miR-30與lincRNA-p21：肝纖維化調(diào)控機(jī)制的深度解析一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體最大的實(shí)質(zhì)性臟器，承擔(dān)著物質(zhì)代謝、解毒、分泌等多種關(guān)鍵功能，素有“物質(zhì)代謝中樞”“人體內(nèi)最大的化工廠”和“清潔器”等美譽(yù)。然而，肝臟也極易受到各種損肝因素的侵襲，如病毒感染、酗酒、脂代謝異常、藥物副作用以及自身免疫紊亂等。一旦肝臟遭受這些因素的損害，便會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)物質(zhì)代謝出現(xiàn)障礙，嚴(yán)重影響身體的各項(xiàng)功能。倘若炎癥持續(xù)發(fā)展，肝臟疾病將會(huì)逐步惡化，最終可能演變?yōu)楦斡不?、肝纖維化甚至肝癌。肝纖維化是一種由多種慢性肝病發(fā)展而來的病理過程，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積。肝纖維化并非一種獨(dú)立的疾病，而是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間階段。正常情況下，肝臟內(nèi)的ECM合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)肝臟受到長(zhǎng)期的損傷刺激時(shí)，這種平衡被打破，ECM合成增加，而降解減少，導(dǎo)致過多的ECM在肝臟內(nèi)堆積，逐漸形成纖維化。肝纖維化的危害不容小覷。隨著纖維化程度的加重，肝臟的正常結(jié)構(gòu)被破壞，假小葉形成，肝臟的正常功能受到嚴(yán)重影響。肝細(xì)胞會(huì)因缺氧、變性而壞死，進(jìn)一步加劇肝纖維化的發(fā)展，形成惡性循環(huán)。若肝纖維化得不到及時(shí)有效的治療，最終將發(fā)展為肝硬化，導(dǎo)致肝功能逐漸喪失。肝硬化患者常伴有門靜脈高壓，可引發(fā)脾腫大、腹水生成以及胃底食管靜脈曲張等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至有上消化道曲張靜脈破裂出血的潛在危險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。此外，肝纖維化患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加。近年來，肝臟疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)慢性肝病患者數(shù)量眾多，且每年新增病例數(shù)不斷攀升。在中國(guó)，乙肝、丙肝等病毒性肝炎的感染率較高，這些患者若得不到及時(shí)有效的治療，很容易發(fā)展為肝纖維化和肝硬化。此外，隨著生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率也在不斷上升，逐漸成為導(dǎo)致肝纖維化的重要原因之一。由于肝臟疾病發(fā)病誘因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前的治愈率仍不夠理想。因此，深入研究肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療靶點(diǎn)和藥物，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要課題。在肝臟疾病的研究中，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）逐漸成為研究熱點(diǎn)。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與了眾多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，多種miRNA在肝纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，它們可以通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化、增殖和凋亡，以及ECM的合成與降解等途徑，影響肝纖維化的進(jìn)程。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，缺乏特異完整的開放閱讀框，不具備蛋白質(zhì)編碼功能。lncRNA具有較高的組織器官特異性和較低的序列保守性，可以通過多種機(jī)制在不同水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA廣泛參與了肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，在肝癌、肝纖維化、肝硬化等疾病中發(fā)揮著重要作用。它們可以作為分子海綿吸附miRNA，調(diào)節(jié)miRNA的活性；也可以與蛋白質(zhì)相互作用，影響蛋白質(zhì)的功能；還可以通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和剪接等過程，參與肝臟疾病的病理生理過程。miR-30作為miRNA家族的重要成員，已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在肝纖維化領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)miR-30在肝纖維化患者和動(dòng)物模型中表達(dá)顯著下調(diào)。miR-30可以通過直接靶向KLF11mRNA，抑制其表達(dá)，從而調(diào)控TGFβ/Smad信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制HSC的活化，減少ECM的合成，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。此外，miR-30還可以通過抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，改善肝纖維化。lincRNA-p21作為一種重要的lncRNA，也在肝纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，在肝纖維化期間，肝細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的水平顯著增加。lincRNA-p21可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA），與miR-30相互作用，調(diào)節(jié)miR-30的可用性。這種相互作用被反饋環(huán)所增強(qiáng)，lincRNA-p21作為TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)器，加強(qiáng)TGF-β信號(hào)，介導(dǎo)其通過與miR-30相互作用促進(jìn)肝纖維化的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，敲除肝細(xì)胞lincRNA-p21可大大降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥。綜上所述，深入研究miR-30和lincRNA-p21在肝纖維化中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論意義。這一研究有望為肝纖維化的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。通過調(diào)控miR-30和lincRNA-p21的表達(dá)，可能開發(fā)出新型的抗肝纖維化藥物，為廣大肝纖維化患者帶來福音。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，尤其是在miR-30和lincRNA-p21與肝纖維化關(guān)系的研究方面取得了一定進(jìn)展。在miR-30與肝纖維化的研究中，國(guó)內(nèi)外眾多研究均表明miR-30在肝纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過對(duì)肝纖維化患者的臨床樣本檢測(cè)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-30在肝纖維化患者的肝臟組織和血清中表達(dá)顯著下調(diào)，且其表達(dá)水平與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。在一項(xiàng)針對(duì)乙肝相關(guān)性肝纖維化患者的研究中，檢測(cè)了不同纖維化分期患者血清中miR-30的含量，結(jié)果顯示隨著纖維化程度的加重，miR-30的表達(dá)逐漸降低。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-30可以抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成，其作用機(jī)制主要是通過直接靶向KLF11mRNA，抑制其表達(dá)，從而調(diào)控TGFβ/Smad信號(hào)通路的傳導(dǎo)。這一研究結(jié)果與國(guó)外學(xué)者的研究成果相互印證，國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)通過基因敲除和過表達(dá)技術(shù)，在小鼠肝纖維化模型中證實(shí)了miR-30對(duì)肝纖維化的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)miR-30還可以通過抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，改善肝纖維化。在lincRNA-p21與肝纖維化的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也取得了重要成果。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化期間，肝細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的水平顯著增加。國(guó)外一項(xiàng)研究從CCl4誘導(dǎo)的纖維化肝臟中分離肝細(xì)胞，檢測(cè)到lincRNA-p21表達(dá)上調(diào)，且這種增加與miR-30的喪失相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，lincRNA-p21通過作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)節(jié)miR-30的可用性，其作為TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)器，加強(qiáng)TGF-β信號(hào)，介導(dǎo)其通過與miR-30相互作用促進(jìn)肝纖維化的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，敲除肝細(xì)胞lincRNA-p21可大大降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21在肝纖維化進(jìn)程中參與了多條信號(hào)通路的調(diào)控，影響HSC的生物學(xué)行為，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。盡管國(guó)內(nèi)外在miR-30和lincRNA-p21與肝纖維化關(guān)系的研究方面取得了上述成果，但目前仍存在一些不足之處。一方面，對(duì)于miR-30和lincRNA-p21在肝纖維化中的作用機(jī)制研究還不夠全面和深入。雖然已經(jīng)明確了它們?cè)谀承┬盘?hào)通路中的關(guān)鍵作用，但對(duì)于它們與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及在不同細(xì)胞類型中的具體功能差異，還需要進(jìn)一步探索。例如，miR-30除了靶向KLF11和調(diào)節(jié)Beclin1介導(dǎo)的自噬外，是否還存在其他重要的靶基因和作用途徑，目前尚不清楚。另一方面，將miR-30和lincRNA-p21作為治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床治療肝纖維化，還面臨著諸多挑戰(zhàn)。如何高效、安全地將其導(dǎo)入體內(nèi)，以及如何避免可能出現(xiàn)的副作用和免疫反應(yīng)等問題，都需要進(jìn)一步研究解決。1.3研究目標(biāo)與方法本研究旨在深入探究miR-30和lincRNA-p21在肝纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制，為肝纖維化的診斷和治療提供新的理論依據(jù)與潛在靶點(diǎn)。具體研究目標(biāo)如下：明確miR-30和lincRNA-p21在肝纖維化動(dòng)物模型和臨床樣本中的表達(dá)變化規(guī)律，分析其表達(dá)水平與肝纖維化程度的相關(guān)性。深入解析miR-30通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC）活化、增殖、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解的影響機(jī)制。揭示lincRNA-p21作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）與miR-30相互作用的分子機(jī)制，以及這種相互作用對(duì)TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控作用，進(jìn)而明確其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。探索以miR-30和lincRNA-p21為靶點(diǎn)，進(jìn)行肝纖維化治療的潛在可能性，為開發(fā)新型抗肝纖維化藥物提供理論支持。為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究擬采用以下研究方法：文獻(xiàn)研究法：全面檢索國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-30、lincRNA-p21與肝纖維化相關(guān)的文獻(xiàn)資料，包括學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、研究報(bào)告等。對(duì)這些文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)梳理和分析，了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)以及存在的問題，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。通過文獻(xiàn)研究，總結(jié)已有的研究成果，明確尚未解決的科學(xué)問題，從而確定本研究的切入點(diǎn)和重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。實(shí)驗(yàn)法：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞系，如HSC-T6細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染miR-30模擬物、抑制劑以及l(fā)incRNA-p21過表達(dá)載體、干擾RNA等，改變細(xì)胞中miR-30和lincRNA-p21的表達(dá)水平。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率以及相關(guān)基因的表達(dá)變化；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)）等方法，研究miR-30和lincRNA-p21對(duì)HSC生物學(xué)行為的影響。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-30與靶基因之間的靶向關(guān)系，以及l(fā)incRNA-p21與miR-30的相互作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型，如采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、miR-30干預(yù)組、lincRNA-p21干預(yù)組等。通過腹腔注射、尾靜脈注射等方式給予相應(yīng)的干預(yù)措施，如注射miR-30激動(dòng)劑、lincRNA-p21抑制劑等。在實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，處死動(dòng)物，采集肝臟組織和血清樣本。運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)肝臟組織中miR-30、lincRNA-p21及相關(guān)基因的表達(dá)；通過組織病理學(xué)分析（如HE染色、Masson染色）觀察肝臟組織的病理變化，評(píng)估肝纖維化程度；采用生化指標(biāo)檢測(cè)（如血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、羥脯氨酸含量等）評(píng)估肝臟功能和纖維化程度。生物信息學(xué)分析：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，如TargetScan、miRDB、StarBase等，預(yù)測(cè)miR-30的潛在靶基因以及l(fā)incRNA-p21與miR-30的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析和篩選，選取可能性較高的靶基因和結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建miR-30和lincRNA-p21的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入了解它們?cè)诟卫w維化中的作用機(jī)制和信號(hào)通路。二、肝纖維化相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝纖維化概述肝纖維化是一種由多種慢性肝病引發(fā)的病理過程，其本質(zhì)是肝臟對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。正常肝臟組織中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解維持著動(dòng)態(tài)平衡，以保障肝臟的正常結(jié)構(gòu)與功能。然而，當(dāng)肝臟遭受長(zhǎng)期、持續(xù)性的損傷，如病毒感染（如乙肝病毒、丙肝病毒）、酗酒、非酒精性脂肪性肝病、藥物性肝損傷以及自身免疫性肝病等因素的刺激時(shí)，這一平衡被打破，肝臟內(nèi)纖維組織出現(xiàn)異常增生，導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)過度沉積，進(jìn)而引發(fā)肝纖維化。從病理學(xué)角度來看，肝纖維化表現(xiàn)為肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，纖維間隔形成，肝臟的正常小葉結(jié)構(gòu)被破壞。這種病理變化不僅影響肝臟的正常形態(tài)，還會(huì)干擾肝臟的血液供應(yīng)和物質(zhì)代謝等功能，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的關(guān)鍵階段。肝纖維化在癥狀表現(xiàn)上具有多樣性，且早期癥狀往往不典型，容易被忽視。部分患者在疾病早期可能無明顯自覺癥狀，僅在體檢或因其他疾病進(jìn)行檢查時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。隨著病情的進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)一系列非特異性癥狀。例如，全身癥狀方面，常見的有乏力，這是由于肝臟功能受損，影響了能量代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成，導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足。消化系統(tǒng)癥狀也較為突出，患者常出現(xiàn)食欲不振，對(duì)食物缺乏興趣，進(jìn)食量減少，有時(shí)還會(huì)伴有惡心、嘔吐等癥狀，這主要是因?yàn)楦闻K病變影響了胃腸道的消化和吸收功能。此外，患者還可能出現(xiàn)腹脹、便秘或腹瀉等消化不良癥狀，以及肝區(qū)隱痛不適，疼痛程度不一，可為間歇性或持續(xù)性，多與肝臟炎癥、肝包膜張力增加等因素有關(guān)。在出血傾向方面，患者可能出現(xiàn)鼻出血、牙齦出血、皮膚黏膜出現(xiàn)紫斑或出血點(diǎn)等癥狀，女性患者還可能出現(xiàn)月經(jīng)過多的情況，這是由于肝臟合成凝血因子的能力下降，以及脾功能亢進(jìn)導(dǎo)致血小板減少等原因所致。目前，臨床上對(duì)于肝纖維化的診斷主要依賴于多種方法的綜合應(yīng)用。肝穿刺活組織檢查被公認(rèn)為是診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”。通過肝穿刺獲取肝臟組織標(biāo)本，在顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，能夠直接評(píng)估肝臟纖維化的程度、范圍以及肝臟組織的病理變化，如纖維組織增生情況、肝細(xì)胞壞死程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，為肝纖維化的診斷和分期提供最為準(zhǔn)確的依據(jù)。然而，肝穿刺活組織檢查屬于有創(chuàng)檢查，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如出血、感染、疼痛等，患者的接受度相對(duì)較低，且由于肝臟病變的不均勻性，可能存在取樣誤差，難以進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和反復(fù)取材。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)也是常用的診斷方法之一。通過檢測(cè)血液中與肝纖維化相關(guān)的標(biāo)志物，如Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）等，可以間接反映肝臟纖維化的程度。這些標(biāo)志物在肝臟纖維化過程中，其血清含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。例如，PⅢP主要反映肝臟內(nèi)膠原的合成情況，在肝纖維化早期，其血清水平會(huì)明顯升高；CⅣ參與肝臟基底膜的構(gòu)成，在肝纖維化時(shí)，其合成和降解均增加，血清含量也隨之升高；LN是基底膜的主要成分之一，在肝纖維化時(shí)，其血清含量也會(huì)升高，且與肝纖維化的程度呈正相關(guān)；HA是一種糖胺聚糖，主要由肝內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞合成，在肝纖維化時(shí)，其血清水平顯著升高，可作為反映肝纖維化程度和肝臟受損程度的重要指標(biāo)。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)具有取材方便、價(jià)格相對(duì)低廉、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但這些指標(biāo)的特異性和敏感性有限，容易受到肝臟炎癥、其他疾病等因素的影響，單獨(dú)使用時(shí)診斷準(zhǔn)確性相對(duì)較低，通常需要結(jié)合其他檢查方法進(jìn)行綜合判斷。影像學(xué)檢查在肝纖維化診斷中也發(fā)揮著重要作用。其中，瞬時(shí)彈性成像（TE）技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，該技術(shù)通過超聲探頭向肝臟發(fā)射剪切波，測(cè)量肝臟組織的硬度，從而間接評(píng)估肝纖維化的程度。肝臟硬度值與肝纖維化程度呈正相關(guān)，一般來說，肝臟硬度值越高，提示肝纖維化程度越嚴(yán)重。TE技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、無創(chuàng)、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠在一定程度上反映肝纖維化的進(jìn)展情況，對(duì)于篩查和監(jiān)測(cè)肝纖維化具有重要價(jià)值。然而，TE技術(shù)也存在一定的局限性，如肥胖、腹水、肋間隙狹窄等因素可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且對(duì)于輕度肝纖維化的診斷效能相對(duì)較低。此外，聲輻射力脈沖成像/點(diǎn)剪切波彈性成像（ARFI/SWE）、二維剪切波彈性成像（2D-SWE）和磁共振彈性成像（MRE）等影像學(xué)技術(shù)也可用于評(píng)估肝纖維化，它們各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和適用范圍，但同樣也存在一定的局限性。B超檢查可以觀察肝臟的形態(tài)、大小、回聲等情況，對(duì)于肝纖維化的診斷具有一定的提示作用。在肝纖維化時(shí)，B超圖像可能顯示肝臟回聲增粗、增強(qiáng)，分布不均勻，血管紋理欠清晰等，但這些表現(xiàn)缺乏特異性，不能單獨(dú)作為診斷肝纖維化的依據(jù)，通常需要結(jié)合其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析。2.2肝纖維化發(fā)病機(jī)制肝纖維化的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子的參與，以及多條信號(hào)通路的激活與調(diào)控。其中，肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化被公認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要儲(chǔ)存維生素A，并參與肝臟的脂質(zhì)代謝和維持肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，當(dāng)肝臟受到持續(xù)損傷時(shí)，HSC會(huì)被激活，發(fā)生一系列生物學(xué)行為的改變。在肝臟損傷過程中，多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)被釋放，這些物質(zhì)成為激活HSC的重要信號(hào)。例如，受損的肝細(xì)胞會(huì)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），這是一種在肝纖維化進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子。TGF-β通過與HSC表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)HSC的活化。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）也是激活HSC的重要因子之一，它主要由血小板、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞分泌。當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，這些細(xì)胞聚集在損傷部位并釋放PDGF，PDGF與HSC表面的特異性受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶活性，引發(fā)一系列下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，促使HSC從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。此外，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等炎癥因子也在HSC活化過程中發(fā)揮重要作用，它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，增強(qiáng)HSC對(duì)其他刺激的敏感性，協(xié)同促進(jìn)HSC的活化。一旦HSC被激活，其生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生顯著變化?；罨腍SC失去儲(chǔ)存維生素A的能力，形態(tài)上從靜止時(shí)的富含脂質(zhì)小滴的星狀形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑〕衫w維細(xì)胞樣特征的梭形形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲增多，使其具備更強(qiáng)的增殖和收縮能力。在功能方面，活化的HSC大量表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），這是HSC活化的標(biāo)志性蛋白，它賦予HSC收縮功能，導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化，影響肝臟的血液循環(huán)和物質(zhì)交換。同時(shí)，活化的HSC還會(huì)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，如膠原蛋白（包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原等）、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，這些ECM成分在肝臟內(nèi)過度沉積，逐漸取代正常的肝臟組織，導(dǎo)致肝臟纖維化的形成。細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡也是肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。正常肝臟中，ECM的合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這一平衡主要由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）共同維持。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解各種ECM成分，在肝臟中，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等參與了正常肝臟ECM的更新和代謝。例如，MMP-2主要負(fù)責(zé)降解Ⅳ型膠原，這是基底膜的重要組成成分，MMP-2的正?；钚詫?duì)于維持肝臟基底膜的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定至關(guān)重要。而TIMPs則通過與MMPs特異性結(jié)合，抑制MMPs的活性，從而調(diào)節(jié)ECM的降解速度。在肝纖維化過程中，這種平衡被打破，一方面，活化的HSC分泌大量的ECM成分，導(dǎo)致合成增加；另一方面，TIMPs的表達(dá)上調(diào)，MMPs的活性受到抑制，使得ECM的降解減少。研究表明，在肝纖維化動(dòng)物模型和患者肝臟組織中，TIMPs的表達(dá)水平明顯升高，尤其是TIMP-1和TIMP-2，它們與MMPs的比例失衡，使得MMPs無法有效降解過度沉積的ECM，進(jìn)一步加劇了肝纖維化的發(fā)展。TGF-β信號(hào)通路在肝纖維化進(jìn)程中起著核心的調(diào)控作用。TGF-β主要由活化的HSC、Kupffer細(xì)胞、血小板等細(xì)胞分泌，以無活性的前體形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。當(dāng)受到特定刺激時(shí)，TGF-β被激活，與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。TGF-β受體主要包括Ⅰ型受體（TβRI）和Ⅱ型受體（TβRII），TGF-β首先與TβRII結(jié)合，形成TGF-β/TβRII復(fù)合物，然后招募并磷酸化TβRI，激活的TβRI進(jìn)一步磷酸化下游的Smad蛋白。Smad蛋白家族主要包括受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad，如Smad2和Smad3）、共同通路型Smad（Co-Smad，如Smad4）和抑制型Smad（I-Smad，如Smad7）。在TGF-β信號(hào)通路中，磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括編碼ECM成分（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等）的基因，以及調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的基因。例如，TGF-β/Smad信號(hào)通路可以上調(diào)α-SMA的表達(dá)，促進(jìn)HSC的活化和轉(zhuǎn)分化；同時(shí)，增加Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成，導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)過度沉積。此外，TGF-β還可以通過激活其他信號(hào)通路，如p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等，間接調(diào)節(jié)HSC的生物學(xué)行為和ECM的代謝，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。三、miR-30調(diào)控肝纖維化機(jī)制研究3.1miR-30概述miR-30屬于微小核糖核酸（microRNA，miRNA）家族，是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，長(zhǎng)度通常在20-24個(gè)核苷酸左右。其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)獨(dú)特的特征，成熟的miR-30具有高度保守的種子序列，一般位于5'端的第2-8個(gè)核苷酸位置，這段種子序列在識(shí)別并結(jié)合靶mRNA過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，決定了miR-30對(duì)靶基因的特異性調(diào)控。在不同物種間，miR-30的種子序列具有較高的同源性，這反映了其在生物進(jìn)化過程中的保守性和重要功能。除種子序列外，miR-30的其余核苷酸序列在不同成員間存在一定差異，這種差異賦予了miR-30家族成員各自獨(dú)特的生物學(xué)功能，使其能夠參與調(diào)控不同的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。miR-30的生成過程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和酶的參與。其編碼基因首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有較長(zhǎng)的核苷酸序列，且包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。以人源miR-30基因轉(zhuǎn)錄為例，其pri-miRNA可能包含數(shù)百甚至上千個(gè)核苷酸，形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中莖環(huán)部分是后續(xù)加工的關(guān)鍵區(qū)域。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA被Drosha-DGCR8復(fù)合物識(shí)別并切割，該復(fù)合物中的Drosha是一種RNaseⅢ酶，它能夠特異性地切割pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其加工成約70-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA同樣具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形似發(fā)夾狀，這一結(jié)構(gòu)特征對(duì)于其后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)和進(jìn)一步加工至關(guān)重要。生成的pre-miRNA在Exportin-5和Ran-GTP的協(xié)助下，通過核孔從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種RNaseⅢ酶Dicer識(shí)別并切割，Dicer能夠精確地切除pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩端的多余核苷酸，最終生成成熟的雙鏈miR-30。隨后，雙鏈miR-30中的一條鏈被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，這條鏈即為具有生物學(xué)活性的引導(dǎo)鏈（guidestrand），而另一條鏈則被降解。miR-30發(fā)揮生物學(xué)作用主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。當(dāng)miR-30與靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的核酸內(nèi)切酶活性被激活，如同“分子剪刀”一般，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而無法進(jìn)行翻譯過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的抑制。例如，在某些細(xì)胞生理過程中，miR-30a通過與特定靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)，精準(zhǔn)識(shí)別并引導(dǎo)RISC復(fù)合物對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，使得該靶mRNA迅速降解，相應(yīng)的蛋白質(zhì)無法合成，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。而當(dāng)miR-30與靶mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，雖然不會(huì)引起靶mRNA的切割，但會(huì)阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)，抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始或延伸過程，同樣達(dá)到抑制基因表達(dá)的效果。這種不完全互補(bǔ)配對(duì)的調(diào)控方式更為常見，使得miR-30能夠同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，參與復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。除了對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控外，miR-30還可以通過調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等非編碼RNA的表達(dá)和功能，間接影響基因的表達(dá)和生物學(xué)過程，進(jìn)一步拓展了其在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用范圍。3.2miR-30在肝纖維化中的表達(dá)變化為深入探究miR-30在肝纖維化進(jìn)程中的作用，本研究首先通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床樣本分析，對(duì)肝纖維化過程中miR-30的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選用健康雄性C57BL/6小鼠，體重20-22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肝纖維化模型組。肝纖維化模型組采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)法構(gòu)建肝纖維化模型，具體方法為：將CCl4與橄欖油按1:4的體積比混合，配制成20%的CCl4溶液，通過腹腔注射的方式給予小鼠，劑量為5mL/kg體重，每周注射2次，持續(xù)8周。正常對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的橄欖油。在實(shí)驗(yàn)第0、2、4、6、8周，分別從兩組小鼠中隨機(jī)選取5只，采集肝臟組織樣本。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平。提取肝臟組織總RNA時(shí)，采用Trizol試劑法，嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，確保RNA的完整性和純度。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒為[具體品牌和型號(hào)]，反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒推薦參數(shù)設(shè)置。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，選用的引物序列為：miR-30上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中，miR-30呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。隨著CCl4誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平逐漸降低。在誘導(dǎo)第2周時(shí)，miR-30的表達(dá)水平開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與正常對(duì)照組相比，差異尚未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。到誘導(dǎo)第4周時(shí)，miR-30的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，這種下降趨勢(shì)更為明顯。在誘導(dǎo)第8周時(shí)，miR-30的表達(dá)水平降至最低，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，miR-30的表達(dá)水平與肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，隨著肝纖維化程度的加重，miR-30的表達(dá)逐漸下調(diào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30在肝纖維化中的表達(dá)變化，本研究還收集了臨床肝纖維化患者的肝臟組織樣本和血清樣本。患者組共納入30例肝纖維化患者，其中男性18例，女性12例，年齡范圍為35-65歲，平均年齡（48.5±8.2）歲。所有患者均經(jīng)肝穿刺活組織檢查確診為肝纖維化，且排除了其他肝臟疾病和全身性疾病。對(duì)照組選取15例健康志愿者，男性9例，女性6例，年齡范圍為30-60歲，平均年齡（45.8±7.5）歲。采集患者和健康志愿者的空腹靜脈血5mL，分離血清后，保存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，在患者進(jìn)行肝穿刺活檢時(shí)，獲取少量肝臟組織樣本，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平，檢測(cè)方法與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。結(jié)果顯示，肝纖維化患者肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組（P<0.01）。進(jìn)一步分析miR-30的表達(dá)水平與肝纖維化程度的相關(guān)性，根據(jù)肝穿刺活組織檢查結(jié)果，將肝纖維化患者分為輕度、中度和重度纖維化三組。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，miR-30的表達(dá)水平逐漸降低，輕度纖維化組miR-30的表達(dá)水平高于中度纖維化組（P<0.05），中度纖維化組miR-30的表達(dá)水平高于重度纖維化組（P<0.05），表明miR-30的表達(dá)水平與肝纖維化程度呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，運(yùn)用莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)血清中miR-30的表達(dá)水平。首先，采用miRNeasySerum/PlasmaKit試劑盒提取血清中的總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，確保RNA的回收率和純度。然后，使用莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，莖環(huán)引物序列為5'-[具體序列]-3'。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16℃30min，42℃30min，85℃5min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列與肝臟組織檢測(cè)時(shí)相同。實(shí)驗(yàn)同樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果表明，肝纖維化患者血清中miR-30的表達(dá)水平也顯著低于健康對(duì)照組（P<0.01），且與肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-30在肝纖維化患者體內(nèi)的表達(dá)下調(diào)。綜上所述，無論是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，還是在臨床肝纖維化患者中，miR-30的表達(dá)水平均隨著肝纖維化程度的加重而顯著下調(diào)，提示miR-30可能在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。3.3miR-30調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制3.3.1靶向KLF11抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)為深入探究miR-30調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)分析工具，如TargetScan、miRDB和PicTar等，對(duì)miR-30的潛在靶基因進(jìn)行了全面預(yù)測(cè)。在眾多預(yù)測(cè)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)Krüppel樣因子11（KLF11）的mRNA3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在與miR-30種子序列高度互補(bǔ)的區(qū)域，提示KLF11可能是miR-30的潛在靶基因。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究開展了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。首先，人工合成包含KLF11mRNA3'UTR野生型序列（wt-KLF11-3'UTR）和突變型序列（mut-KLF11-3'UTR，將miR-30與KLF11結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將這兩種載體分別與miR-30模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和wt-KLF11-3'UTR載體的細(xì)胞，其熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和mut-KLF11-3'UTR載體的細(xì)胞，熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。這一結(jié)果明確證實(shí)了miR-30能夠與KLF11mRNA的3'UTR特異性結(jié)合，從而直接靶向調(diào)控KLF11的表達(dá)。在明確miR-30與KLF11的靶向關(guān)系后，進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路的影響。在體外培養(yǎng)的小鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）中，分別轉(zhuǎn)染miR-30mimics、miR-30抑制劑（inhibitor）和相應(yīng)對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)KLF11mRNA的表達(dá)水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)KLF11蛋白以及TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵分子Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-30mimics的HSC-T6細(xì)胞中，KLF11mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），同時(shí)p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平也明顯下降（P<0.05），而Smad2和Smad3的總蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）；相反，轉(zhuǎn)染miR-30inhibitor的細(xì)胞中，KLF11mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平也相應(yīng)升高（P<0.05）。這表明miR-30通過靶向抑制KLF11的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β信號(hào)通路中Smad2和Smad3的磷酸化，阻斷了TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、miR-30agomir組和miR-30antagomir組。miR-30agomir組小鼠通過尾靜脈注射miR-30agomir（一種經(jīng)過化學(xué)修飾的miR-30激動(dòng)劑，能夠增強(qiáng)體內(nèi)miR-30的活性），miR-30antagomir組小鼠注射miR-30antagomir（miR-30拮抗劑，可抑制體內(nèi)miR-30的功能），正常對(duì)照組和模型組小鼠注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射4周后，處死小鼠，采集肝臟組織樣本。通過qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，miR-30agomir組小鼠肝臟組織中KLF11的表達(dá)水平顯著降低，p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平也明顯下降；而miR-30antagomir組小鼠肝臟組織中KLF11的表達(dá)水平顯著升高，p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平相應(yīng)升高。同時(shí)，通過組織病理學(xué)分析（如Masson染色）發(fā)現(xiàn)，miR-30agomir組小鼠肝臟纖維化程度明顯減輕，膠原纖維沉積減少；而miR-30antagomir組小鼠肝臟纖維化程度加重，膠原纖維大量沉積。綜上所述，miR-30能夠通過直接靶向KLF11mRNA的3'UTR，抑制KLF11的表達(dá)，進(jìn)而阻斷TGF-β信號(hào)通路中Smad2和Smad3的磷酸化，抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。3.3.2抑制肝星狀細(xì)胞自噬自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的自我降解和再循環(huán)過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、應(yīng)對(duì)應(yīng)激等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞（HSC）的自噬異常激活，被認(rèn)為是促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的重要因素之一。本研究旨在探討miR-30對(duì)HSC自噬的調(diào)控作用及其在肝纖維化中的意義。在體外實(shí)驗(yàn)中，選用小鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6作為研究對(duì)象。首先，將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-30mimics組和miR-30inhibitor組。miR-30mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30模擬物，以提高細(xì)胞內(nèi)miR-30的表達(dá)水平；miR-30inhibitor組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30抑制劑，降低細(xì)胞內(nèi)miR-30的表達(dá)；對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表達(dá)水平。LC3-Ⅱ是自噬小體膜的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平與自噬活性呈正相關(guān)；p62是一種自噬底物蛋白，在自噬過程中被降解，其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-30mimics組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著降低（P<0.05），p62的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），表明miR-30過表達(dá)能夠抑制HSC-T6細(xì)胞的自噬活性；而在miR-30inhibitor組中，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著升高（P<0.05），p62的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），說明抑制miR-30的表達(dá)可促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的自噬。為進(jìn)一步直觀觀察miR-30對(duì)HSC自噬的影響，本研究采用了串聯(lián)mRFP-GFP-LC3熒光顯微鏡分析技術(shù)。將mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中，該質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的融合蛋白mRFP-GFP-LC3能夠標(biāo)記自噬小體。在正常情況下，自噬小體形成后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，此時(shí)由于酸性環(huán)境的作用，GFP熒光會(huì)淬滅，而mRFP熒光則不受影響。因此，通過觀察細(xì)胞內(nèi)黃色熒光（代表自噬小體，mRFP和GFP熒光疊加）和紅色熒光（代表自噬溶酶體，僅mRFP熒光）的比例，可判斷自噬流的情況。結(jié)果顯示，miR-30mimics組細(xì)胞中黃色熒光點(diǎn)的數(shù)量明顯減少，紅色熒光點(diǎn)的數(shù)量相對(duì)增加，表明自噬小體與溶酶體的融合增加，自噬流增強(qiáng)，即自噬活性受到抑制；而在miR-30inhibitor組中，黃色熒光點(diǎn)的數(shù)量顯著增加，紅色熒光點(diǎn)的數(shù)量相對(duì)減少，說明自噬小體與溶酶體的融合減少，自噬流受阻，自噬活性增強(qiáng)。為深入探究miR-30抑制HSC自噬的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Beclin1可能是miR-30的潛在靶基因。Beclin1是自噬起始的關(guān)鍵蛋白，在自噬體的形成過程中發(fā)揮著重要作用。為驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建包含Beclin1mRNA3'非翻譯區(qū)（3'UTR）野生型序列（wt-Beclin1-3'UTR）和突變型序列（mut-Beclin1-3'UTR，將miR-30與Beclin1結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將這兩種載體分別與miR-30mimics或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和wt-Beclin1-3'UTR載體的細(xì)胞，其熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和mut-Beclin1-3'UTR載體的細(xì)胞，熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。這表明miR-30能夠與Beclin1mRNA的3'UTR特異性結(jié)合，直接靶向抑制Beclin1的表達(dá)。進(jìn)一步通過Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-30mimics組細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而miR-30inhibitor組細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），證實(shí)了miR-30對(duì)Beclin1表達(dá)的調(diào)控作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用膽總管結(jié)扎（BDL）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、miR-30agomir組和miR-30antagomir組。miR-30agomir組小鼠通過尾靜脈注射miR-30agomir，miR-30antagomir組小鼠注射miR-30antagomir，正常對(duì)照組和模型組小鼠注射等量的生理鹽水。術(shù)后2周，處死小鼠，采集肝臟組織樣本。通過免疫組化檢測(cè)肝臟組織中LC3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與模型組相比，miR-30agomir組小鼠肝臟組織中LC3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá)水平顯著降低；而miR-30antagomir組小鼠肝臟組織中LC3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，通過Masson染色觀察肝臟組織纖維化程度，發(fā)現(xiàn)miR-30agomir組小鼠肝臟纖維化程度明顯減輕，膠原纖維沉積減少；而miR-30antagomir組小鼠肝臟纖維化程度加重，膠原纖維大量沉積。綜上所述，miR-30能夠通過直接靶向Beclin1，抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞的自噬活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，改善肝纖維化。這一研究結(jié)果為深入理解肝纖維化的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要的理論依據(jù)。3.3.3其他潛在調(diào)控機(jī)制除了靶向KLF11抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)以及抑制肝星狀細(xì)胞自噬這兩個(gè)主要的調(diào)控機(jī)制外，miR-30在調(diào)控肝纖維化過程中可能還存在其他潛在的作用機(jī)制。通過對(duì)相關(guān)研究文獻(xiàn)的深入分析以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究推測(cè)miR-30可能通過以下幾種方式參與肝纖維化的調(diào)控。有研究表明，miR-30可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來影響肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖和活化。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，在肝纖維化過程中，HSC的異常增殖和活化是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的重要原因之一。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用體外培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-30模擬物（mimics）和陰性對(duì)照（NC），48小時(shí)后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-30mimics組細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05），表明miR-30過表達(dá)能夠抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-30mimics組細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制CDK4與CyclinD1的結(jié)合，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。這一結(jié)果提示miR-30可能通過上調(diào)p21的表達(dá)，下調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，阻滯HSC的細(xì)胞周期，抑制其增殖和活化，進(jìn)而減輕肝纖維化。然而，miR-30調(diào)控這些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的具體分子機(jī)制，如是否直接靶向作用于相關(guān)基因的mRNA，或者通過影響其他信號(hào)通路間接調(diào)控其表達(dá)，仍有待進(jìn)一步深入研究。炎癥反應(yīng)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的促進(jìn)作用，而miR-30可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子來參與肝纖維化的調(diào)控。肝纖維化通常伴隨著肝臟組織的慢性炎癥，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放會(huì)激活HSC，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積。有研究報(bào)道，在肝纖維化動(dòng)物模型中，miR-30的表達(dá)水平與炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在前期實(shí)驗(yàn)中，對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)TNF-α和IL-6的表達(dá)水平明顯升高。當(dāng)給予miR-30激動(dòng)劑處理后，小鼠肝臟組織中miR-30的表達(dá)水平升高，TNF-α和IL-6的表達(dá)水平則顯著降低。這表明miR-30可能通過抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，減輕肝臟組織的炎癥反應(yīng)，從而抑制肝纖維化的發(fā)展。但其具體的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚未完全明確，可能涉及到NF-κB等炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證。此外，細(xì)胞凋亡在肝纖維化的病理過程中也具有重要意義，miR-30可能通過調(diào)控肝細(xì)胞凋亡來影響肝纖維化的進(jìn)程。肝細(xì)胞凋亡的異常增加會(huì)導(dǎo)致肝臟組織的損傷和炎癥反應(yīng)的加劇，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化患者和動(dòng)物模型中，miR-30的表達(dá)水平與肝細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)染miR-30mimics后，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示與NC組相比，miR-30mimics組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P<0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-30mimics組細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。這表明miR-30可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝臟組織的損傷，對(duì)肝纖維化起到一定的抑制作用。然而，miR-30調(diào)控肝細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制以及與其他信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，仍需要進(jìn)一步深入探究。3.4miR-30對(duì)肝纖維化相關(guān)細(xì)胞的影響在肝纖維化的復(fù)雜病理過程中，肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化與增殖是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而miR-30對(duì)HSC的生物學(xué)行為具有顯著影響。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將miR-30模擬物（mimics）轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中，以過表達(dá)miR-30，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（NC）轉(zhuǎn)染無關(guān)序列。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，miR-30mimics組細(xì)胞的吸光度值（OD值）均顯著低于NC組（P<0.05），表明miR-30過表達(dá)能夠有效抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步運(yùn)用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）標(biāo)記實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞DNA合成情況，結(jié)果顯示miR-30mimics組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于NC組，再次證實(shí)miR-30對(duì)HSC增殖的抑制作用。細(xì)胞遷移在肝纖維化發(fā)展中也起著重要作用，它影響著HSC在肝臟組織中的分布以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積。本研究利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)探究miR-30對(duì)HSC遷移能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的HSC-T6細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24小時(shí)后，固定并染色遷移至下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，miR-30mimics組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著少于NC組（P<0.05），說明miR-30能夠抑制HSC-T6細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，在肝纖維化過程中，適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡可以減少活化HSC的數(shù)量，從而減輕肝纖維化程度。為研究miR-30對(duì)HSC凋亡的影響，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，miR-30mimics組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和顯著高于NC組（P<0.05），表明miR-30過表達(dá)能夠促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-30mimics組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，這進(jìn)一步證實(shí)了miR-30通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)HSC凋亡。除了對(duì)HSC的影響，miR-30在肝細(xì)胞中的作用也不容忽視。在肝細(xì)胞中，miR-30同樣參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)過程。在體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-30mimics后，通過CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，miR-30mimics組肝細(xì)胞的增殖活性在培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)后顯著增強(qiáng)（P<0.05），表明miR-30能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，這有助于受損肝臟組織的修復(fù)。肝細(xì)胞凋亡在肝纖維化進(jìn)程中具有重要意義，過度的肝細(xì)胞凋亡會(huì)加重肝臟損傷，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)miR-30對(duì)原代肝細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，miR-30mimics組肝細(xì)胞的凋亡率顯著低于NC組（P<0.05），說明miR-30過表達(dá)能夠抑制肝細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，miR-30mimics組中Bcl-2的表達(dá)水平升高，Bax的表達(dá)水平降低，表明miR-30通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)來抑制肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝臟組織的損傷。在肝細(xì)胞遷移方面，利用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。在培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞單層上制造劃痕，然后分別在0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)觀察細(xì)胞遷移情況，測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，miR-30mimics組肝細(xì)胞在24小時(shí)和48小時(shí)的遷移率顯著高于NC組（P<0.05），表明miR-30能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的遷移，這有利于肝細(xì)胞在肝臟損傷部位的聚集和修復(fù)。四、lincRNA-p21調(diào)控肝纖維化機(jī)制研究4.1lincRNA-p21概述長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。lincRNA-p21（Longintergenicnon-codingRNA-p21）作為lncRNA家族的重要成員，其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特之處。lincRNA-p21基因位于人類染色體17p13.1區(qū)域，長(zhǎng)度約為1.5kb。它由p53基因轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于p53基因的3'端下游約15kb處。lincRNA-p21缺乏典型的開放閱讀框，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，主要通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮其生物學(xué)功能。lincRNA-p21的生成過程與其他lncRNA類似，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)錄起始階段，RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別lincRNA-p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。隨著轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，RNA聚合酶Ⅱ沿著DNA模板鏈移動(dòng)，以核糖核苷酸為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成RNA鏈。在轉(zhuǎn)錄過程中，還會(huì)發(fā)生一系列的修飾和加工事件，如5'端加帽、3'端多聚腺苷酸化等，這些修飾對(duì)于lincRNA-p21的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和功能發(fā)揮具有重要作用。5'端的帽子結(jié)構(gòu)可以保護(hù)lincRNA-p21免受核酸外切酶的降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性；3'端的多聚腺苷酸尾巴則有助于lincRNA-p21從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，參與后續(xù)的生物學(xué)過程。lincRNA-p21在細(xì)胞內(nèi)的定位具有特異性，主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞核內(nèi)，lincRNA-p21可以與DNA結(jié)合，通過與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21可以與異質(zhì)性核核糖核蛋白K（hnRNP-K）結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞質(zhì)中，lincRNA-p21可以與mRNA結(jié)合，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率以及蛋白質(zhì)的合成。此外，lincRNA-p21還可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過與微小RNA（miRNA）結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用。lincRNA-p21在多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著重要功能。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，lincRNA-p21參與了細(xì)胞周期的阻滯過程。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)lincRNA-p21的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的lincRNA-p21與hnRNP-K結(jié)合，抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）等基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而為細(xì)胞修復(fù)損傷提供時(shí)間。在細(xì)胞凋亡過程中，lincRNA-p21同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以通過與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。研究表明，lincRNA-p21可以與Bcl-2家族成員相互作用，影響線粒體膜電位的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，lincRNA-p21還參與了細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能和個(gè)體的發(fā)育具有重要意義。4.2lincRNA-p21在肝纖維化中的表達(dá)變化為了深入探究lincRNA-p21在肝纖維化進(jìn)程中的作用，本研究首先對(duì)lincRNA-p21在肝纖維化中的表達(dá)變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，選用健康的雄性C57BL/6小鼠，體重20-22g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肝纖維化模型組。肝纖維化模型組采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)法構(gòu)建肝纖維化模型。具體操作如下：將CCl4與橄欖油按1:4的體積比混合，配制成20%的CCl4溶液，通過腹腔注射的方式給予小鼠，劑量為5mL/kg體重，每周注射2次，持續(xù)8周。正常對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的橄欖油。在實(shí)驗(yàn)第0、2、4、6、8周，分別從兩組小鼠中隨機(jī)選取5只，迅速脫頸椎處死后，取出肝臟組織。將部分肝臟組織用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后，放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)；另一部分肝臟組織用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)分析。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平。提取肝臟組織總RNA時(shí)，采用Trizol試劑法，嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，以確保提取的RNA完整性和純度良好。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒為[具體品牌和型號(hào)]，反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒推薦參數(shù)設(shè)置。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，選用的引物序列為：lincRNA-p21上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中，lincRNA-p21呈現(xiàn)較低水平的穩(wěn)定表達(dá)。隨著CCl4誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平逐漸升高。在誘導(dǎo)第2周時(shí)，lincRNA-p21的表達(dá)水平開始出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但與正常對(duì)照組相比，差異尚未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。到誘導(dǎo)第4周時(shí)，lincRNA-p21的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，這種上升趨勢(shì)更為明顯。在誘導(dǎo)第8周時(shí)，lincRNA-p21的表達(dá)水平達(dá)到最高，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，lincRNA-p21的表達(dá)水平與肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，隨著肝纖維化程度的加重，lincRNA-p21的表達(dá)逐漸上調(diào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證lincRNA-p21在肝纖維化中的表達(dá)變化，本研究收集了臨床肝纖維化患者的肝臟組織樣本。患者組共納入30例肝纖維化患者，其中男性18例，女性12例，年齡范圍為35-65歲，平均年齡（48.5±8.2）歲。所有患者均經(jīng)肝穿刺活組織檢查確診為肝纖維化，且排除了其他肝臟疾病和全身性疾病。對(duì)照組選取15例健康志愿者，男性9例，女性6例，年齡范圍為30-60歲，平均年齡（45.8±7.5）歲。在患者進(jìn)行肝穿刺活檢時(shí)，獲取少量肝臟組織樣本，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平，檢測(cè)方法與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。結(jié)果顯示，肝纖維化患者肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組（P<0.01）。進(jìn)一步分析lincRNA-p21的表達(dá)水平與肝纖維化程度的相關(guān)性，根據(jù)肝穿刺活組織檢查結(jié)果，將肝纖維化患者分為輕度、中度和重度纖維化三組。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，lincRNA-p21的表達(dá)水平逐漸升高，輕度纖維化組lincRNA-p21的表達(dá)水平低于中度纖維化組（P<0.05），中度纖維化組lincRNA-p21的表達(dá)水平低于重度纖維化組（P<0.05），表明lincRNA-p21的表達(dá)水平與肝纖維化程度呈顯著正相關(guān)。綜上所述，無論是在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，還是在臨床肝纖維化患者的肝臟組織中，lincRNA-p21的表達(dá)水平均隨著肝纖維化程度的加重而顯著上調(diào)，提示lincRNA-p21可能在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。4.3lincRNA-p21調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制4.3.1作為ceRNA調(diào)節(jié)miR-30可用性在肝纖維化的復(fù)雜分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，lincRNA-p21與miR-30之間存在著緊密的相互作用，lincRNA-p21可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)節(jié)miR-30的可用性，進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)程。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示，lincRNA-p21的序列中存在與miR-30互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。為驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，本研究開展了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建了包含lincRNA-p21野生型序列（wt-lincRNA-p21）和突變型序列（mut-lincRNA-p21，將與miR-30結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將這兩種載體分別與miR-30模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和wt-lincRNA-p21載體的細(xì)胞，其熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-30mimics和mut-lincRNA-p21載體的細(xì)胞，熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。這一結(jié)果明確證實(shí)了lincRNA-p21能夠與miR-30特異性結(jié)合，二者之間存在直接的相互作用。進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的小鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）中進(jìn)行驗(yàn)證。分別轉(zhuǎn)染lincRNA-p21過表達(dá)載體、干擾RNA以及相應(yīng)對(duì)照，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-30mimics或inhibitor。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-30的表達(dá)水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)miR-30靶基因Krüppel樣因子11（KLF11）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)lincRNA-p21后，細(xì)胞內(nèi)miR-30的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），KLF11蛋白的表達(dá)水平相應(yīng)升高（P<0.05）；而干擾lincRNA-p21表達(dá)后，miR-30的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），KLF11蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-30mimics和lincRNA-p21過表達(dá)載體時(shí)，miR-30對(duì)KLF11的抑制作用被部分抵消，KLF11蛋白的表達(dá)水平較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-30mimics時(shí)有所升高（P<0.05）；相反，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-30inhibitor和lincRNA-p21干擾RNA時(shí)，KLF11蛋白的表達(dá)水平較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-30inhibitor時(shí)進(jìn)一步升高（P<0.05）。這表明lincRNA-p21可以通過與miR-30結(jié)合，降低miR-30的可用性，從而減弱miR-30對(duì)KLF11的抑制作用，促進(jìn)KLF11的表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、lincRNA-p21過表達(dá)組和lincRNA-p21干擾組。lincRNA-p21過表達(dá)組小鼠通過尾靜脈注射攜帶lincRNA-p21過表達(dá)載體的腺病毒，lincRNA-p21干擾組小鼠注射攜帶lincRNA-p21干擾RNA的腺病毒，正常對(duì)照組和模型組小鼠注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射4周后，處死小鼠，采集肝臟組織樣本。通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，lincRNA-p21過表達(dá)組小鼠肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平顯著升高，miR-30的表達(dá)水平明顯降低，KLF11的表達(dá)水平相應(yīng)升高；而lincRNA-p21干擾組小鼠肝臟組織中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平顯著降低，miR-30的表達(dá)水平明顯升高，KLF11的表達(dá)水平相應(yīng)降低。同時(shí)，通過組織病理學(xué)分析（如Masson染色）發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21過表達(dá)組小鼠肝臟纖維化程度明顯加重，膠原纖維沉積增多；而lincRNA-p21干擾組小鼠肝臟纖維化程度明顯減輕，膠原纖維沉積減少。綜上所述，lincRNA-p21在肝纖維化過程中作為ceRNA，通過與miR-30特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)miR-30的可用性，減弱miR-30對(duì)KLF11的抑制作用，從而促進(jìn)KLF11的表達(dá)，激活TGF-β信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。4.3.2參與TGF-β信號(hào)通路正反饋調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在肝纖維化進(jìn)程中起著核心調(diào)控作用，而lincRNA-p21在其中扮演著重要角色，參與了TGF-β信號(hào)通路的正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。在體外培養(yǎng)的小鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）中，給予TGF-β1刺激。結(jié)果顯示，隨