enzymologyc蛋白質(zhì)濃度測(cè)定第1頁(yè)，共28頁(yè)。C分離的每個(gè)步驟選擇不同性質(zhì)的分離方法

D最后分離條件注重復(fù)原性、快速，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)越純穩(wěn)定性下降越快。第2頁(yè)，共28頁(yè)。2.初步純化

一般注意點(diǎn)：

A.溫度

B.避免極端I,pH

C.有機(jī)溶劑

D.蛋白質(zhì)的濃度（高穩(wěn)定，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)帶負(fù)電，排斥力大）

E.避免泡沫和膜的形成

F.酶的活性

第3頁(yè)，共28頁(yè)。

6.純化步驟的定量評(píng)價(jià)3.選擇性的純化步驟

色譜法4.檢查純化的進(jìn)展情況

常用電泳（PAGE,SDS,IEF）5.進(jìn)一步純化

根據(jù)4結(jié)果，若分子大小差異——GEC若電荷差異——離子交換色譜第4頁(yè)，共28頁(yè)。7.在純化過(guò)程中酶活力的損失

主要原因：蛋白質(zhì)變性

避免方法：改變溫度和pH其他原因：輔助因子被去除第5頁(yè)，共28頁(yè)。第七節(jié)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

凱氏定氮法雙縮脲法福林（Folin)-酚試劑法考馬斯藍(lán)染色法紫外光吸收法第6頁(yè)，共28頁(yè)。DeterminationofenzymeactivityEnzymeactivity（酶活力，酶活性）

Activeunit（酶的活力單位）

Specificactivity（酶的比活力）第7頁(yè)，共28頁(yè)。Enzymeactivity定義

指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力

用在一定條件下，酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度（初速度）來(lái)表示

方法

測(cè)定產(chǎn)物增加的量或底物減少的量

eg.化學(xué)滴定、比色、測(cè)定紫外吸收、熒光測(cè)定

第8頁(yè)，共28頁(yè)。Activeunit（U）國(guó)際單位

1個(gè)酶活力單位，是指在特定條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾的有關(guān)基團(tuán)的酶量。

特定條件：溫度—25oC

其他條件（eg.pH及底物濃度）均采用最適條件。

習(xí)慣用法

eg.-淀粉酶，用每小時(shí)催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量來(lái)表示。第9頁(yè)，共28頁(yè)。實(shí)例-淀粉酶，-淀粉酶果膠酶蛋白酶脂酶過(guò)氧化物酶(POD)多酚氧化酶(PPO)脂肪氧合酶第10頁(yè)，共28頁(yè)。

-淀粉酶活力測(cè)定方法

碘顯色能力下降的速度

底物粘度下降速度

糖苷鍵被打斷的速度-淀粉酶活力的測(cè)定方法

麥芽糖形成的速度

3，5-二硝基水楊酸、鐵氰化鉀或堿性銅鹽溶液測(cè)定還原基團(tuán)形成的速度第11頁(yè)，共28頁(yè)。果膠酶活力的測(cè)定PE(pectinesterase果膠酯酶)：滴定法(pH-stat法)PG(polygalacturonase聚半乳糖醛酸酶)和PMG(polymethylgalacturonase聚甲基半乳糖醛酸酶)（為內(nèi)切酶時(shí)）：粘度法PMGL（polymethylgalaturomidelyase聚甲基半乳糖醛酸裂解酶）PGL（polygalacturonmidelyase聚半乳糖醛酸裂解酶）：降解產(chǎn)物的C4和C5之間形成雙鍵，在235nm處有吸收。第12頁(yè)，共28頁(yè)。第13頁(yè)，共28頁(yè)。蛋白酶活力的測(cè)定蛋白質(zhì)酶肽原理：根據(jù)蛋白質(zhì)經(jīng)酶作用后在一定濃度的三氯醋酸（TCA）溶液中溶解度的變化來(lái)確定酶的活力。肽的含量測(cè)定：紫外分光光度法顯色法（茚三酮、雙縮脲試劑、福林酚試劑）第14頁(yè)，共28頁(yè)。國(guó)標(biāo)(QB547-80)原理：蛋白酶水解酪蛋白，其產(chǎn)物中含酚基的氨基酸在堿性條件下能被福林(Folin)試劑還原，生成藍(lán)色化合物，從藍(lán)色的深淺測(cè)知酶活力的大小。第15頁(yè)，共28頁(yè)。底物：0.5%酪蛋白緩沖溶液：0.02M，pH7.5PB酶液配制：精確取定量的酶粉100mg，加少量緩沖液研磨，定容100ml，離心，取上清液10ml定容100ml。酶活力測(cè)定：酶和底物分別于30℃水浴保溫，取出2ml底物加入稀釋的酶液1ml，立即混勻計(jì)時(shí)，反應(yīng)15min，立即加入3ml10%TCA終止，室溫靜置半小時(shí)，過(guò)濾，取1ml濾液用Folin-phenol法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)，680nm比色。中性蛋白酶AS1398活力的測(cè)定第16頁(yè)，共28頁(yè)。酶活力定義：在30℃pH7.5條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位。目前國(guó)內(nèi)工廠都以1g酶制劑所含的酶活力單位數(shù)來(lái)表示酶制劑的活力。酶活力單位=6/15KO.Dn總體積反應(yīng)時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線中O.D值為1所相當(dāng)?shù)睦业鞍孜⒖藬?shù)酶液稀釋總倍數(shù)第17頁(yè)，共28頁(yè)。脂酶活力的測(cè)定底物：不溶解的甘油三酯（甘油三酸酯、橄欖油）測(cè)定方法：

1.當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到一定的時(shí)間，在反應(yīng)體系中加入溶劑（乙醇或丙酮）以終止反應(yīng)，然后滴定在反應(yīng)中釋出的脂肪酸；

2.采用pH-stat法，在pH8連續(xù)測(cè)定整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中游離脂肪酸含量隨時(shí)間而增加的速度；

第18頁(yè)，共28頁(yè)。3.反應(yīng)中產(chǎn)生的H+與加入的NaHCO3作用釋出CO2，后者可用呼吸儀測(cè)定；4.測(cè)定脂肪酸的產(chǎn)生而導(dǎo)致的反應(yīng)體系表面張力的下降；5.采用生色底物，如乙酸-萘酯第19頁(yè)，共28頁(yè)。過(guò)氧化物酶活力的測(cè)定原理：有氫供體存在的條件下，過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫分解的同時(shí)形成有色化合物。方法：分光光度法第20頁(yè)，共28頁(yè)。多酚氧化酶活力的測(cè)定測(cè)定底物消失的速度測(cè)定產(chǎn)物生成的速度第21頁(yè)，共28頁(yè)。脂肪氧合酶的活力測(cè)定量壓法分光光度法第22頁(yè)，共28頁(yè)。Specificactivity比活力

每毫克蛋白所具有的酶活力

單位

單位/毫克蛋白（U/mg蛋白質(zhì)）對(duì)同一種酶，比活力愈高，酶愈純第23頁(yè)，共28頁(yè)。硫酸銨的分級(jí)沉淀第24頁(yè)，共28頁(yè)。分離方法總的酶活力（單位）產(chǎn)量或回收率（%）總的蛋白質(zhì)(mg)比活力（酶單位/mg蛋白質(zhì)）純化倍數(shù)粗液萃取33652498210%硫酸銨飽和度，上清液322003300Bio-GelP-60柱255601474DEAE-Sephadex柱17253308ConA-Sepharose柱46145.9Phenyl-SepharoseCL-4B柱23001.7DEAE-Sephadex柱14100.33過(guò)氧化物酶純化表第25頁(yè)，共28頁(yè)。分離方法總的酶活力（單位）產(chǎn)量或回收率（%）總的蛋白質(zhì)(mg)比活力（酶單位/mg蛋白質(zhì)）純化倍數(shù)粗液萃取3365210049826.81.010%硫酸銨飽和度，上清液322009633009.81.4Bio-GelP-60柱2556076147417.32.5DEAE-Sephadex柱172535130856.08.2ConA-Sepharose柱4614145.9782.0115.0Phenyl-SepharoseCL-4B柱230071.71352.9199.0DEAE-Sephadex柱141040.334272.7628.4過(guò)氧化物酶純化表第26頁(yè)，共28頁(yè)。■蔗糖合成酶的純化表：純化步驟全蛋白質(zhì)

回收率全部活性比活性純化倍數(shù)

粗抽提液魚精蛋白沉淀后上清

硫酸銨分級(jí)

(35-55%)

SepharoseCL-6B

凝膠過(guò)濾DEAESepharose離子交換