Detectionofdiphyllobothroid目錄TOC\o"1-3"\h\u2037 126260 148821 146612 1117503 123222 1130644 1129285 2278455.1 2240945.2 228215.3 274636 223506.1 2222756.2 231276.2.1 2213036.2.2 3169746.2.3 32426.3 3227196.3.1 3122486.3.2 35116.3.3 427752 55374A.1 51148A.2 522580B.1.2 6GB/T18088GB/T6682plerocercoidplerocercoidlarvaeofSpirometraPCR胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸電泳緩沖液（TAE；瓊脂糖凝膠；6×加樣緩沖液；100～2000bpDNAmarker；滅菌雙蒸餾水(ddH2O)；70%乙醇（BB.1）。列；闊節(jié)裂頭蚴特異性引物序列及曼氏裂頭蚴特異性引物序列（BB.2GB/T18088GB/T66828）至最大刻度處，沉淀洗滌至水清，全部沉渣置平皿，用體視顯微鏡鏡檢判定結(jié)果。在體視顯微鏡下挑取蟲體，初步鑒定后備用。PCRDNA。無菌水作空白對照。DNA（見附錄B25L,模板DNA2L，上下游引物（10mol/L）0.5L，dNTPs2L，MgCl22.510×Buffer2.5L，Taq(5U/μL0.2L，補(bǔ)充ddH2O25LPCR94℃3min；9430s，5530s，721min，35727min緩沖液中，3V/cm～4V/cm30min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時停止電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析。2mm~20mm2mm~3mm，乳白色，頭節(jié)呈匙形，其背腹面各蟲相似的頭節(jié)，可初步判定裂頭屬的裂頭蚴（參見附錄CC附錄（Pseudophllidea蟲的總稱。裂頭科中的裂頭屬（Dibothriocephalus）又名雙葉槽屬（Diphyllobothrium）2mm~20mm2mm~3mm，乳白色，頭節(jié)呈匙形，其背腹面各有一條窄而深凹1.5μm。15~25℃7d~15d2周~3周的發(fā)5周~6周發(fā)育為成蟲。成蟲在終宿luciuslotafluviatilisaculeatusmasouhaematocheila（Salvelinusfontinalis）（Oncorhynchusmykiss）（Leuciscusrutilus、八目鰻（Lampetrajaponicum）等。2周~5周發(fā)育孵出六鉤蚴，被劍水蚤吞食后發(fā)育成原尾蚴，原尾蚴被蛙類吞食可附錄胃蛋白酶2g，濃鹽酸0.7mL，加蒸餾水至100mL三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）242g，冰乙酸57.1mL，pH8.00.5mol/LEDTA液100mL，加蒸餾水定容至1000mL，制成50×TAE緩沖液，混勻4℃保存?zhèn)溆?。臨用前50倍稀釋。50×TAE20mL，加蒸餾水定容至1000mL10mg/mL溴酚藍(lán)0.25g，蔗糖40g，加蒸餾水至100mL。置4片段大小ITS18S-28S-Cox1Dl/Dn-完畢后棄掉離心管中蒸餾水，用碾磨棒將離心管中蟲體碾碎，加入180μlBufferATL，20μl蛋白酶K，混勻后于56℃孵育1~3h至消化完全，期間不時振蕩搖晃。消化完全后，漩渦震蕩15s，加200μlBufferAL，立即漩渦振蕩混勻，再加入200μl(9離心柱置于收集管上，將上一步的混合物吸入離心柱中，8000r/min1min將離心柱置于新的收集管中，加500μlBufferAW1，8000r/min1min將離心柱置于新的收集管中，加500μlBufferAW2，14000r/min3min將離心柱置于滅菌的1.5ml離心管中，加入200μlBufferAE室溫孵育1min，8000r/min離心1min，離心所得DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄖ貜?fù)該步驟可擴(kuò)大DNA回收率）。BufferAL：裂解緩沖液（Lysisbuffer）BufferAW1：洗滌緩沖液1BufferAW2：洗滌緩沖液2BufferATL：組織溶解緩沖液