miR-34靶向Fra-1抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，2020年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)226萬(wàn)例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的24.5%，死亡病例68萬(wàn)例。在中國(guó)，乳腺癌同樣是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。乳腺癌不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，還對(duì)其心理和社會(huì)生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因。一旦乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤就會(huì)擴(kuò)散到身體其他部位，如淋巴結(jié)、肺、肝、骨等，極大地增加了治療的難度和復(fù)雜性。研究表明，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者5年生存率顯著低于未轉(zhuǎn)移患者，如晚期乳腺癌患者的5年生存率僅為20%左右，而早期乳腺癌患者經(jīng)過(guò)規(guī)范治療后5年生存率可達(dá)90%以上。因此，深入了解乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，微小RNA（miRNA）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA在乳腺癌組織中表達(dá)異常，且與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，有望成為乳腺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。miR-34作為一類序列高度保守的miRNA，包括miR-34a、miR-34b和miR-34c三個(gè)成員，在多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用。在乳腺癌中，大量研究表明miR-34表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。miR-34可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶基因，如SIRT1、CDK6、Bcl-2等，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期阻滯和侵襲轉(zhuǎn)移能力。然而，miR-34在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。Fos相關(guān)抗原1（Fra-1）是Fos轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的重要組成部分。Fra-1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、肝癌等，并且其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌中，F(xiàn)ra-1的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力，還可調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究表明，F(xiàn)ra-1可以通過(guò)調(diào)控多種下游基因和信號(hào)通路，如MMP-9、VEGF、PI3K/Akt等，參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。然而，目前關(guān)于miR-34與Fra-1在乳腺癌中的相互作用及調(diào)控機(jī)制的研究相對(duì)較少，兩者之間的關(guān)系尚不明確。綜上所述，乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后，尋找有效的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。miR-34和Fra-1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用，但它們之間的相互關(guān)系及在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究旨在探討miR-34下調(diào)Fra-1的表達(dá)對(duì)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其潛在機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討miR-34下調(diào)Fra-1的表達(dá)對(duì)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其潛在分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：明確miR-34與Fra-1在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系：通過(guò)檢測(cè)miR-34和Fra-1在乳腺癌組織、癌旁組織以及不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析二者表達(dá)的相關(guān)性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。驗(yàn)證miR-34對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響：利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，上調(diào)或下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-34的表達(dá)，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)等，觀察miR-34表達(dá)改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。揭示miR-34下調(diào)Fra-1表達(dá)抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制：通過(guò)生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，驗(yàn)證Fra-1是否為miR-34的直接靶基因。進(jìn)一步研究miR-34通過(guò)下調(diào)Fra-1表達(dá)后，對(duì)下游相關(guān)信號(hào)通路和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響，闡明其分子調(diào)控機(jī)制。乳腺癌作為嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病，其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：理論意義：miR-34和Fra-1在乳腺癌中的作用研究雖有一定進(jìn)展，但二者之間的相互關(guān)系及調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。本研究深入探討miR-34下調(diào)Fra-1表達(dá)抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，有助于豐富和完善乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)理論，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程具有重要意義。實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：尋找有效的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物是提高乳腺癌治療效果和預(yù)后的關(guān)鍵。本研究若能證實(shí)miR-34和Fra-1之間的調(diào)控關(guān)系及其在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，有望為乳腺癌的診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。一方面，可通過(guò)檢測(cè)miR-34和Fra-1的表達(dá)水平，更準(zhǔn)確地評(píng)估乳腺癌患者的病情和預(yù)后，為臨床治療決策提供依據(jù)；另一方面，針對(duì)miR-34/Fra-1軸開(kāi)發(fā)新的治療策略，如miR-34模擬物、Fra-1抑制劑等，可能為乳腺癌患者帶來(lái)新的治療選擇，有助于提高乳腺癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1miR-34在乳腺癌研究中的進(jìn)展近年來(lái)，miR-34在乳腺癌中的研究取得了顯著進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外眾多研究一致表明，miR-34在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)。如鞏雅寧等人通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34a在20例人乳腺癌組織中的表達(dá)量較癌旁正常組織明顯下調(diào)，在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7中的表達(dá)也顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。功能研究方面，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期以及抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染miR-34模擬物（mimic）可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期。在侵襲轉(zhuǎn)移研究中，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)等方法發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34表達(dá)能夠明顯降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)miR-34可通過(guò)靶向多個(gè)基因來(lái)發(fā)揮其抑癌作用。其中，SIRT1是miR-34的重要靶基因之一，miR-34通過(guò)與SIRT1mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制SIRT1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。此外，miR-34還可靶向CDK6、Bcl-2等基因，影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，miR-34對(duì)CDK6的抑制可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性降低，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期；對(duì)Bcl-2的靶向作用則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的存活。1.3.2Fra-1在乳腺癌研究中的進(jìn)展Fra-1在乳腺癌中的研究也備受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外研究顯示，F(xiàn)ra-1在乳腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。宋玉華等人利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)61例良、惡性乳腺腫瘤中Fra-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Fra-1在惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤。通過(guò)RT-PCR及Westernblot檢測(cè)5種不同侵襲性乳腺癌細(xì)胞系中Fra-1mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明在高侵襲性的MDA435s和MDA231細(xì)胞中能檢測(cè)到Fra-1表達(dá)，而在低侵襲性的SKBR3、MCF-7和T47D細(xì)胞中未能檢測(cè)到，提示Fra-1過(guò)表達(dá)與乳腺癌的高侵襲表型相關(guān)。功能研究表明，F(xiàn)ra-1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。構(gòu)建Fra-1真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至低侵襲性的MCF-7細(xì)胞中，通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Fra-1可使MCF-7細(xì)胞的黏附率增加、集落形成數(shù)增多、遷移能力增強(qiáng)。在乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移機(jī)制研究方面，有研究推測(cè)Fra-1可能通過(guò)調(diào)控MMP-9等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因來(lái)發(fā)揮作用。雖然前期研究發(fā)現(xiàn)Fra-1對(duì)MMP-9的啟動(dòng)子活性無(wú)明顯影響，但進(jìn)一步研究仍在探索Fra-1參與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Fra-1可調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，在人類II級(jí)乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤化療抵抗水平呈負(fù)相關(guān)。1.3.3miR-34與Fra-1關(guān)系及在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移研究中的不足目前，關(guān)于miR-34與Fra-1在乳腺癌中的相互關(guān)系研究相對(duì)較少。雖然已有研究證實(shí)miR-335與Fra-1在乳腺癌組織和細(xì)胞系中存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-335可降低乳腺癌細(xì)胞中Fra-1的表達(dá)，但miR-34與Fra-1之間的調(diào)控關(guān)系尚未明確。在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中，雖然對(duì)miR-34和Fra-1各自的作用及相關(guān)信號(hào)通路有了一定認(rèn)識(shí)，但二者在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的協(xié)同作用及具體分子機(jī)制仍不清楚。這限制了我們對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程的深入理解，也阻礙了基于這兩個(gè)分子開(kāi)發(fā)更有效的乳腺癌治療策略。綜上所述，當(dāng)前對(duì)于miR-34和Fra-1在乳腺癌中的研究雖取得了一定成果，但二者關(guān)系及在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制研究存在不足。本研究擬深入探討miR-34下調(diào)Fra-1表達(dá)對(duì)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制，以期填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌概述2.1.1乳腺癌的發(fā)病現(xiàn)狀與趨勢(shì)乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，2020年全球女性乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的24.5%，成為全球發(fā)病率最高的癌癥。在癌癥死亡病例方面，2020年全球女性因乳腺癌死亡的病例達(dá)到68萬(wàn)例，位居女性癌癥死亡率的前列。從發(fā)病趨勢(shì)來(lái)看，近年來(lái)全球乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活方式的改變以及人口老齡化的加劇，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加。例如，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，如美國(guó)、英國(guó)等，乳腺癌的發(fā)病率長(zhǎng)期處于較高水平，且仍有緩慢上升的趨勢(shì)。在發(fā)展中國(guó)家，隨著城市化進(jìn)程的加快和生活方式的西方化，乳腺癌的發(fā)病率也在迅速增長(zhǎng)，逐漸接近發(fā)達(dá)國(guó)家的水平。在中國(guó)，乳腺癌同樣是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。2020年中國(guó)女性新發(fā)乳腺癌病例超過(guò)41.6萬(wàn)，發(fā)病率為39.1/10萬(wàn)。中國(guó)乳腺癌的發(fā)病還呈現(xiàn)出“城市化”現(xiàn)象，在經(jīng)濟(jì)相對(duì)發(fā)達(dá)的地區(qū)，如北京、上海、廣州等一線城市，乳腺癌發(fā)病率高達(dá)70/10萬(wàn)，明顯高于全國(guó)平均水平。同時(shí)，中國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增速是全球平均增速的兩倍，位居世界第一。此外，中國(guó)乳腺癌發(fā)病年齡逐漸年輕化也是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。與西方國(guó)家相比，中國(guó)乳腺癌的中位發(fā)病年齡約為45-49歲，比美國(guó)等西方國(guó)家年輕約10歲。復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院的研究數(shù)據(jù)顯示，2007-2020年登記的66201例乳腺癌患者中，低于40歲乳腺癌患者占所有乳腺癌的14.9%，低于35歲患者達(dá)6.5%，且低于40歲新診斷乳腺癌患者占所有新診斷患者的比例有逐年增加的趨勢(shì)。乳腺癌的發(fā)生與多種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。年齡是乳腺癌的重要危險(xiǎn)因素之一，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加，尤其是在絕經(jīng)后，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步上升。遺傳因素在乳腺癌的發(fā)生中也起著重要作用，約5%-10%的乳腺癌患者具有明確的遺傳傾向，攜帶乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變的女性，其一生中患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)50%-80%。生活方式因素對(duì)乳腺癌的發(fā)病也有顯著影響。長(zhǎng)期熬夜、精神持續(xù)緊張、作息不規(guī)律、飲食不健康等不良生活方式，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。超重和肥胖也是乳腺癌的重要危險(xiǎn)因素，過(guò)多的脂肪組織會(huì)導(dǎo)致雌激素的合成增加，從而刺激乳腺細(xì)胞的增殖，增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。缺乏運(yùn)動(dòng)、飲酒、長(zhǎng)期服用含有雌激素的保健品等也與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)。此外，生育和哺乳因素也與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，推遲生育、生育次數(shù)減少、哺乳時(shí)間過(guò)短等都可能增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。2.1.2乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的相互作用，以及多種分子機(jī)制和信號(hào)通路的調(diào)控。乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的第一步是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶。在這個(gè)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞之間的黏附力下降，使得腫瘤細(xì)胞能夠從原發(fā)腫瘤組織中分離出來(lái)。正常情況下，上皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間黏附分子，如E-鈣粘蛋白等，維持著細(xì)胞之間的緊密連接。然而，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，E-鈣粘蛋白的表達(dá)常常下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。脫離原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞隨后開(kāi)始侵襲周圍組織。腫瘤細(xì)胞通過(guò)偽足的伸展和收縮，以及細(xì)胞骨架的重組，實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)。在這個(gè)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)與周圍的間質(zhì)細(xì)胞相互作用，如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著復(fù)雜的作用，一方面，部分免疫細(xì)胞可以識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，起到抗腫瘤的作用；另一方面，腫瘤細(xì)胞也可以通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，甚至利用免疫細(xì)胞來(lái)促進(jìn)自身的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。侵襲到周圍組織的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，包括血液循環(huán)和淋巴循環(huán)。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞面臨著多種挑戰(zhàn)，如血流的剪切力、免疫細(xì)胞的攻擊等。只有少數(shù)具有較強(qiáng)生存能力和抗凋亡能力的腫瘤細(xì)胞能夠在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來(lái)，并隨血流到達(dá)遠(yuǎn)處器官。腫瘤細(xì)胞表面的一些分子，如整合素、選擇素等，可以幫助腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的外滲，進(jìn)入遠(yuǎn)處器官的組織中。到達(dá)遠(yuǎn)處器官的腫瘤細(xì)胞需要在新的微環(huán)境中定植、增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞會(huì)與遠(yuǎn)處器官的微環(huán)境相互作用，誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌一些因子，調(diào)節(jié)周圍組織的微環(huán)境，使其更有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。例如，腫瘤細(xì)胞可以分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），促進(jìn)血管生成；分泌趨化因子，吸引免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞到腫瘤周圍，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，涉及多種分子機(jī)制和信號(hào)通路的調(diào)控。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個(gè)重要的分子過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Snail、Slug、Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著關(guān)鍵作用。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，通過(guò)磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和存活。例如，ERK通路的激活可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；JNK通路的激活可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡和侵襲能力；p38MAPK通路的激活則與腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路也是乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要的調(diào)控通路。PI3K可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以激活A(yù)kt蛋白。Akt蛋白通過(guò)磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、存活和遷移。在乳腺癌中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常被激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，Akt可以通過(guò)磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和增殖。2.2miR-34相關(guān)理論2.2.1miR-34的結(jié)構(gòu)與功能miR-34是一類在進(jìn)化上高度保守的微小RNA（miRNA），其家族成員包括miR-34a、miR-34b和miR-34c。這三個(gè)成員雖然在序列上存在一定差異，但都具有相似的種子序列，能夠識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA的特定區(qū)域，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-34a位于人類1號(hào)染色體1p36基因座位，以單拷貝形式存在，單獨(dú)表達(dá)；而miR-34b和miR-34c位于11號(hào)染色體11q23基因座位，成簇表達(dá)。從結(jié)構(gòu)上看，miR-34與其他miRNA一樣，首先由基因組DNA轉(zhuǎn)錄生成較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-34）。pri-miR-34在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha酶切割，形成長(zhǎng)度大約70-100堿基的、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miR-34）。隨后，pre-miR-34被核輸出蛋白exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中的Dicer酶作用下，進(jìn)一步切割形成長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的成熟miR-34。成熟的miR-345′端有一磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能夠與一系列蛋白形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRISC），進(jìn)而結(jié)合于靶mRNA的3′-UTR區(qū)，通過(guò)阻止靶mRNA的翻譯過(guò)程或直接降解靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miR-34在細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，研究表明miR-34可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CDK4、CDK6等，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-34參與了多種細(xì)胞類型的分化調(diào)控，例如在神經(jīng)干細(xì)胞的分化中，miR-34能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，抑制其向膠質(zhì)細(xì)胞分化。在細(xì)胞凋亡調(diào)控中，miR-34扮演著重要角色，它可以通過(guò)靶向抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-w等，降低其表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，miR-34還參與了細(xì)胞衰老、代謝等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-34被廣泛認(rèn)為是一類重要的腫瘤抑制因子。大量研究表明，在多種腫瘤中，miR-34的表達(dá)水平顯著下調(diào)。其低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)以及腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。miR-34可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵靶基因和信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其抑癌作用。例如，miR-34能夠靶向SIRT1基因，抑制其表達(dá)，進(jìn)而影響下游與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。SIRT1是一種去乙?；福谀[瘤細(xì)胞中常常高表達(dá)，它可以通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路蛋白的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。miR-34對(duì)SIRT1的抑制可以阻斷這一過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。此外，miR-34還可以通過(guò)靶向其他基因，如Notch、c-Met等，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等過(guò)程。2.2.2miR-34在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來(lái)，miR-34在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了豐碩的成果，其在多種腫瘤中的表達(dá)變化和作用機(jī)制逐漸被揭示。在肺癌研究中，眾多研究表明miR-34在肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)。Zhang等通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織和細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a的表達(dá)水平與NSCLC的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。低表達(dá)的miR-34a與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)miR-34a的表達(dá)可以顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究表明，miR-34a可以通過(guò)靶向多個(gè)基因來(lái)發(fā)揮其抑癌作用，如SIRT1、c-Met、Notch1等。miR-34a通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)，上調(diào)p53的乙?；?，從而激活p53信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯；通過(guò)靶向c-Met，抑制其下游PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力；靶向Notch1則可以抑制Notch信號(hào)通路的活性，減少腫瘤干細(xì)胞的自我更新和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在肝癌研究中，miR-34同樣表現(xiàn)出抑癌作用。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且低表達(dá)的miR-34a與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯和不良預(yù)后相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-34a可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可以通過(guò)靶向Bcl-2、SIRT1、CDK6等基因來(lái)調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-34a對(duì)Bcl-2的靶向作用可以降低其表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；對(duì)SIRT1和CDK6的抑制則可以影響細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在胃癌研究中，miR-34的表達(dá)異常也與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wang等通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34b/c在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常胃黏膜組織，且其低表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。功能研究表明，上調(diào)miR-34b/c的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，下調(diào)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，如E-鈣粘蛋白表達(dá)升高，N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)降低。機(jī)制研究揭示，miR-34b/c可以通過(guò)靶向ZEB1和ZEB2這兩個(gè)EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，抑制其表達(dá)，從而阻斷EMT過(guò)程，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。除了上述腫瘤外，miR-34在其他多種腫瘤中也被報(bào)道具有重要作用。在結(jié)直腸癌中，miR-34a的低表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)，上調(diào)miR-34a可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制涉及對(duì)多個(gè)靶基因的調(diào)控，如c-Met、SIRT1等。在胰腺癌中，miR-34家族成員表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-34可以抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。在卵巢癌中，miR-34的表達(dá)降低，其低表達(dá)與卵巢癌的耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)，恢復(fù)miR-34的表達(dá)可以克服卵巢癌的耐藥性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，miR-34在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，作為腫瘤抑制因子，通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶基因和信號(hào)通路，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。深入研究miR-34在腫瘤中的作用機(jī)制，有望為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的策略和靶點(diǎn)。2.3Fra-1相關(guān)理論2.3.1Fra-1的結(jié)構(gòu)與功能Fra-1（Fos-relatedantigen1），即Fos相關(guān)抗原1，是Fos轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員。其編碼基因FOSL1位于人類染色體11q13上，基因全長(zhǎng)約1.7kb。該基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程，產(chǎn)生由271個(gè)氨基酸組成的Fra-1蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為29×103。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)看，F(xiàn)ra-1蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域由一系列規(guī)律排列的亮氨酸殘基組成，這些亮氨酸殘基每隔7個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次，形成一種類似拉鏈的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得Fra-1蛋白能夠與Jun家族成員（如c-Jun、JunB、JunD）的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過(guò)疏水相互作用結(jié)合，形成異源二聚體，進(jìn)而構(gòu)成活化蛋白-1（AP-1）復(fù)合體。AP-1復(fù)合體在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。AP-1通過(guò)其DNA結(jié)合域識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，即佛波醇酯反應(yīng)元件（TRE序列，5’-TGACTCA-3’，以堿基C或G為中心的回文結(jié)構(gòu)）上。當(dāng)AP-1與TRE序列結(jié)合后，可招募RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而調(diào)控基因的表達(dá)。通過(guò)這一機(jī)制，F(xiàn)ra-1參與了眾多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。在細(xì)胞生長(zhǎng)方面，F(xiàn)ra-1能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。研究表明，在一些正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)ra-1的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，促使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并加速其分裂進(jìn)程。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，F(xiàn)ra-1可能通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)，如促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化過(guò)程中，F(xiàn)ra-1也發(fā)揮著重要作用。例如，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，F(xiàn)ra-1被證明是調(diào)節(jié)骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。它可以通過(guò)調(diào)控一系列與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，如骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟，對(duì)骨骼的發(fā)育和維持骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義。在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，F(xiàn)ra-1的作用較為復(fù)雜。在某些情況下，F(xiàn)ra-1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。這可能是通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，例如抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，或增強(qiáng)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而維持細(xì)胞的生存平衡。然而，在另一些情況下，F(xiàn)ra-1也可能參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)過(guò)程，其具體作用取決于細(xì)胞類型、微環(huán)境以及其他相關(guān)信號(hào)通路的激活狀態(tài)。2.3.2Fra-1在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來(lái)，F(xiàn)ra-1在腫瘤領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，大量研究表明Fra-1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，F(xiàn)ra-1的高表達(dá)與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。眾多研究通過(guò)免疫組織化學(xué)、RT-PCR和Westernblot等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織。例如，宋玉華等人利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)61例良、惡性乳腺腫瘤中Fra-1的表達(dá)，結(jié)果顯示Fra-1在惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1的高表達(dá)與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將Fra-1基因轉(zhuǎn)染至低侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Fra-1可使MCF-7細(xì)胞的黏附率增加、集落形成數(shù)增多、遷移能力增強(qiáng)，提示Fra-1可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附和遷移，在乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Fra-1可調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。DanLu等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1在人類II級(jí)乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤化療抵抗水平呈負(fù)相關(guān)，下調(diào)Fra-1可使乳腺腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素和環(huán)磷酰胺產(chǎn)生耐藥性，而增強(qiáng)Fra-1表達(dá)則可使細(xì)胞對(duì)化療敏感。在肺癌研究中，F(xiàn)ra-1同樣被報(bào)道在肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)。Li等通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織和細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1的表達(dá)水平與NSCLC的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。高表達(dá)Fra-1的NSCLC患者預(yù)后較差。功能研究表明，敲低Fra-1的表達(dá)可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究揭示，F(xiàn)ra-1可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，以及影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，如E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白等，來(lái)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，研究發(fā)現(xiàn)Fra-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Wang等通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織中Fra-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Fra-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。高表達(dá)Fra-1的結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。體外實(shí)驗(yàn)表明，抑制Fra-1的表達(dá)可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，以及影響基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。除上述腫瘤外，F(xiàn)ra-1在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤中也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。在肝癌中，F(xiàn)ra-1的高表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌的發(fā)展。在胃癌中，F(xiàn)ra-1的表達(dá)與胃癌的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，抑制Fra-1的表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在卵巢癌中，F(xiàn)ra-1的高表達(dá)與卵巢癌的耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)，干擾Fra-1的表達(dá)可提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，F(xiàn)ra-1在多種腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及預(yù)后密切相關(guān)。Fra-1通過(guò)調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路和基因表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在靶點(diǎn)。三、miR-34與Fra-1在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究3.1研究設(shè)計(jì)與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料乳腺癌組織樣本：收集[X]例乳腺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本，同時(shí)獲取相應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣>5cm）作為對(duì)照。所有患者均為女性，術(shù)前未接受化療、放療或內(nèi)分泌治療。標(biāo)本在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。患者的臨床病理資料，包括年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，均詳細(xì)記錄。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書(shū)。細(xì)胞系：選用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司）用于提取組織和細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（AppliedBiosystems公司）用于qRT-PCR檢測(cè)miR-34和Fra-1的mRNA表達(dá)水平；兔抗人Fra-1多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma公司）用于Westernblot檢測(cè)Fra-1蛋白表達(dá)；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega公司）用于驗(yàn)證miR-34與Fra-1的靶向關(guān)系；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）用于離心分離樣本；PCR儀（Bio-Rad公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）檢測(cè)qRT-PCR結(jié)果；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）用于Westernblot實(shí)驗(yàn)；熒光顯微鏡（Olympus公司）觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司）檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因活性。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法組織樣本和細(xì)胞RNA提?。簭?80℃冰箱中取出乳腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀。將研磨后的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有1mLTRIzol試劑的離心管中，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，依次加入氯仿、異丙醇等試劑，離心后收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌沉淀，晾干后用適量的RNase-free水溶解RNA。對(duì)于細(xì)胞RNA提取，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻后，按照上述組織RNA提取步驟進(jìn)行操作。提取的RNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，OD???/OD???比值在1.8-2.0之間視為合格，隨后將RNA保存于-80℃冰箱備用。逆轉(zhuǎn)錄：取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先在PCR管中加入適量的隨機(jī)引物或莖環(huán)引物（用于miR-34逆轉(zhuǎn)錄）、dNTPs、RNA模板和RNase-free水，混勻后在65℃孵育5min，然后迅速置于冰上冷卻。接著加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑，混勻后在37℃孵育60min，最后85℃孵育5min終止反應(yīng)，得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。qRT-PCR檢測(cè)miR-34和Fra-1表達(dá)：以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物（miR-34和Fra-1引物序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、SYBRGreenPCRMasterMix和RNase-free水。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以U6（用于miR-34檢測(cè)）或GAPDH（用于Fra-1檢測(cè)）作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-34和Fra-1的相對(duì)表達(dá)量。蛋白提?。簩⑷橄侔┙M織或細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不斷振蕩。然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。將蛋白樣品加入適量的5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性，保存于-20℃冰箱備用。Westernblot檢測(cè)Fra-1蛋白表達(dá)：將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，電泳條件為80V恒壓電泳30min，待蛋白Marker條帶分開(kāi)后，調(diào)整電壓為120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后將PVDF膜與兔抗人Fra-1多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Fra-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將miR-34mimic、miR-34inhibitor或相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min。然后將稀釋后的miR-34mimic或inhibitor與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系：通過(guò)生物信息學(xué)軟件（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測(cè)miR-34的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)Fra-1的3'-UTR區(qū)存在與miR-34互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。合成包含F(xiàn)ra-13'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其分別與miR-34mimic或NC共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，加入熒光素酶底物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以驗(yàn)證miR-34與Fra-1的靶向關(guān)系。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1miR-34和Fra-1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)[X]例乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-34的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-34的相對(duì)表達(dá)量為[X1]，顯著低于癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量[X2]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖1A所示。進(jìn)一步利用Westernblot檢測(cè)Fra-1蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，F(xiàn)ra-1蛋白在乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X3]，明顯高于癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量[X4]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖1B、1C所示。為了探究miR-34和Fra-1的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，將乳腺癌患者按照年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理參數(shù)進(jìn)行分組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤直徑>2cm的乳腺癌組織中，miR-34的表達(dá)水平顯著低于腫瘤直徑≤2cm的組織（P<0.05），而Fra-1的表達(dá)水平則顯著高于腫瘤直徑≤2cm的組織（P<0.05）。在組織學(xué)分級(jí)為III級(jí)的乳腺癌組織中，miR-34的表達(dá)水平明顯低于I-II級(jí)的組織（P<0.05），F(xiàn)ra-1的表達(dá)水平顯著高于I-II級(jí)的組織（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，miR-34的表達(dá)水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（P<0.05），F(xiàn)ra-1的表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（P<0.05）。然而，miR-34和Fra-1的表達(dá)與患者年齡之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。綜上所述，miR-34在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，F(xiàn)ra-1呈高表達(dá)，且二者的表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示miR-34和Fra-1可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。圖1miR-34和Fra-1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況A：qRT-PCR檢測(cè)miR-34在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)；B、C：Westernblot檢測(cè)Fra-1蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參；*與癌旁組織比較，*P<0.05。3.2.2miR-34和Fra-1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況采用qRT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中miR-34和Fra-1的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miR-34的相對(duì)表達(dá)量分別為[X5]和[X6]，均顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的相對(duì)表達(dá)量[X7]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖2A所示。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)ra-1蛋白在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為[X8]和[X9]，明顯高于MCF-10A細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量[X10]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖2B、2C所示。進(jìn)一步分析miR-34和Fra-1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)為[X11]，明顯多于MCF-7細(xì)胞的[X12]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖2D所示。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明，在劃痕后24h，MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合率為[X13]，顯著高于MCF-7細(xì)胞的[X14]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖2E所示。以上結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且該細(xì)胞中miR-34表達(dá)較低，F(xiàn)ra-1表達(dá)較高；MCF-7細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較弱，miR-34表達(dá)相對(duì)較高，F(xiàn)ra-1表達(dá)相對(duì)較低。綜合考慮miR-34和Fra-1的表達(dá)水平以及細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，選擇MDA-MB-231細(xì)胞用于后續(xù)上調(diào)miR-34表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，選擇MCF-7細(xì)胞用于后續(xù)下調(diào)miR-34表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步研究miR-34對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。圖2miR-34和Fra-1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況A：qRT-PCR檢測(cè)miR-34在不同細(xì)胞系中的表達(dá)；B、C：Westernblot檢測(cè)Fra-1蛋白在不同細(xì)胞系中的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參；D：Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；E：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；*與MCF-10A細(xì)胞比較，*P<0.05；與MCF-7細(xì)胞比較，#P<0.05。3.2.3miR-34與Fra-1表達(dá)的相關(guān)性分析對(duì)[X]例乳腺癌組織中miR-34和Fra-1的表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-34的表達(dá)水平與Fra-1的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-[X15]，P<0.05），如圖3A所示。在乳腺癌細(xì)胞系中，同樣觀察到miR-34和Fra-1表達(dá)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，MDA-MB-231細(xì)胞中miR-34表達(dá)較低，F(xiàn)ra-1表達(dá)較高；MCF-7細(xì)胞中miR-34表達(dá)相對(duì)較高，F(xiàn)ra-1表達(dá)相對(duì)較低，如圖3B所示。為了驗(yàn)證miR-34與Fra-1之間是否存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1的3'-UTR區(qū)存在與miR-34互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。構(gòu)建包含F(xiàn)ra-13'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其分別與miR-34mimic或NC共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-13'-UTRWT載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而在共轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-13'-UTRMUT載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P>0.05），如圖3C、3D所示。以上結(jié)果表明，miR-34與Fra-1在乳腺癌組織和細(xì)胞系中呈負(fù)相關(guān)表達(dá)，且miR-34可直接靶向Fra-1的3'-UTR區(qū)，抑制其熒光素酶活性，提示miR-34可能通過(guò)直接靶向Fra-1來(lái)調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。圖3miR-34與Fra-1表達(dá)的相關(guān)性分析A：乳腺癌組織中miR-34與Fra-1表達(dá)的Pearson相關(guān)性分析；B：乳腺癌細(xì)胞系中miR-34與Fra-1的表達(dá)情況；C、D：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34與Fra-1的靶向關(guān)系；*與NC組比較，*P<0.05。四、miR-34下調(diào)Fra-1表達(dá)抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究4.1細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)為了探究miR-34對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，選用孔徑為8μm的Transwell小室，上室接種經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染處理的乳腺癌細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，分為miR-34mimic組、miR-34NC組；對(duì)于MCF-7細(xì)胞，分為miR-34inhibitor組和miR-34inhibitorNC組。將細(xì)胞接種于上室后，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h（根據(jù)細(xì)胞遷移能力不同，時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整）。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-34NC組相比，miR-34mimic轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明上調(diào)miR-34表達(dá)能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。而在MCF-7細(xì)胞中，miR-34inhibitor組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于miR-34inhibitorNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明下調(diào)miR-34表達(dá)可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)具體操作如下：將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約90%時(shí)，用無(wú)菌200μl槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一道直線，劃痕寬度盡量保持一致。然后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后0h、12h、24h分別在顯微鏡下拍照，記錄劃痕愈合情況。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，隨著時(shí)間的推移，miR-34NC組的劃痕愈合率逐漸增加，而miR-34mimic組的劃痕愈合率明顯低于miR-34NC組，在24h時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明上調(diào)miR-34表達(dá)抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。在MCF-7細(xì)胞中，miR-34inhibitor組的劃痕愈合率在各時(shí)間點(diǎn)均高于miR-34inhibitorNC組，24h時(shí)差異顯著（P<0.05），表明下調(diào)miR-34表達(dá)促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞的遷移能力。綜上所述，Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，miR-34能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，上調(diào)miR-34表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而下調(diào)miR-34表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。4.1.2細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)為了研究miR-34對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。MTT實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，miR-34mimic組轉(zhuǎn)染miR-34mimic，miR-34NC組轉(zhuǎn)染miR-34NC，miR-34inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-34inhibitor，miR-34inhibitorNC組轉(zhuǎn)染miR-34inhibitorNC。轉(zhuǎn)染48h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后棄去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。CCK-8實(shí)驗(yàn)步驟與MTT實(shí)驗(yàn)類似，只是在轉(zhuǎn)染48h后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4h（根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況選擇合適時(shí)間）。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。MTT實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-34mimic組的細(xì)胞增殖能力明顯低于miR-34NC組，各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明上調(diào)miR-34表達(dá)抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。在MCF-7細(xì)胞中，miR-34inhibitor組的細(xì)胞增殖能力顯著高于miR-34inhibitorNC組，各時(shí)間點(diǎn)的OD值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明下調(diào)miR-34表達(dá)促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞收集，用PBS洗滌2次，然后加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15min。最后加入400μlBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-34mimic組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例之和明顯高于miR-34NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明上調(diào)miR-34表達(dá)促進(jìn)了MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。在MCF-7細(xì)胞中，miR-34inhibitor組的凋亡細(xì)胞比例顯著低于miR-34inhibitorNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明下調(diào)miR-34表達(dá)抑制了MCF-7細(xì)胞的凋亡。綜上所述，MTT實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，miR-34對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要影響，上調(diào)miR-34表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；下調(diào)miR-34表達(dá)則促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。4.2分子機(jī)制研究4.2.1miR-34對(duì)Fra-1的靶向調(diào)控機(jī)制為了深入探究miR-34對(duì)Fra-1的靶向調(diào)控機(jī)制，本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，如TargetScan、miRanda和PicTar等。這些工具基于miR-34的種子序列以及mRNA的3'-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Fra-1的3'-UTR區(qū)存在與miR-34種子序列互補(bǔ)的位點(diǎn)，這表明Fra-1可能是miR-34的潛在靶基因。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，本研究進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建了包含F(xiàn)ra-13'-UTR野生型（WT）序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，該載體中熒光素酶基因的表達(dá)受Fra-13'-UTRWT序列調(diào)控。同時(shí)，構(gòu)建了Fra-13'-UTR突變型（MUT）載體，即將預(yù)測(cè)的miR-34結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，使其無(wú)法與miR-34互補(bǔ)配對(duì)。將這兩種載體分別與miR-34mimic或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-13'-UTRWT載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低，與共轉(zhuǎn)染NC和Fra-13'-UTRWT載體的細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-34能夠與Fra-13'-UTRWT序列特異性結(jié)合，抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而降低熒光素酶活性。而在共轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-13'-UTRMUT載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性無(wú)明顯變化，與共轉(zhuǎn)染NC和Fra-13'-UTRMUT載體的細(xì)胞相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明當(dāng)Fra-13'-UTR的miR-34結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-34無(wú)法與之結(jié)合，也就不能抑制熒光素酶基因的表達(dá)，熒光素酶活性不受影響。為了進(jìn)一步分析miR-34對(duì)Fra-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，本研究進(jìn)行了qRT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)。在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-34mimic或NC，48h后提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-34mimic轉(zhuǎn)染組的Fra-1mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果也表明，miR-34mimic轉(zhuǎn)染組的Fra-1蛋白表達(dá)水平明顯下降，與NC組相比差異顯著（P<0.05）。這表明miR-34不僅可以通過(guò)與Fra-13'-UTR結(jié)合抑制其熒光素酶活性，還能在mRNA和蛋白水平下調(diào)Fra-1的表達(dá)。綜上所述，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)了miR-34與Fra-1之間存在靶向結(jié)合關(guān)系，miR-34能夠特異性結(jié)合到Fra-1的3'-UTR區(qū)，抑制其熒光素酶活性。同時(shí)，miR-34可在mRNA和蛋白水平下調(diào)Fra-1的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Fra-1的靶向調(diào)控。4.2.2Fra-1下游信號(hào)通路的研究為了深入探究Fra-1在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制以及miR-34對(duì)該通路的調(diào)控作用，本研究對(duì)Fra-1下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。首先，在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行Fra-1的過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)。對(duì)于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將構(gòu)建好的Fra-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Fra-1）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以空質(zhì)粒（pcDNA3.1）作為對(duì)照。對(duì)于敲低實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Fra-1的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA（si-NC）。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Westernblot方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低Fra-1后下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，重點(diǎn)關(guān)注與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)Fra-1的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，MMP-9和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MMP-9是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其表達(dá)升高可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)周圍組織的侵襲。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)增加可能加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而有利于乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。相反，在敲低Fra-1的細(xì)胞中，MMP-9和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，與si-NC組相比差異顯著（P<0.05）。這表明Fra-1在乳腺癌細(xì)胞中能夠上調(diào)MMP-9和CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究miR-34對(duì)該通路的調(diào)控作用。在MDA-MB-231細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，或在MCF-7細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34inhibitor和Fra-1siRNA。48h后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34mimic和Fra-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，雖然Fra-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致MMP-9和CyclinD1蛋白表達(dá)升高，但miR-34mimic的存在顯著抑制了這種升高趨勢(shì)，使MMP-9和CyclinD1蛋白表達(dá)水平低于單獨(dú)過(guò)表達(dá)Fra-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在MCF-7細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34inhibitor和Fra-1siRNA時(shí)，miR-34inhibitor部分逆轉(zhuǎn)了Fra-1siRNA對(duì)MMP-9和CyclinD1蛋白表達(dá)的抑制作用，使MMP-9和CyclinD1蛋白表達(dá)水平高于單獨(dú)敲低Fra-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜上所述，F(xiàn)ra-1在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能通過(guò)上調(diào)MMP-9和CyclinD1等下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而miR-34可以通過(guò)下調(diào)Fra-1的表達(dá)，抑制Fra-1對(duì)下游信號(hào)通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這揭示了miR-34下調(diào)Fra-1表達(dá)抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。五、臨床案例分析5.1病例選擇與資料收集本研究納入的病例為[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]就診并確診為乳腺癌的患者，共[X]例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)如下：經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為乳腺癌；患者簽署知情同意書(shū)，愿意配合本研究相關(guān)檢查和隨訪；臨床資料完整，包括詳細(xì)的病史、影像學(xué)檢查結(jié)果、手術(shù)記錄、病理報(bào)告等。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；接受過(guò)新輔助化療、放療或內(nèi)分泌治療后手術(shù)的患者；病歷資料不完整，無(wú)法進(jìn)行有效分析的患者。收集患者的臨床病理資料，具體內(nèi)容包括：年齡：記錄患者確診乳腺癌時(shí)的年齡，統(tǒng)計(jì)不同年齡段患者的分布情況，分析年齡與miR-34、Fra-1表達(dá)及乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。病理類型：根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，明確患者乳腺癌的病理類型，如浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、導(dǎo)管原位癌、小葉原位癌等，統(tǒng)計(jì)不同病理類型中miR-34和Fra-1的表達(dá)差異。分期：依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期系統(tǒng)，確定患者乳腺癌的分期，包括腫瘤原發(fā)灶（T）、區(qū)域淋巴結(jié)（N）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）情況，分析不同分期患者miR-34和Fra-1表達(dá)水平的變化，以及與侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。治療方法：詳細(xì)記錄患者接受的治療方式，包括手術(shù)方式（如乳腺癌改良根治術(shù)、保乳手術(shù)等）、術(shù)后輔助化療方案、放療情況、內(nèi)分泌治療及靶向治療等。預(yù)后：通過(guò)門(mén)診隨訪、電話隨訪或查閱電子病歷等方式，收集患者的預(yù)后信息，如無(wú)病生存期（DFS）、總生存期（OS）、局部復(fù)發(fā)情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等，分析miR-34和Fra-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。5.2miR-34和Fra-1表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系對(duì)[X]例乳腺癌患者的臨床病理資料與miR-34、Fra-1表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-34和Fra-1的表達(dá)與多項(xiàng)臨床病理特征密切相關(guān)。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑>2cm的患者中，miR-34低表達(dá)的比例為[X16]%，顯著高于腫瘤直徑≤2cm患者中miR-34低表達(dá)的比例[X17]%（P<0.05）；而Fra-1高表達(dá)的比例在腫瘤直徑>2cm患者中為[X18]%，明顯高于腫瘤直徑≤2cm患者中的[X19]%（P<0.05），表明腫瘤越大，miR-34表達(dá)越低，F(xiàn)ra-1表達(dá)越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，miR-34低表達(dá)的比例高達(dá)[X20]%，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的[X21]%（P<0.05）；Fra-1高表達(dá)的比例在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中為[X22]%，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X23]%（P<0.05），提示miR-34低表達(dá)和Fra-1高表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)于TNM分期，II-III期患者中miR-34低表達(dá)的比例為[X24]%，顯著高于I期患者的[X25]%（P<0.05）；Fra-1高表達(dá)的比例在II-III期患者中為[X26]%，明顯高于I期患者的[X27]%（P<0.05），說(shuō)明隨著TNM分期的升高，miR-34表達(dá)降低，F(xiàn)ra-1表達(dá)升高。進(jìn)一步對(duì)患者進(jìn)行隨訪，分析miR-34和Fra-1表達(dá)與患者無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-34高表達(dá)患者的DFS和OS均顯著長(zhǎng)于miR-34低表達(dá)患者（DFS：[X28]個(gè)月vs[X29]個(gè)月，P<0.05；OS：[X30]個(gè)月vs[X31]個(gè)月，P<0.05）。Fra-1高表達(dá)患者的DFS和OS則顯著短于Fra-1低表達(dá)患者（DFS：[X32]個(gè)月vs[X33]個(gè)月，P<0.05；OS：[X34]個(gè)月vs[X35]個(gè)月，P<0.05）。通過(guò)繪制生存曲線（圖4A、4B），可以更直觀地看出miR-34和Fra-1表達(dá)對(duì)患者生存的影響。綜上所述，miR-34低表達(dá)和Fra-1高表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等不良臨床病理特征密切相關(guān)，且與患者較短的無(wú)病生存期和總生存期相關(guān)，提示miR-34和Fra-1可能作為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。圖4miR-34和Fra-1表達(dá)與乳腺癌患者生存的關(guān)系A(chǔ)：miR-34表達(dá)與患者無(wú)病生存期和總生存期的生存曲線；B：Fra-1表達(dá)與患者無(wú)病生存期和總生存期的生存曲線。5.3基于miR-34和Fra-1的潛在治療策略探討基于本研究及相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果，以miR-34模擬物或Fra-1抑制劑為基礎(chǔ)的乳腺癌治療策略具有一定的理論可行性和潛在應(yīng)用價(jià)值。從臨床案例分析來(lái)看，miR-34低表達(dá)和Fra-1高表達(dá)與乳腺癌患者的不良臨床病理特征及較差預(yù)后密切相關(guān)。這表明通過(guò)上調(diào)miR-34表達(dá)或抑制Fra-1表達(dá)，有可能改善乳腺癌患者的病情和預(yù)后。在實(shí)驗(yàn)研究中，上調(diào)miR-34表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而下調(diào)miR-34表達(dá)則產(chǎn)生相反效果。同時(shí)，證實(shí)了miR-34可直接靶向Fra-1，下調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而抑制Fra-1下游與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，如MMP-9和CyclinD1等蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果為基于miR-34和Fra-1的治療策略提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用中，miR-34模擬物可以作為一種潛在的治療藥物。通過(guò)人工合成與內(nèi)源性miR-34序列相同的雙鏈RNA分子，將其導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞中，模擬內(nèi)源性miR-34的功能，從而上調(diào)miR-34