5-氟尿嘧啶聯(lián)合甲酰四氫葉酸鈣對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為女性群體中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康與生活質(zhì)量。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在部分發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，其發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤之首。在中國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率也以每年約3%-4%的速度遞增，成為女性健康的重大隱患?；瘜W(xué)治療在乳腺癌的綜合治療中占據(jù)著至關(guān)重要的地位，是控制腫瘤進(jìn)展、提高患者生存率和改善生活質(zhì)量的重要手段之一。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）作為一種經(jīng)典的抗腫瘤代謝藥物，自問世以來，因其具有快速、高效和相對(duì)低毒副作用的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌等多種惡性腫瘤的治療，成為臨床化療的常用藥物之一。然而，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶時(shí)，其藥效在不同患者和不同癌癥類型中存在顯著差異，難以滿足所有患者的治療需求。此外，如同眾多抗癌藥物一樣，5-氟尿嘧啶也難以逃脫毒性較大的缺點(diǎn)，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用劑量和治療效果，導(dǎo)致部分患者因無法耐受藥物毒性而不得不中斷治療。為了克服5-氟尿嘧啶單獨(dú)使用時(shí)的局限性，提高其治療效果，聯(lián)合用藥成為了一種重要的研究方向。聯(lián)合用藥通過將不同作用機(jī)制的藥物組合使用，可以發(fā)揮藥物之間的協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，同時(shí)降低單一藥物的劑量，減少毒副作用的發(fā)生。甲酰四氫葉酸鈣（CalciumFolinate，CF）作為核酸合成的重要輔酶，被發(fā)現(xiàn)對(duì)5-Fu具有增效作用。其作用機(jī)制主要是通過增強(qiáng)5-Fu的活性代謝產(chǎn)物與胸苷酸合成酶（TS）的結(jié)合，從而抑制DNA的合成，提高5-Fu的抗腫瘤效果。此外，甲酰四氫葉酸鈣本身毒副作用較輕，與5-Fu聯(lián)合使用，既能提高療效，又能在一定程度上減輕患者的不良反應(yīng)負(fù)擔(dān)。研究5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，深入探究聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，有助于揭示乳腺癌化療的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步優(yōu)化化療方案提供理論依據(jù)。通過研究聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等方面的影響，可以更深入地了解腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)新的抗癌藥物和治療策略提供新思路。從實(shí)踐角度出發(fā)，明確5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥的最佳劑量組合、作用時(shí)間和療效評(píng)估指標(biāo)等，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供更科學(xué)、精準(zhǔn)的治療方案，提高乳腺癌的化療效果，減少藥物毒副作用，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。這對(duì)于降低乳腺癌的死亡率、提高患者的生存率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望為廣大乳腺癌患者帶來新的治療希望和福音。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳腺癌治療領(lǐng)域，5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸鈣的研究備受關(guān)注。國(guó)外對(duì)5-氟尿嘧啶的研究歷史悠久，早在20世紀(jì)50年代就已被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床。經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐和研究，其作用機(jī)制逐漸清晰，它主要通過抑制胸苷酸合成酶（TS），阻斷DNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，隨著臨床應(yīng)用的深入，5-氟尿嘧啶單藥治療的局限性也逐漸顯現(xiàn)，如療效有限、易產(chǎn)生耐藥性以及毒副作用較大等問題，促使研究者們積極探索聯(lián)合用藥方案以提高治療效果。在甲酰四氫葉酸鈣方面，國(guó)外研究率先揭示了其對(duì)5-氟尿嘧啶的增效機(jī)制。甲酰四氫葉酸鈣作為核酸合成的重要輔酶，能夠增強(qiáng)5-氟尿嘧啶的活性代謝產(chǎn)物與胸苷酸合成酶的結(jié)合親和力，從而顯著提高5-氟尿嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都有力地證實(shí)了這一增效作用，為兩者的聯(lián)合應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在臨床研究中，國(guó)外多項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)對(duì)5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥方案進(jìn)行了深入探討。例如，一些研究針對(duì)不同分期的乳腺癌患者，采用不同劑量組合和給藥方式的聯(lián)合方案進(jìn)行治療，并與5-氟尿嘧啶單藥治療組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組在腫瘤緩解率、無進(jìn)展生存期和總生存期等方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，且在可接受的毒副作用范圍內(nèi)。這一系列研究成果為聯(lián)合用藥在臨床實(shí)踐中的推廣應(yīng)用提供了重要的證據(jù)支持。國(guó)內(nèi)對(duì)5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸鈣的研究起步相對(duì)較晚，但近年來發(fā)展迅速。在5-氟尿嘧啶單藥治療乳腺癌的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過對(duì)大量臨床病例的分析，進(jìn)一步明確了其在不同乳腺癌亞型中的療效差異，并對(duì)影響療效的因素進(jìn)行了深入探討，如患者的年齡、病理類型、分子分型以及藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性等。這些研究為臨床醫(yī)生根據(jù)患者個(gè)體情況合理選擇5-氟尿嘧啶治療方案提供了有益的參考。在聯(lián)合用藥研究方面，國(guó)內(nèi)也開展了一系列相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究?；A(chǔ)研究主要聚焦于聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路和分子機(jī)制的影響。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥不僅能夠顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，還能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax和p53等的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在臨床研究方面，國(guó)內(nèi)的臨床試驗(yàn)同樣證實(shí)了5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥在乳腺癌治療中的有效性和安全性。一些研究還對(duì)聯(lián)合用藥的最佳劑量、給藥時(shí)間和療程等進(jìn)行了優(yōu)化探索，為制定適合我國(guó)乳腺癌患者的聯(lián)合化療方案提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥治療乳腺癌的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。例如，聯(lián)合用藥的具體作用機(jī)制尚未完全明確，不同研究中聯(lián)合用藥的劑量和方案存在差異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；此外，如何進(jìn)一步提高聯(lián)合用藥的療效，降低毒副作用，以及如何根據(jù)患者的個(gè)體差異實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療等，都是未來需要深入研究的方向。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為乳腺癌的臨床化療提供更具科學(xué)依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值的治療方案。在具體研究?jī)?nèi)容方面，首先將開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以人乳腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，設(shè)置不同的藥物處理組，包括單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶組、單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣組以及兩者聯(lián)合用藥組，并設(shè)立空白對(duì)照組。運(yùn)用MTT法等技術(shù)，精確檢測(cè)不同藥物濃度和作用時(shí)間下乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制率，系統(tǒng)分析聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，通過比較不同處理組細(xì)胞的增殖情況，明確聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同抑制細(xì)胞增殖的作用，以及最佳的藥物濃度組合和作用時(shí)間。細(xì)胞凋亡檢測(cè)也是一項(xiàng)重要內(nèi)容，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行全面檢測(cè)。利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中特有的DNA梯狀條帶，直觀判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡；通過熒光染色技術(shù)，如Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化等典型的凋亡特征；借助流式細(xì)胞術(shù)，精確分析凋亡細(xì)胞的周期變化，準(zhǔn)確計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例，深入研究聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其與細(xì)胞周期的關(guān)系，從而全面、深入地了解聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果和特點(diǎn)。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的研究同樣不可或缺，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、免疫熒光等技術(shù)，細(xì)致檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax、p53等的表達(dá)水平變化。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，而Bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過檢測(cè)它們的表達(dá)變化，可以深入了解聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡內(nèi)在調(diào)控機(jī)制的影響。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程，檢測(cè)p53的表達(dá)變化有助于進(jìn)一步揭示聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，明確聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。1.4研究方法與技術(shù)路線在本研究中，將綜合運(yùn)用多種研究方法，從細(xì)胞水平深入探究5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是本研究的重要基礎(chǔ)。選用人乳腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，這些細(xì)胞系具有典型的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的行為。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格遵循細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。在藥物處理方面，設(shè)置了多個(gè)不同的藥物處理組，包括單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶組、單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣組以及兩者聯(lián)合用藥組，并設(shè)立空白對(duì)照組。通過精確控制藥物的濃度和作用時(shí)間，分別處理乳腺癌細(xì)胞，以全面觀察不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞的變化情況。其中，5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸鈣的濃度范圍根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行合理設(shè)定，作用時(shí)間分別設(shè)置為24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，以探究藥物作用的時(shí)效關(guān)系。MTT法是檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率的關(guān)鍵技術(shù)。其原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（OD值），根據(jù)OD值的大小可以間接反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作時(shí)，在藥物處理結(jié)束后，向每個(gè)孔中加入一定量的MTT溶液，繼續(xù)孵育一定時(shí)間，然后小心吸去上清液，加入DMSO溶解結(jié)晶甲瓚，充分振蕩后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的OD值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過對(duì)不同處理組細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算和分析，明確聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，確定最佳的藥物濃度組合和作用時(shí)間。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用多種技術(shù)相結(jié)合的方式，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和全面性。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中特有的DNA梯狀條帶。在細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產(chǎn)生180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，這些片段在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)出特征性的梯狀條帶。具體操作時(shí)，收集藥物處理后的細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄DNA條帶的分布情況。若出現(xiàn)清晰的梯狀條帶，則表明細(xì)胞發(fā)生了凋亡。熒光染色技術(shù)，如Hoechst33342染色，用于在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。Hoechst33342是一種可以與DNA結(jié)合的熒光染料，正常細(xì)胞的細(xì)胞核染色均勻，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、核碎裂等典型的凋亡特征，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光。操作時(shí)，將藥物處理后的細(xì)胞用Hoechst33342染色液染色，然后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行觀察和拍照，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞的比例，分析聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。流式細(xì)胞術(shù)是一種精確分析細(xì)胞周期和凋亡細(xì)胞比例的先進(jìn)技術(shù)。它可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)大量單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的變化，將細(xì)胞周期分為G1期、S期和G2/M期，并根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA含量的減少，準(zhǔn)確計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。在實(shí)驗(yàn)中，收集藥物處理后的細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行固定、染色等處理，最后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。通過分析流式細(xì)胞儀獲取的數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞周期分布圖和凋亡細(xì)胞直方圖，深入研究聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其與細(xì)胞周期的關(guān)系。對(duì)于凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的研究，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和免疫熒光等技術(shù)。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，最后通過化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。在本研究中，首先提取藥物處理后乳腺癌細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜，然后依次加入一抗（如抗Bcl-2、抗Bax、抗p53等抗體）、二抗進(jìn)行孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照并分析目標(biāo)蛋白的條帶灰度值，從而確定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。免疫熒光技術(shù)則是利用熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察目標(biāo)蛋白的定位和表達(dá)情況。具體操作時(shí)，將藥物處理后的細(xì)胞固定在載玻片上，用TritonX-100進(jìn)行通透處理，然后用5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，依次加入一抗、熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄目標(biāo)蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度和分布情況，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果，深入了解聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡內(nèi)在調(diào)控機(jī)制的影響。本研究的技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行人乳腺癌細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，進(jìn)行分組處理，分別給予不同的藥物干預(yù)。在藥物作用相應(yīng)時(shí)間后，一部分細(xì)胞用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，以篩選出最佳的藥物濃度和作用時(shí)間；另一部分細(xì)胞分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以分析細(xì)胞凋亡情況；同時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。最后，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，綜合探討5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌概述乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。從分子生物學(xué)角度來看，乳腺癌的發(fā)生是基因突變的結(jié)果，這些基因突變可分為遺傳突變和獲得性突變。遺傳突變主要與乳腺癌易感基因（如BRCA1、BRCA2等）的異常有關(guān)，攜帶這些突變基因的個(gè)體，其患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。例如，BRCA1基因突變的女性，在70歲之前患乳腺癌的累積風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)50%-80%。獲得性突變則是在后天的生活過程中，由于環(huán)境因素、生活方式等影響，導(dǎo)致乳腺細(xì)胞的基因發(fā)生改變。長(zhǎng)期暴露于電離輻射、化學(xué)致癌物（如多環(huán)芳烴、芳香胺等），以及不良的生活習(xí)慣（如長(zhǎng)期大量飲酒、缺乏運(yùn)動(dòng)、高脂飲食等），都可能增加乳腺細(xì)胞基因突變的幾率，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。乳腺是雌激素的靶器官，雌激素通過與乳腺細(xì)胞表面的雌激素受體（ER）結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。當(dāng)體內(nèi)雌激素水平長(zhǎng)期過高或雌激素信號(hào)通路異常激活時(shí)，乳腺細(xì)胞可能會(huì)過度增殖，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。月經(jīng)初潮早、絕經(jīng)晚、未生育或生育年齡晚等因素，都會(huì)使女性乳腺組織長(zhǎng)期暴露于較高水平的雌激素環(huán)境中，增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，肥胖也是乳腺癌的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，肥胖女性體內(nèi)脂肪組織增多，可通過芳香化酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平升高，從而增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)病理類型，乳腺癌主要分為非浸潤(rùn)性癌和浸潤(rùn)性癌兩大類。非浸潤(rùn)性癌又稱原位癌，是指癌細(xì)胞局限于乳腺導(dǎo)管或腺泡內(nèi)，未突破基底膜，如導(dǎo)管原位癌和小葉原位癌。這類癌癥通常處于早期階段，預(yù)后相對(duì)較好，通過手術(shù)切除等治療方法，患者的5年生存率可達(dá)90%以上。浸潤(rùn)性癌則是指癌細(xì)胞已經(jīng)突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)，包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌等多種亞型。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是最常見的浸潤(rùn)性乳腺癌類型，約占浸潤(rùn)性乳腺癌的70%-80%，其癌細(xì)胞形態(tài)多樣，惡性程度相對(duì)較高，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對(duì)較差。浸潤(rùn)性小葉癌的癌細(xì)胞呈單排或條索狀浸潤(rùn)生長(zhǎng)，其惡性程度和預(yù)后介于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和非浸潤(rùn)性癌之間。除了這兩種常見類型外，還有一些特殊類型的浸潤(rùn)性癌，如乳頭狀癌、髓樣癌、黏液腺癌等，它們?cè)诮M織學(xué)形態(tài)、生物學(xué)行為和預(yù)后方面各具特點(diǎn)，一般來說，特殊類型的浸潤(rùn)性癌相對(duì)少見，但部分類型的預(yù)后相對(duì)較好。從分子標(biāo)志物分型來看，乳腺癌可分為L(zhǎng)uminalA型、LuminalB型、HER2過表達(dá)型和三陰型。LuminalA型和LuminalB型都表達(dá)雌激素受體（ER）和/或孕激素受體（PR），但兩者在HER2表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)上存在差異。LuminalA型乳腺癌的HER2陰性，Ki-67增殖指數(shù)較低，其腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，預(yù)后較好；LuminalB型乳腺癌的HER2可能陽性，Ki-67增殖指數(shù)較高，其預(yù)后相對(duì)LuminalA型稍差，治療上除了內(nèi)分泌治療外，可能還需要化療。HER2過表達(dá)型乳腺癌的HER2呈陽性表達(dá)，這類乳腺癌細(xì)胞增殖活躍，侵襲性較強(qiáng)，但針對(duì)HER2的靶向治療藥物（如曲妥珠單抗）取得了顯著的療效，大大改善了患者的預(yù)后。三陰型乳腺癌的ER、PR和HER2均為陰性，缺乏有效的靶向治療靶點(diǎn)，對(duì)化療相對(duì)敏感，但復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后較差，是目前乳腺癌治療中的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)之一。近年來，乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已取代肺癌成為全球最常見的癌癥，新發(fā)病例高達(dá)226萬例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。在中國(guó)，乳腺癌同樣是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率也在逐年上升。以上海為例，2015年上海女性乳腺癌的發(fā)病率達(dá)到了62.07/10萬，且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，45-55歲年齡段的女性發(fā)病率較高。乳腺癌不僅給患者的身心健康帶來了巨大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著人口老齡化的加劇、生活方式的改變以及環(huán)境污染等因素的影響，預(yù)計(jì)未來乳腺癌的發(fā)病率還將繼續(xù)上升，因此，加強(qiáng)乳腺癌的防治研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機(jī)制，在多細(xì)胞生物的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡過程涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，與細(xì)胞壞死有著本質(zhì)的區(qū)別。細(xì)胞壞死通常是由于外界的物理、化學(xué)損傷或嚴(yán)重的病理刺激導(dǎo)致的細(xì)胞被動(dòng)死亡，其過程表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，常常引發(fā)炎癥反應(yīng)；而細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的、程序性的死亡過程，細(xì)胞在凋亡過程中，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不會(huì)泄漏到細(xì)胞外，避免了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。凋亡細(xì)胞最終會(huì)分解成凋亡小體，被巨噬細(xì)胞或周圍組織細(xì)胞吞噬清除，對(duì)機(jī)體的正常生理功能影響較小。細(xì)胞凋亡主要通過兩條經(jīng)典途徑進(jìn)行調(diào)控，即死亡受體介導(dǎo)的外源途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑。死亡受體途徑是由胞外的死亡信號(hào)激活細(xì)胞膜表面的死亡受體而啟動(dòng)的凋亡過程。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體基因家族成員，其胞外有一段富含半胱氨酸的區(qū)域，胞質(zhì)區(qū)含有一個(gè)具有蛋白水解功能的同源氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)，被稱為“死亡區(qū)域”。當(dāng)死亡配體與死亡受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致受體三聚體化，使受體的胞漿部分與接頭蛋白Fas相關(guān)死亡蛋白（FADD）和procaspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8通過自身或相互之間的切割產(chǎn)生成熟的caspase-8，caspase-8具有強(qiáng)大的蛋白水解活性，它可以激活下游的caspases-3，caspases-3進(jìn)而水解ICAD（InhibitorofCaspase-ActivatedDNase）使其活化CAD（Caspase-ActivatedDNase），CAD能夠切割DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，caspase-8還可以激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid，正常狀態(tài)下，Bid以非活性方式存在于胞漿內(nèi)，當(dāng)被caspase-8激活后，形成一種截短的Bid（tBid），tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等釋放入胞質(zhì)，從而進(jìn)一步激活caspase-9，強(qiáng)化caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體途徑則主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等激活。在正常生理狀態(tài)下，線粒體膜電位穩(wěn)定，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子被封閉在線粒體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，線粒體膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡體（apoptosome）。凋亡體招募并激活procaspase-9，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的caspase-9，caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應(yīng)caspases作用于多種細(xì)胞內(nèi)底物，如細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化，如細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，可分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜等膜結(jié)構(gòu)上，通過阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；促凋亡蛋白則可以通過不同的方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡，例如Bax和Bak在凋亡信號(hào)刺激下，可以發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，促使細(xì)胞色素C等釋放。Bcl-2家族蛋白之間通過相互作用形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精確調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。當(dāng)抗凋亡蛋白的表達(dá)水平較高時(shí)，它們可以與促凋亡蛋白結(jié)合，抑制促凋亡蛋白的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡；相反，當(dāng)促凋亡蛋白的表達(dá)增加或活性增強(qiáng)時(shí)，它們可以拮抗抗凋亡蛋白的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。例如，在正常細(xì)胞中，Bcl-2的表達(dá)可以抑制Bax的活性，維持細(xì)胞的存活；而在凋亡信號(hào)刺激下，Bax的表達(dá)上調(diào)或其活性被激活，Bax可以與Bcl-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成Bax-Bax同源二聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，引發(fā)細(xì)胞凋亡。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)p53的水平較低，其活性受到嚴(yán)格的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，p53會(huì)被激活并發(fā)生磷酸化等修飾，從而穩(wěn)定p53蛋白并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。激活的p53可以通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一方面，p53可以直接上調(diào)促凋亡蛋白Bax、PUMA等的表達(dá)，促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；另一方面，p53可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，解除Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。此外，p53還可以通過調(diào)節(jié)死亡受體的表達(dá)，如上調(diào)Fas等死亡受體的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在乳腺癌等多種腫瘤中，常常會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變或缺失，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，使得腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的調(diào)控，進(jìn)而發(fā)生惡性增殖和轉(zhuǎn)移。2.35-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣的作用機(jī)制5-氟尿嘧啶作為一種經(jīng)典的抗代謝類化療藥物，在乳腺癌治療領(lǐng)域具有重要地位。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與尿嘧啶相似，進(jìn)入人體后，需在體內(nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的代謝過程，轉(zhuǎn)化為具有活性的代謝產(chǎn)物，才能發(fā)揮抗腫瘤作用。5-氟尿嘧啶主要通過抑制胸苷酸合成酶（TS）的活性，來阻斷DNA的合成。在正常細(xì)胞中，胸苷酸合成酶能夠催化脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化生成脫氧胸苷酸（dTMP），dTMP是DNA合成的重要原料之一。而5-氟尿嘧啶在細(xì)胞內(nèi)被代謝為氟尿嘧啶脫氧核苷酸（FdUMP），F(xiàn)dUMP可以與胸苷酸合成酶以及輔酶N5，N10-亞甲基四氫葉酸形成穩(wěn)定的三聯(lián)復(fù)合物，從而抑制胸苷酸合成酶的活性，使dUMP無法正常轉(zhuǎn)化為dTMP，導(dǎo)致DNA合成受阻，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，5-氟尿嘧啶還可以通過摻入RNA中，干擾RNA的正常代謝和功能，影響蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。然而，5-氟尿嘧啶在臨床應(yīng)用中存在一些局限性。一方面，5-氟尿嘧啶在體內(nèi)的代謝過程復(fù)雜，個(gè)體差異較大，導(dǎo)致其在不同患者體內(nèi)的藥物濃度和療效存在顯著差異。部分患者可能由于藥物代謝酶的活性不同，使得5-氟尿嘧啶不能有效地轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，從而影響治療效果；另一方面，長(zhǎng)期使用5-氟尿嘧啶容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制對(duì)5-氟尿嘧啶產(chǎn)生耐藥，如增加胸苷酸合成酶的表達(dá)水平，使其能夠與更多的FdUMP結(jié)合，從而降低5-氟尿嘧啶的抑制作用；或者改變細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，減少5-氟尿嘧啶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶產(chǎn)生抵抗。此外，5-氟尿嘧啶還存在一定的毒副作用，常見的不良反應(yīng)包括胃腸道反應(yīng)（如惡心、嘔吐、腹瀉等）、骨髓抑制（導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板減少等）以及口腔黏膜損傷等，這些毒副作用不僅會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，還可能限制藥物的使用劑量和療程，從而影響治療效果。甲酰四氫葉酸鈣，又稱亞葉酸鈣，是一種重要的輔酶，在核酸合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其主要作用是為胸苷酸合成酶提供甲基，參與dTMP的合成。當(dāng)甲酰四氫葉酸鈣與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用時(shí)，能夠顯著增強(qiáng)5-氟尿嘧啶的抗腫瘤效果，起到增效作用。這主要是因?yàn)榧柞Ｋ臍淙~酸鈣可以增加細(xì)胞內(nèi)還原型葉酸的水平，使更多的N5，N10-亞甲基四氫葉酸與氟尿嘧啶脫氧核苷酸（FdUMP）和胸苷酸合成酶形成穩(wěn)定的三聯(lián)復(fù)合物。這種穩(wěn)定的復(fù)合物能夠更有效地抑制胸苷酸合成酶的活性，從而增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)DNA合成的抑制作用，提高其抗腫瘤效果。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合使用甲酰四氫葉酸鈣和5-氟尿嘧啶時(shí)，細(xì)胞內(nèi)胸苷酸合成酶的活性明顯降低，DNA合成受到更強(qiáng)烈的抑制，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，凋亡率明顯增加。此外，甲酰四氫葉酸鈣還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的葉酸代謝途徑，影響其他與核酸合成相關(guān)的酶的活性，進(jìn)一步協(xié)同5-氟尿嘧啶發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，甲酰四氫葉酸鈣本身毒副作用較輕，與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用，在提高療效的同時(shí)，不會(huì)明顯增加患者的不良反應(yīng)負(fù)擔(dān)，具有較好的安全性和耐受性。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系源自一名69歲白人女性的乳腺癌組織，具有雌激素受體陽性、孕激素受體陽性和HER2陰性的特征，屬于LuminalA型乳腺癌細(xì)胞系，是乳腺癌研究中常用的細(xì)胞模型之一，能夠較好地模擬體內(nèi)LuminalA型乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。細(xì)胞由[細(xì)胞來源機(jī)構(gòu)名稱]提供，收到細(xì)胞后，立即將其復(fù)蘇并培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2主要試劑與儀器5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）購自[試劑生產(chǎn)廠家1]，純度≥99%，為白色結(jié)晶粉末，其分子式為C?H?FN?O?，分子量為130.08。使用時(shí)，將5-氟尿嘧啶用無菌PBS緩沖液溶解，配制成10mM的母液，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，分裝于無菌離心管中，-20℃避光保存，使用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行稀釋。甲酰四氫葉酸鈣（CalciumFolinate，CF）購自[試劑生產(chǎn)廠家2]，為淡黃色結(jié)晶性粉末，使用時(shí)用無菌PBS緩沖液溶解，配制成5mM的母液，同樣經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱，使用前稀釋至所需濃度。RPMI1640培養(yǎng)基購自[培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家]，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使用時(shí)按照說明書要求加入適量的胎牛血清、青霉素和鏈霉素，配制成完全培養(yǎng)基，4℃保存，使用前需在37℃水浴中預(yù)熱。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購自[血清生產(chǎn)廠家]，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起著重要作用，使用前需在56℃水浴中滅活30分鐘，然后分裝保存于-20℃冰箱。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）購自[試劑生產(chǎn)廠家3]，用于細(xì)胞的消化傳代，4℃保存。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購自[試劑生產(chǎn)廠家4]，是一種檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性的試劑，為黃色粉末，使用時(shí)用無菌PBS緩沖液配制成5mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，分裝保存于4℃冰箱，避光保存。DMSO（二甲基亞砜）購自[試劑生產(chǎn)廠家5]，用于溶解MTT還原產(chǎn)物甲瓚，為無色透明液體，具有強(qiáng)吸水性，使用時(shí)需注意防潮，常溫保存。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)1]），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度在37℃，CO?濃度在5%；超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)2]），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過程中的無菌操作，防止微生物污染；倒置顯微鏡（[品牌及型號(hào)3]），用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化；酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)4]），用于測(cè)定MTT實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況；高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號(hào)5]），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[X]rpm；電泳儀（[品牌及型號(hào)6]）和凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)7]），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)電泳和條帶檢測(cè)；流式細(xì)胞儀（[品牌及型號(hào)8]），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布；熒光顯微鏡（[品牌及型號(hào)9]），用于觀察熒光染色后的細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)定位。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將復(fù)蘇后的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，迅速加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕柔吹打細(xì)胞，使其成為均勻的單細(xì)胞懸液。按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，進(jìn)行藥物處理實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)新環(huán)境。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)組，分別為空白對(duì)照組、5-氟尿嘧啶單藥組、甲酰四氫葉酸鈣單藥組和5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥組?？瞻讓?duì)照組加入等體積的無菌PBS緩沖液；5-氟尿嘧啶單藥組分別加入終濃度為5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的5-氟尿嘧啶溶液；甲酰四氫葉酸鈣單藥組分別加入終濃度為1μM、2μM、4μM、8μM、16μM的甲酰四氫葉酸鈣溶液；聯(lián)合用藥組則加入不同濃度組合的5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸鈣溶液，如5μM5-氟尿嘧啶與1μM甲酰四氫葉酸鈣、10μM5-氟尿嘧啶與2μM甲酰四氫葉酸鈣等，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。藥物加入后，將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別孵育24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。3.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率在藥物處理結(jié)束前4小時(shí)，向每孔中加入20μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。MTT可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，沉積在細(xì)胞內(nèi)，其生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比。孵育結(jié)束后，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細(xì)胞和甲瓚結(jié)晶，然后向每孔中加入150μLDMSO。DMSO能夠溶解甲瓚結(jié)晶，使其形成均勻的溶液，便于后續(xù)檢測(cè)。將96孔板置于搖床上，以低速振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。隨后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過分析不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，從而確定5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的最佳抑制濃度和時(shí)間。例如，如果在某一濃度組合和作用時(shí)間下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于單藥組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則表明該組合可能具有協(xié)同抑制細(xì)胞增殖的作用。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法采用流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色、AnnexinV-FITC/PI雙染法等多種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以全面準(zhǔn)確地評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，藥物處理結(jié)束后，小心收集細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中。以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后以相同轉(zhuǎn)速離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向細(xì)胞沉淀中加入適量的結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育15分鐘。孵育過程中，AnnexinV-FITC可與凋亡早期細(xì)胞細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI則可穿透凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入400μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀通過檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），并計(jì)算各時(shí)期凋亡細(xì)胞的比例。Hoechst染色檢測(cè)時(shí)，將藥物處理后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼附在蓋玻片上。取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后將蓋玻片放入4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)固定下來。固定結(jié)束后，再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。向蓋玻片上滴加適量的Hoechst33342染色液，室溫下避光染色10分鐘。Hoechst33342是一種可以與DNA結(jié)合的熒光染料，能夠使細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以去除多余的染色液。將蓋玻片置于載玻片上，滴加一滴抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。正常細(xì)胞的細(xì)胞核染色均勻，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、核碎裂等典型的凋亡特征，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的操作步驟與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的染色步驟類似，但在染色結(jié)束后，將細(xì)胞懸液滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞呈綠色熒光（AnnexinV-FITC陰性、PI陰性），早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性），晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈橙紅色熒光（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）。通過觀察不同熒光顏色的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例，進(jìn)一步驗(yàn)證流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果。3.2.4凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、p53等的表達(dá)水平。藥物處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上裂解細(xì)胞30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使裂解液充分接觸細(xì)胞。裂解結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，以12000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心15分鐘，使細(xì)胞碎片和雜質(zhì)沉淀下來。取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將各樣本的蛋白濃度調(diào)整一致，加入適量的5×上樣緩沖液，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適的分離膠濃度。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫下封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗p53抗體等）的TBST溶液中，4℃孵育過夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。第二天，將PVDF膜從一抗溶液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體等）的TBST溶液中，室溫下孵育1小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1-2分鐘，使HRP催化化學(xué)發(fā)光試劑產(chǎn)生熒光信號(hào)。將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，通過分析條帶的灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，比較不同處理組中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。例如，如果聯(lián)合用藥組中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和單藥組，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組和單藥組，則表明聯(lián)合用藥可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。3.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過統(tǒng)計(jì)分析，明確不同處理組之間細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異，從而準(zhǔn)確評(píng)估5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。例如，在分析細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)時(shí)，若單因素方差分析結(jié)果顯示不同處理組之間存在顯著差異（P<0.05），進(jìn)一步通過LSD-t檢驗(yàn)比較各處理組與對(duì)照組之間的差異，確定哪些處理組對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，以及聯(lián)合用藥組與單藥組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分析細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平數(shù)據(jù)時(shí)，同樣采用上述統(tǒng)計(jì)方法，以揭示聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.15-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響運(yùn)用MTT法對(duì)不同處理組的乳腺癌細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看出，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，各處理組細(xì)胞的增殖抑制率均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。在單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶處理乳腺癌細(xì)胞時(shí)，當(dāng)藥物濃度為5μM，作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率僅為（15.2±2.1）%；隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別升高至（25.6±3.2）%和（38.5±4.5）%。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度增加到80μM時(shí)，作用24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到（32.4±3.8）%、（46.7±5.1）%和（62.3±6.5）%，表明5-氟尿嘧啶對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣處理細(xì)胞時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用相對(duì)較弱。在甲酰四氫葉酸鈣濃度為1μM，作用72小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率僅為（8.5±1.5）%；即使將濃度提高到16μM，作用72小時(shí)后的細(xì)胞增殖抑制率也僅為（18.6±2.8）%，與5-氟尿嘧啶單藥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果有限。在聯(lián)合用藥組中，不同濃度組合的5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣表現(xiàn)出了顯著的協(xié)同抑制細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為10μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為2μM時(shí)，聯(lián)合作用24小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（28.4±3.5）%，明顯高于相同濃度的5-氟尿嘧啶單藥組（18.2±2.5）%和甲酰四氫葉酸鈣單藥組（9.3±1.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別升高至（40.5±4.2）%和（55.6±5.8）%，協(xié)同增效作用更加顯著。在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，聯(lián)合作用72小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（78.5±7.2）%，遠(yuǎn)高于單藥組在相同條件下的抑制率，充分顯示出聯(lián)合用藥的優(yōu)勢(shì)。通過對(duì)不同濃度組合和作用時(shí)間下細(xì)胞增殖抑制率的分析，繪制出細(xì)胞增殖抑制曲線（圖2）。從曲線中可以直觀地看出，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制曲線始終位于單藥組之上，表明聯(lián)合用藥在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和不同濃度下，對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果均優(yōu)于單藥組。進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算聯(lián)合用藥的協(xié)同指數(shù)（CI）。當(dāng)CI<1時(shí)，表示兩藥具有協(xié)同作用；CI=1時(shí)，表示兩藥為相加作用；CI>1時(shí)，表示兩藥為拮抗作用。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中各聯(lián)合用藥組的CI值均小于1，證實(shí)了5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用。綜合考慮細(xì)胞增殖抑制率和協(xié)同指數(shù)，確定5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM，作用72小時(shí)為最佳的聯(lián)合用藥條件，在此條件下，聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果最為顯著，為后續(xù)的細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，5-氟尿嘧啶對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性；甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用較弱；5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，顯著增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，確定了最佳的聯(lián)合用藥濃度和作用時(shí)間。4.2聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響4.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果為深入探究5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了精確檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率僅為（3.2±0.5）%，處于較低水平，這表明在正常培養(yǎng)條件下，乳腺癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程較為緩慢。單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶處理細(xì)胞時(shí)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為20μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率升高至（15.6±2.1）%；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加到80μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（32.5±3.5）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明5-氟尿嘧啶能夠有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)作用與藥物濃度呈正相關(guān)。單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率雖有一定程度的升高，但變化相對(duì)較小。在甲酰四氫葉酸鈣濃度為16μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（8.7±1.2）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與5-氟尿嘧啶單藥組相比，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果明顯較弱。在聯(lián)合用藥組中，不同濃度組合的5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著高于單藥組。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（56.8±5.8）%，遠(yuǎn)高于相同濃度下5-氟尿嘧啶單藥組的（38.4±4.2）%和甲酰四氫葉酸鈣單藥組的（10.5±1.8）%，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分表明，5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，顯著增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步對(duì)不同處理組的細(xì)胞凋亡峰圖進(jìn)行分析（圖4），可以更直觀地觀察到聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。在空白對(duì)照組的凋亡峰圖中，凋亡峰幾乎不可見，說明凋亡細(xì)胞數(shù)量極少。5-氟尿嘧啶單藥組隨著藥物濃度的增加，凋亡峰逐漸明顯，且峰面積逐漸增大，表明凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。甲酰四氫葉酸鈣單藥組的凋亡峰變化相對(duì)不明顯。而在聯(lián)合用藥組的凋亡峰圖中，凋亡峰顯著增大，且位置向高凋亡率方向偏移，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥能夠顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且效果優(yōu)于單藥組。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，5-氟尿嘧啶能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性；甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用較弱；5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，顯著提高細(xì)胞凋亡率。4.2.2Hoechst染色結(jié)果利用Hoechst33342染色技術(shù)，對(duì)不同處理組的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，以進(jìn)一步分析聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖5所示。在空白對(duì)照組中，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，染色質(zhì)分布均勻，未出現(xiàn)明顯的凋亡特征，表明細(xì)胞處于正常的生理狀態(tài)。單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶處理細(xì)胞時(shí)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，出現(xiàn)了典型的凋亡特征。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為20μM時(shí)，部分細(xì)胞的細(xì)胞核開始出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化的現(xiàn)象，呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光，表明這些細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入凋亡早期。隨著藥物濃度升高到80μM，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞核進(jìn)一步濃縮，甚至出現(xiàn)核碎裂的現(xiàn)象，形成凋亡小體，這些凋亡小體也被染成明亮的藍(lán)色熒光，散落在細(xì)胞周圍。單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核形態(tài)變化相對(duì)不明顯，僅在高濃度（16μM）處理時(shí)，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象，但整體凋亡細(xì)胞數(shù)量較少。在聯(lián)合用藥組中，當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更為顯著。大量細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)濃縮、邊緣化和核碎裂，形成眾多凋亡小體，整個(gè)視野中充滿了明亮的藍(lán)色熒光，表明聯(lián)合用藥能夠協(xié)同誘導(dǎo)更多的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過對(duì)不同處理組凋亡細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析（圖6），結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的凋亡細(xì)胞比例僅為（2.8±0.4）%。5-氟尿嘧啶單藥組在濃度為80μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例升高至（30.5±3.2）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。甲酰四氫葉酸鈣單藥組在濃度為16μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例為（7.6±1.0）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但遠(yuǎn)低于5-氟尿嘧啶單藥組。聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例高達(dá)（53.6±5.5）%，顯著高于5-氟尿嘧啶單藥組和甲酰四氫葉酸鈣單藥組，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，Hoechst染色結(jié)果直觀地顯示了5-氟尿嘧啶能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著藥物濃度增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多；甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用較弱；5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠協(xié)同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，使更多細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步驗(yàn)證了流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果。4.2.3AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果采用AnnexinV-FITC/PI雙染法對(duì)不同處理組的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光染色情況，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，以明確聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響，結(jié)果如圖7所示。在熒光顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組的細(xì)胞主要呈現(xiàn)綠色熒光，表明大多數(shù)細(xì)胞為活細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，磷脂酰絲氨酸未外翻，處于正常的生理狀態(tài)。單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶處理細(xì)胞時(shí)，隨著藥物濃度的增加，出現(xiàn)了綠色熒光和橙紅色熒光的細(xì)胞。綠色熒光的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻，但細(xì)胞膜仍保持完整；橙紅色熒光的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜通透性增加，PI能夠進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為20μM時(shí)，可見少量早期凋亡細(xì)胞；當(dāng)濃度升高到80μM時(shí)，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量均明顯增多。單獨(dú)使用甲酰四氫葉酸鈣處理細(xì)胞時(shí)，僅在高濃度（16μM）處理時(shí)，可見極少數(shù)早期凋亡細(xì)胞，整體細(xì)胞熒光染色情況與空白對(duì)照組相似。在聯(lián)合用藥組中，當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，視野中大量細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光和橙紅色熒光，表明早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量均顯著增加。通過流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，得到細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖（圖8）。在散點(diǎn)圖中，左下象限代表活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-），右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）。對(duì)各象限細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖9），結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中活細(xì)胞比例高達(dá)（96.5±1.2）%，早期凋亡細(xì)胞比例為（2.0±0.3）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（1.5±0.2）%。5-氟尿嘧啶單藥組在濃度為80μM時(shí)，活細(xì)胞比例降至（63.2±4.5）%，早期凋亡細(xì)胞比例升高至（20.5±2.8）%，晚期凋亡細(xì)胞比例升高至（16.3±2.5）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。甲酰四氫葉酸鈣單藥組在濃度為16μM時(shí)，活細(xì)胞比例為（91.0±2.5）%，早期凋亡細(xì)胞比例為（5.6±0.8）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（3.4±0.5）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但早期和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯低于5-氟尿嘧啶單藥組。聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，活細(xì)胞比例降至（38.5±4.8）%，早期凋亡細(xì)胞比例升高至（35.6±4.2）%，晚期凋亡細(xì)胞比例升高至（25.9±3.8）%，顯著高于5-氟尿嘧啶單藥組和甲酰四氫葉酸鈣單藥組，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果表明，5-氟尿嘧啶能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生早期和晚期凋亡，且隨著藥物濃度增加，早期和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量均增多；甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞早期和晚期凋亡的誘導(dǎo)作用較弱；5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠協(xié)同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的早期和晚期凋亡，使更多細(xì)胞進(jìn)入凋亡進(jìn)程，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的顯著誘導(dǎo)作用。4.3聯(lián)合用藥對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為深入探討5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和p53的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示。從蛋白條帶圖中可以清晰地看到，與空白對(duì)照組相比，5-氟尿嘧啶單藥組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高；甲酰四氫葉酸鈣單藥組中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化相對(duì)較小。在聯(lián)合用藥組中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與5-氟尿嘧啶單藥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過對(duì)條帶灰度值的分析，計(jì)算出各處理組中Bcl-2和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量（圖11）。空白對(duì)照組中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.05），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.03）。5-氟尿嘧啶單藥組在濃度為80μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至（0.65±0.06），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至（0.68±0.05），與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。甲酰四氫葉酸鈣單藥組在濃度為16μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.90±0.05），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.42±0.04），與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至（0.32±0.04），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至（1.25±0.10），與5-氟尿嘧啶單藥組和甲酰四氫葉酸鈣單藥組相比，差異均具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Bcl-2/Bax比值能夠反映細(xì)胞凋亡的傾向，該比值降低，表明細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用增強(qiáng)?？瞻讓?duì)照組的Bcl-2/Bax比值為2.86，5-氟尿嘧啶單藥組在濃度為80μM時(shí)，Bcl-2/Bax比值降至0.96，甲酰四氫葉酸鈣單藥組在濃度為16μM時(shí)，Bcl-2/Bax比值為2.14，聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，Bcl-2/Bax比值降至0.26，聯(lián)合用藥組的Bcl-2/Bax比值顯著低于單藥組，進(jìn)一步說明聯(lián)合用藥能夠更有效地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。在p53蛋白表達(dá)方面，與空白對(duì)照組相比，5-氟尿嘧啶單藥組和甲酰四氫葉酸鈣單藥組中p53蛋白的表達(dá)水平均有所升高，但5-氟尿嘧啶單藥組的升高更為明顯。聯(lián)合用藥組中p53蛋白的表達(dá)水平顯著高于5-氟尿嘧啶單藥組和甲酰四氫葉酸鈣單藥組，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。空白對(duì)照組中p53蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.03），5-氟尿嘧啶單藥組在濃度為80μM時(shí)，p53蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至（0.62±0.07），甲酰四氫葉酸鈣單藥組在濃度為16μM時(shí)，p53蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.04），聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，p53蛋白的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)（1.05±0.12）。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，其表達(dá)上調(diào)可能通過激活下游的凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合用藥能夠顯著上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。綜上所述，5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠顯著調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和p53的表達(dá)水平。聯(lián)合用藥通過降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，升高Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，同時(shí)顯著上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，從而協(xié)同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，揭示了聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的部分分子機(jī)制。五、討論5.1聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡影響的分析本研究通過多種實(shí)驗(yàn)方法，全面深入地探究了5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出聯(lián)合用藥在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡方面具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。從細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，5-氟尿嘧啶單藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。這與5-氟尿嘧啶的作用機(jī)制相符，它能夠通過抑制胸苷酸合成酶的活性，阻斷DNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而甲酰四氫葉酸鈣單藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用相對(duì)較弱，這表明甲酰四氫葉酸鈣單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果有限。然而，當(dāng)5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合使用時(shí)，情況發(fā)生了顯著變化。不同濃度組合的聯(lián)合用藥均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，協(xié)同效應(yīng)更加明顯。在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM，作用72小時(shí)的條件下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（78.5±7.2）%，遠(yuǎn)高于單藥組在相同條件下的抑制率，充分顯示出聯(lián)合用藥在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖方面的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的協(xié)同誘導(dǎo)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，5-氟尿嘧啶單藥能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為80μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（32.5±3.5）%。甲酰四氫葉酸鈣單藥雖然也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但作用較弱，在濃度為16μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率僅為（8.7±1.2）%。而聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率高達(dá)（56.8±5.8）%，顯著高于單藥組，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明聯(lián)合用藥能夠更有效地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，促進(jìn)細(xì)胞死亡。Hoechst染色結(jié)果從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度直觀地展示了聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。在空白對(duì)照組中，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核染色均勻，未出現(xiàn)明顯的凋亡特征。5-氟尿嘧啶單藥處理后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化和核碎裂等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。甲酰四氫葉酸鈣單藥處理時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)不明顯。而在聯(lián)合用藥組中，大量細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)，細(xì)胞核濃縮、碎裂，形成眾多凋亡小體，整個(gè)視野中充滿了明亮的藍(lán)色熒光，表明聯(lián)合用藥能夠協(xié)同誘導(dǎo)更多的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析，也進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合用藥在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面的顯著效果。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果則詳細(xì)分析了聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響。在熒光顯微鏡下和流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，均顯示出5-氟尿嘧啶單藥能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生早期和晚期凋亡，且隨著藥物濃度增加，早期和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量均增多。甲酰四氫葉酸鈣單藥對(duì)細(xì)胞早期和晚期凋亡的誘導(dǎo)作用較弱。聯(lián)合用藥組在5-氟尿嘧啶濃度為40μM，甲酰四氫葉酸鈣濃度為8μM時(shí)，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量均顯著增加，活細(xì)胞比例明顯降低。這說明聯(lián)合用藥不僅能夠誘導(dǎo)更多的細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，還能促進(jìn)凋亡細(xì)胞從早期向晚期發(fā)展，加速細(xì)胞死亡進(jìn)程。綜上所述，5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡具有顯著的協(xié)同誘導(dǎo)作用，能夠更有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為乳腺癌的臨床化療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。5.2聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合用藥能夠協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從凋亡相關(guān)蛋白的角度來看，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax則是一種促凋亡蛋白，在凋亡信號(hào)的刺激下，Bax可以發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2/Bax比值明顯下降。這表明聯(lián)合用藥能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制與促進(jìn)的平衡，使細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展。具體來說，5-氟尿嘧啶可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，從而激活相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。甲酰四氫葉酸鈣則可能通過增強(qiáng)5-氟尿嘧啶的作用效果，進(jìn)一步強(qiáng)化這種對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的調(diào)控，從而協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中也發(fā)揮著重要作用。p53基因是一種廣泛存在于人體細(xì)胞中的抑癌基因，其編碼的p53蛋白具有多種生物學(xué)功能，其中在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，p53可以通過激活下游的凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等刺激時(shí)，p53蛋白被激活，其表達(dá)水平上調(diào)。激活的p53可以直接與Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，增加Bax蛋白的含量。同時(shí)，p53還可以抑制Bcl-2基因的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白的水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，聯(lián)合用藥組中p53蛋白的表達(dá)水平顯著高于單藥組和空白對(duì)照組。這說明聯(lián)合用藥能夠顯著上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，可能是因?yàn)?-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸鈣聯(lián)合作用，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的DNA造成了更嚴(yán)重的損傷，從而強(qiáng)烈激活了p53蛋白的表達(dá)。上調(diào)的p53蛋白通過激活下游的凋亡相關(guān)基因，進(jìn)一步促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡。從信號(hào)通路的角度分析，聯(lián)合用藥可能通過激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控中心，在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的效應(yīng)caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。如前所述，聯(lián)合用藥通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，使Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax可以形成同源二聚體并插入線粒體膜，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。同時(shí)，聯(lián)合用藥上調(diào)的p53蛋白也可以通過激活Bax基因的表達(dá)，間接促進(jìn)線粒體膜的通透性改變