潔凈手套和口罩，避免灰塵和雜質(zhì)對芯片制作的影響。在光刻工藝中，要確保掩模圖案與硅片的對準(zhǔn)精度，以及曝光時間和顯影時間的準(zhǔn)確性，否則可能導(dǎo)致芯片微結(jié)構(gòu)的偏差或光刻膠殘留。在模塑工藝中，要注意PDMS預(yù)聚物和交聯(lián)劑的混合比例，以及固化溫度和時間的控制，不合適的參數(shù)可能導(dǎo)致PDMS芯片的硬度、彈性和透明度等性能發(fā)生變化。在鍵合工藝中，等離子體處理的參數(shù)和鍵合壓力的控制也非常關(guān)鍵，不當(dāng)?shù)奶幚砜赡軐?dǎo)致芯片密封性不佳，影響模型的運行。4.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與芯片接種操作細(xì)胞培養(yǎng)和芯片接種是構(gòu)建腸肝系統(tǒng)模型的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響模型的性能和實驗結(jié)果。本研究選用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）和人肝癌細(xì)胞（HepG2）進行培養(yǎng)和接種，具體操作如下：Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中復(fù)蘇Caco-2細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長達到80%-90%融合時，使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）消化液消化細(xì)胞。消化時間為2-3分鐘，待細(xì)胞變圓并脫離瓶壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?-1×10?個/mL，用于后續(xù)的芯片接種。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：同樣從細(xì)胞庫中復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時，用0.25%Trypsin-EDTA消化液消化細(xì)胞，消化時間為2-3分鐘。加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?-1×10?個/mL。芯片接種：在進行芯片接種前，先對微流控芯片進行預(yù)處理。將芯片放入75%乙醇中浸泡30分鐘，然后用無菌PBS沖洗3次，去除乙醇?xì)埩?。將芯片置于超凈工作臺中，用紫外線照射30分鐘進行消毒。使用移液器將適量的細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原蛋白、纖連蛋白等）均勻地涂覆在芯片的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，然后將芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，使細(xì)胞外基質(zhì)充分吸附在芯片表面。孵育完成后，用無菌PBS沖洗芯片3次，去除未吸附的細(xì)胞外基質(zhì)。將調(diào)整好濃度的Caco-2細(xì)胞懸液緩慢注入微流控芯片的上層微通道中，確保細(xì)胞均勻分布在微通道表面。接種完成后，將芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-3小時，使細(xì)胞黏附在芯片表面。將HepG2細(xì)胞懸液緩慢注入微流控芯片的下層微通道中，同樣確保細(xì)胞均勻分布。接種后，將芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-3小時，然后開始緩慢通入培養(yǎng)液，流速控制在0.1-0.5μL/min，以維持細(xì)胞的正常生長和代謝。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)胞污染。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如細(xì)胞形態(tài)、密度和活力等，及時調(diào)整培養(yǎng)條件。在芯片接種過程中，要注意避免產(chǎn)生氣泡，確保細(xì)胞懸液均勻分布在芯片的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域。接種后，要密切關(guān)注細(xì)胞的黏附和生長情況，如有異常應(yīng)及時采取措施進行調(diào)整。4.2.3模型運行與檢測參數(shù)設(shè)置模型運行與檢測參數(shù)的合理設(shè)置是保證腸肝系統(tǒng)模型正常工作和準(zhǔn)確評估模型性能的關(guān)鍵。本研究在模型運行過程中，對流速、溫度、氣體環(huán)境等參數(shù)進行了精確控制，并設(shè)定了一系列檢測指標(biāo)來評估模型中細(xì)胞的活性、代謝功能等，具體參數(shù)設(shè)置如下：模型運行參數(shù)設(shè)置：流速控制：根據(jù)腸道和肝臟的生理流體流速，分別對微流控芯片的上下層微通道進行流速控制。上層模擬腸道的微通道中，培養(yǎng)液的流速設(shè)置為0.5-2μL/min，以模擬腸道內(nèi)食糜的流動速度。下層模擬肝臟血液循環(huán)的微通道中，培養(yǎng)液的流速設(shè)置為0.05-0.2μL/min，接近肝臟內(nèi)肝血竇的血液流速。通過高精度的微泵（如注射泵、蠕動泵等）來實現(xiàn)對流速的精確控制，確保流速的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。溫度控制：將微流控芯片放置在溫度可控的培養(yǎng)平臺上，保持模型運行溫度為37℃，這是人體的正常體溫，有利于維持細(xì)胞的正常生理功能。培養(yǎng)平臺可以采用加熱板、溫控培養(yǎng)箱等設(shè)備，通過溫度傳感器實時監(jiān)測芯片溫度，并反饋調(diào)節(jié)加熱設(shè)備的功率，以保證溫度的恒定。氣體環(huán)境控制：在模型運行過程中，維持5%CO?和95%空氣的氣體環(huán)境。通過氣體混合裝置將CO?和空氣按照一定比例混合后，通入微流控芯片的氣體通道中，確保細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的氣體環(huán)境穩(wěn)定。CO?能夠溶解在培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，使其保持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，為細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境。檢測參數(shù)設(shè)置：細(xì)胞活性檢測：采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的活性。在模型運行的不同時間點，向微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域加入適量的CCK-8試劑，孵育1-2小時。CCK-8試劑中的四唑鹽可以被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙色甲瓚產(chǎn)物，通過酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而評估細(xì)胞的活性。代謝功能檢測：檢測細(xì)胞的代謝產(chǎn)物來評估其代謝功能。對于Caco-2細(xì)胞，檢測其對葡萄糖的攝取和乳酸的分泌。通過高效液相色譜（HPLC）等分析技術(shù)，測定培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸的濃度變化，計算葡萄糖的攝取率和乳酸的分泌率。對于HepG2細(xì)胞，檢測其對藥物的代謝能力。選擇典型的藥物底物，如硝苯地平，加入到培養(yǎng)液中，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，采用HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測藥物及其代謝產(chǎn)物的濃度，評估HepG2細(xì)胞對藥物的代謝轉(zhuǎn)化率?；虮磉_檢測：采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測細(xì)胞中相關(guān)基因的表達水平。提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，利用特異性引物和熒光探針進行qPCR擴增。通過檢測熒光信號的強度，計算目的基因的相對表達量。對于Caco-2細(xì)胞，檢測緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin等）、轉(zhuǎn)運蛋白（如P-gp、SGLT1等）基因的表達水平，評估腸道上皮的屏障功能和轉(zhuǎn)運功能。對于HepG2細(xì)胞，檢測細(xì)胞色素P450酶系（如CYP3A4、CYP2C9等）、白蛋白等基因的表達水平，評估肝臟的代謝和合成功能。在模型運行過程中，要定期對檢測參數(shù)進行監(jiān)測和記錄，及時發(fā)現(xiàn)模型運行中的異常情況，并進行相應(yīng)的調(diào)整。同時，要注意檢測方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，確保檢測結(jié)果的可靠性。例如，在進行CCK-8檢測時，要嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進行，避免操作誤差對結(jié)果的影響。在進行HPLC、HPLC-MS和qPCR等分析時，要對儀器進行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。4.3模型性能驗證與分析4.3.1腸模塊功能驗證為了驗證腸模塊對營養(yǎng)物質(zhì)吸收和屏障功能的模擬效果，對腸模塊中的Caco-2細(xì)胞進行了一系列指標(biāo)的檢測。緊密連接是維持腸道上皮屏障功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其完整性直接影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和對有害物質(zhì)的阻擋能力。通過免疫熒光染色技術(shù)檢測緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin等）的表達和分布情況，評估緊密連接的完整性。實驗結(jié)果顯示，在微流控芯片培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞中，ZO-1和Occludin蛋白呈連續(xù)的線狀分布，緊密圍繞在細(xì)胞邊緣，表明細(xì)胞之間形成了緊密的連接結(jié)構(gòu)。進一步通過檢測跨上皮電阻（TEER）值來量化緊密連接的功能，結(jié)果表明，芯片上Caco-2細(xì)胞單層的TEER值穩(wěn)定在1000-2000Ω?cm2，與文獻報道的小腸上皮細(xì)胞的TEER值范圍相近，說明腸模塊能夠較好地模擬腸道上皮的屏障功能。透過率是評估腸模塊對營養(yǎng)物質(zhì)吸收和物質(zhì)通透能力的重要指標(biāo)。選擇熒光素異硫氰酸酯-右旋糖酐（FITC-Dextran）作為示蹤劑，將其加入到腸模塊的培養(yǎng)液中，通過檢測培養(yǎng)液中FITC-Dextran的濃度變化來計算其透過率。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-Dextran在腸模塊中的透過率隨著時間的延長而逐漸增加，且透過率曲線與文獻報道的小腸對FITC-Dextran的吸收曲線趨勢一致。在培養(yǎng)24小時后，F(xiàn)ITC-Dextran的透過率達到了10%-15%，這表明腸模塊能夠有效地模擬小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收過程。細(xì)胞極性是細(xì)胞正常生理功能的重要體現(xiàn)，對于腸道上皮細(xì)胞而言，極性的維持有助于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運。通過檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物的分布來評估Caco-2細(xì)胞的極性。采用免疫熒光染色技術(shù)檢測堿性磷酸酶（ALP）和蔗糖酶-異麥芽糖酶（SI）的分布情況，這兩種酶是小腸上皮細(xì)胞刷狀緣的特異性標(biāo)記物。實驗結(jié)果顯示，ALP和SI主要分布在Caco-2細(xì)胞的頂端表面，呈現(xiàn)出明顯的極性分布，與小腸上皮細(xì)胞的極性特征相符。通過蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）分析也證實了Caco-2細(xì)胞中ALP和SI的表達水平與正常小腸上皮細(xì)胞相近，進一步說明腸模塊中的Caco-2細(xì)胞具有良好的極性，能夠有效地模擬小腸上皮細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)吸收功能。4.3.2肝模塊功能驗證肝模塊功能的驗證主要通過分析HepG2細(xì)胞的代謝水平和白蛋白分泌等指標(biāo)，來評估其對藥物代謝和解毒功能的模擬能力。代謝水平是反映肝臟功能的重要指標(biāo)之一，通過檢測細(xì)胞內(nèi)的多種代謝酶活性以及代謝產(chǎn)物的生成情況來評估HepG2細(xì)胞的代謝水平。細(xì)胞色素P450酶系在藥物代謝中起著關(guān)鍵作用，采用熒光底物法檢測細(xì)胞色素P4503A4（CYP3A4）和細(xì)胞色素P4502C9（CYP2C9）等主要亞型的活性。實驗結(jié)果表明，在微流控芯片培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，CYP3A4和CYP2C9的活性與文獻報道的正常肝細(xì)胞相當(dāng)。以硝苯地平為底物，檢測其在HepG2細(xì)胞中的代謝轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，硝苯地平在24小時內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化率達到了30%-50%，與體內(nèi)肝臟對硝苯地平的代謝情況相近，表明肝模塊中的HepG2細(xì)胞具有良好的藥物代謝能力。同時，檢測細(xì)胞內(nèi)其他代謝酶的活性，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和過氧化氫酶（CAT）等，以評估細(xì)胞的抗氧化和解毒能力。實驗結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中GST和CAT的活性均處于正常水平，表明細(xì)胞具有較強的抗氧化和解毒能力。通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平來進一步驗證細(xì)胞的抗氧化能力，結(jié)果表明，在受到氧化應(yīng)激刺激時，HepG2細(xì)胞能夠有效地清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。白蛋白是肝臟合成的一種重要血漿蛋白，其分泌水平是評估肝臟合成功能的重要指標(biāo)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測培養(yǎng)液中白蛋白的含量，以評估HepG2細(xì)胞的白蛋白分泌能力。實驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中，HepG2細(xì)胞持續(xù)分泌白蛋白，且分泌量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。在培養(yǎng)72小時后，白蛋白的分泌量達到了10-20μg/(10?cells?24h)，與文獻報道的正常肝細(xì)胞白蛋白分泌水平相近，說明肝模塊中的HepG2細(xì)胞能夠較好地模擬肝臟的合成功能。通過對肝模塊中HepG2細(xì)胞的代謝水平和白蛋白分泌等指標(biāo)的檢測，證明了該肝模塊能夠有效地模擬肝臟對藥物的代謝和解毒功能，以及肝臟的合成功能，為后續(xù)研究藥物在肝內(nèi)的代謝過程和肝相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供了可靠的模型。4.3.3整體模型的有效性評估為了驗證整體模型對腸肝系統(tǒng)生理功能的模擬準(zhǔn)確性，觀察了藥物在模型中的代謝過程和對細(xì)胞的影響。選擇典型藥物對乙酰氨基酚作為研究對象，將其加入到腸模塊的培養(yǎng)液中，觀察藥物在腸肝系統(tǒng)模型中的吸收、代謝和排泄過程。在藥物吸收階段，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測腸模塊培養(yǎng)液中對乙酰氨基酚的濃度變化，以評估腸道對藥物的吸收情況。實驗結(jié)果顯示，對乙