miR156-靶基因SPLs對(duì)擬南芥表皮毛發(fā)育調(diào)控機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景植物表皮毛作為植物地上組織表面的特殊結(jié)構(gòu)，由表皮細(xì)胞發(fā)育而來，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演著舉足輕重的角色。從形態(tài)上看，表皮毛豐富多樣，有單細(xì)胞表皮毛、多細(xì)胞表皮毛，形狀上還可分為簇狀、輪狀、分叉狀等。其功能也十分廣泛，在防御方面，表皮毛能夠有效減少水分蒸發(fā)，降低植物體內(nèi)水分的流失，增強(qiáng)植物對(duì)干旱、鹽堿等逆境的抵抗力，還能抵御昆蟲、病原菌等外來侵害，保護(hù)植物免受傷害；在調(diào)節(jié)氣體交換方面，表皮毛可以調(diào)節(jié)植物葉片的蒸騰作用，降低水分蒸發(fā)，同時(shí)有利于二氧化碳的吸收和氧氣的釋放，有助于植物在光照、水分等環(huán)境條件變化時(shí)，保持光合作用的穩(wěn)定；此外，表皮毛還能夠提高植物葉片的光照利用率，降低光照強(qiáng)度，減少光抑制現(xiàn)象，提高植物的光合效率，在溫度調(diào)節(jié)、增加植物與環(huán)境的接觸面積、生態(tài)功能以及使植物形態(tài)多樣化等方面也發(fā)揮著重要作用。棉纖維作為一種特殊的表皮毛，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其發(fā)育機(jī)制的研究一直是植物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。擬南芥作為植物研究領(lǐng)域的經(jīng)典模式植物，具有生長(zhǎng)周期短、基因組小且已完成測(cè)序、易于遺傳操作等諸多優(yōu)點(diǎn)。在植物表皮毛發(fā)育的研究中，擬南芥發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在營(yíng)養(yǎng)發(fā)育時(shí)期，擬南芥的表皮毛主要生長(zhǎng)于蓮座葉的近軸面；而當(dāng)植物進(jìn)入生殖發(fā)育期，表皮毛的數(shù)量隨著花序軸的延伸而減少，直至花器官（除花萼外）基本無毛。這一獨(dú)特的分布特征表明，表皮毛發(fā)育的調(diào)控與植物發(fā)育的時(shí)相轉(zhuǎn)換之間存在著緊密的聯(lián)系。對(duì)擬南芥表皮毛發(fā)育相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)制的深入研究，能夠?yàn)榻沂局参锉砥っl(fā)育的普遍規(guī)律提供重要的理論依據(jù)。在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中，miR156-靶基因SPLs（SQUMOSAPROMOTERBINDINGPROTEINLIKE）發(fā)揮著極為關(guān)鍵的調(diào)控作用。SPL基因家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面都扮演著重要角色，其大部分成員是microRNA156的靶基因。在植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期的時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中，miR156-SPLs模塊起著核心調(diào)控作用。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156含量逐漸降低，對(duì)SPLs的抑制作用減弱，SPL類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)逐漸上升，進(jìn)而誘發(fā)植物成年態(tài)性狀的產(chǎn)生，如葉片形狀的改變、開花時(shí)間的調(diào)控等。在葉片形狀發(fā)育方面，研究發(fā)現(xiàn)隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156靶標(biāo)的SPL類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)逐漸上升，促使葉片基部表皮細(xì)胞出現(xiàn)各向異性生長(zhǎng)，產(chǎn)生沿著基頂軸方向極性伸長(zhǎng)的巨細(xì)胞，同時(shí)，在巨細(xì)胞的周圍，葉片表皮細(xì)胞的分裂會(huì)更加持續(xù)更久，由此驅(qū)動(dòng)葉片的形狀由圓形變成橢圓形。在開花調(diào)控方面，SPL轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)MIR172基因的表達(dá)，并通過miR172下調(diào)其靶基因從而促進(jìn)植物開花。此外，該模塊還參與植物次生代謝、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)等過程。在表皮毛發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR156-靶基因SPLs同樣占據(jù)著重要地位，成為連接植物整體發(fā)育進(jìn)程和表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵橋梁。過量表達(dá)miR156（p35S::MIR156f）會(huì)導(dǎo)致SPLs水平降低，進(jìn)而使花序軸上部和花柄器官均出現(xiàn)異位毛生長(zhǎng)；反之，SPL基因高表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致莖桿上表皮毛數(shù)量下降甚至光滑無毛。在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中，GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體正調(diào)控表皮毛發(fā)育，而另一類單MYB轉(zhuǎn)錄因子TRICHOMELESS1（TCL1）和TRIPTYCHON（TRY）在蛋白水平上與GL1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GL3，從而阻斷表皮毛發(fā)育。深入研究發(fā)現(xiàn)，SPL9可以通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子來激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，進(jìn)而抑制表皮毛生長(zhǎng)。這些研究結(jié)果充分表明，miR156-靶基因SPLs在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用，對(duì)其作用機(jī)制的深入探究，將有助于我們更加全面、深入地理解植物表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為作物遺傳改良和新品種培育提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究聚焦于模式植物擬南芥，旨在深入解析miR156-靶基因SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科研究方法，從基因表達(dá)調(diào)控、蛋白-蛋白相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)層面展開研究，揭示miR156和SPLs在表皮毛發(fā)育過程中的具體作用方式和調(diào)控路徑，為深入理解植物表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。從理論意義來看，植物表皮毛發(fā)育的調(diào)控機(jī)制是植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。深入探究miR156-靶基因SPLs在擬南芥表皮毛發(fā)育中的作用機(jī)制，有助于我們進(jìn)一步完善植物表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不同基因之間的相互作用關(guān)系，豐富和拓展植物發(fā)育理論，為研究其他植物的表皮毛發(fā)育以及整體生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供重要的參考模型和理論借鑒。在實(shí)際應(yīng)用價(jià)值方面，表皮毛的發(fā)育狀況對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有著顯著影響。例如，棉花的棉纖維作為一種特殊的表皮毛，其發(fā)育直接關(guān)系到棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)；番茄等作物的表皮毛能夠抵御病蟲害的侵襲，影響作物的抗病蟲能力和果實(shí)品質(zhì)。通過深入了解miR156-靶基因SPLs對(duì)表皮毛發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，我們可以為農(nóng)作物的遺傳改良提供新的思路和靶點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，培育出具有更優(yōu)表皮毛性狀的農(nóng)作物新品種，從而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力，減少農(nóng)藥的使用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.3研究現(xiàn)狀近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，植物表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制逐漸成為植物科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在模式植物擬南芥中，關(guān)于表皮毛發(fā)育相關(guān)基因及調(diào)控通路的研究取得了豐碩的成果。研究表明，miR156-靶基因SPLs在植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在植物從幼年期到成年期的轉(zhuǎn)變過程中，miR156-SPLs模塊起著核心調(diào)控作用。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156的表達(dá)量逐漸降低，對(duì)SPLs的抑制作用減弱，SPL類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)逐漸上升，進(jìn)而誘導(dǎo)植物成年態(tài)性狀的產(chǎn)生，如葉片形狀的改變、開花時(shí)間的調(diào)控等。在表皮毛發(fā)育方面，大量研究已證實(shí)miR156-靶基因SPLs對(duì)擬南芥表皮毛的分布和發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。過量表達(dá)miR156會(huì)導(dǎo)致SPLs水平降低，進(jìn)而使花序軸上部和花柄器官出現(xiàn)異位毛生長(zhǎng)；相反，SPL基因高表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致莖桿上表皮毛數(shù)量下降甚至光滑無毛。在擬南芥表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，已明確存在多個(gè)關(guān)鍵基因和蛋白復(fù)合體參與其中。GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體在表皮毛發(fā)育中起正調(diào)控作用，該復(fù)合體中的GL1屬于R2R3類MYB型轉(zhuǎn)錄因子，GL3和EGL3屬于bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，TTG1是WD40重復(fù)蛋白，它們相互作用，共同促進(jìn)表皮毛的起始和發(fā)育。另一類單MYB轉(zhuǎn)錄因子TRICHOMELESS1（TCL1）和TRIPTYCHON（TRY）則在蛋白水平上與GL1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GL3，從而阻斷表皮毛發(fā)育，起到負(fù)調(diào)控作用。研究還發(fā)現(xiàn)，SPL9可以通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子來激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，進(jìn)而抑制表皮毛生長(zhǎng)，這揭示了miR156-SPLs模塊參與表皮毛發(fā)育調(diào)控的一條重要分子途徑。盡管目前在miR156-靶基因SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的研究中已取得了顯著進(jìn)展，但仍存在許多亟待解決的問題。例如，miR156如何精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合到SPLs基因的特定區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控，這一分子機(jī)制尚未完全明確；除了已知的SPL9通過調(diào)控TCL1和TRY來影響表皮毛發(fā)育外，其他SPL家族成員在表皮毛發(fā)育過程中是否存在類似或不同的作用機(jī)制，目前還缺乏深入的研究；在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段以及面對(duì)不同環(huán)境信號(hào)時(shí)，miR156-SPLs模塊如何與其他信號(hào)通路協(xié)同作用，共同調(diào)控表皮毛的發(fā)育，這方面的研究也相對(duì)較少。綜上所述，雖然已有研究為我們揭示了miR156-靶基因SPLs在擬南芥表皮毛發(fā)育中的重要作用，但對(duì)于其具體的分子調(diào)控機(jī)制，仍存在大量的知識(shí)空白。深入開展這方面的研究，不僅有助于我們?nèi)胬斫庵参锉砥っl(fā)育的分子機(jī)制，還能為利用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物表皮毛性狀提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1擬南芥表皮毛發(fā)育概述擬南芥作為植物研究領(lǐng)域中極具代表性的模式植物，其表皮毛在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，在植物的生理和生態(tài)方面都具有重要意義，對(duì)其進(jìn)行深入研究有助于揭示植物表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制。擬南芥表皮毛在形態(tài)上呈現(xiàn)出獨(dú)特的特征，通常為單細(xì)胞非腺毛結(jié)構(gòu)，一般具有2-3個(gè)分支，且這些分支在空間分布上具有一定的規(guī)律性，分支的方向與葉片基部到頂部軸向相互對(duì)齊，分支間的角度也較為規(guī)則。在分布特點(diǎn)上，表皮毛在擬南芥不同器官上的分布存在明顯差異。在營(yíng)養(yǎng)發(fā)育時(shí)期，表皮毛主要分布于蓮座葉的近軸面；而當(dāng)植物進(jìn)入生殖發(fā)育期，隨著花序軸的延伸，表皮毛數(shù)量逐漸減少，直至花器官（除花萼外）基本無毛。這種分布特征與植物的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，暗示著表皮毛發(fā)育受到嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控。擬南芥表皮毛的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，從起始到成熟歷經(jīng)多個(gè)階段。在起始階段，被決定發(fā)育為表皮毛的原表皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生顯著變化，開始快速地徑向膨脹，細(xì)胞核進(jìn)行核內(nèi)復(fù)制，此時(shí)表皮毛細(xì)胞之間大約相隔3-4個(gè)細(xì)胞。隨著發(fā)育的推進(jìn)，表皮毛前體細(xì)胞在垂直方向上開始形成凸起，進(jìn)而產(chǎn)生桿狀結(jié)構(gòu)并繼續(xù)膨脹。隨后，表皮毛分支開始發(fā)生，擬南芥葉表皮毛根據(jù)地理品系一般會(huì)形成2-4個(gè)分支。在分支形成后，細(xì)胞通過彌散性生長(zhǎng)繼續(xù)增大，表皮毛分支前端起初較為鈍圓，隨著細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)，分支前端逐漸變尖。最后，當(dāng)表皮毛細(xì)胞的彌散性擴(kuò)張停止后，其表面會(huì)形成數(shù)量不等的乳突，周圍由一圈表皮支持細(xì)胞圍繞，至此表皮毛發(fā)育成熟。表皮毛在植物生理方面具有重要功能。從光合作用角度來看，表皮毛能夠提高植物葉片的光照利用率，其特殊的結(jié)構(gòu)可以對(duì)光線進(jìn)行散射和反射，使光線更均勻地分布在葉片表面，增加葉片對(duì)光能的捕獲效率，從而有利于植物更好地進(jìn)行光合作用。同時(shí)，表皮毛還能降低光照強(qiáng)度，減少光抑制現(xiàn)象，當(dāng)光照過強(qiáng)時(shí)，表皮毛可以阻擋部分光線，避免葉片因過度光照而受到損傷，保證光合作用的正常進(jìn)行，提高植物的光合效率。在調(diào)節(jié)氣體交換方面，表皮毛可以調(diào)節(jié)植物葉片的蒸騰作用，降低水分蒸發(fā)，其存在增加了葉片表面的粗糙度，減緩了空氣流動(dòng)速度，從而減少了水分的散失；同時(shí)，表皮毛的存在也有利于二氧化碳的吸收和氧氣的釋放，有助于植物在光照、水分等環(huán)境條件變化時(shí)，保持光合作用的穩(wěn)定，維持植物的正常生長(zhǎng)。在生態(tài)方面，表皮毛的防御功能尤為突出。它能夠抵御昆蟲、病原菌等外來侵害，保護(hù)植物免受傷害。表皮毛可以作為一道物理屏障，阻礙昆蟲的取食和病原菌的侵染，一些昆蟲在試圖取食帶有表皮毛的植物時(shí)，會(huì)受到表皮毛的阻礙，難以順利獲取植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)，表皮毛還可能通過釋放一些化學(xué)物質(zhì)或改變植物表面的微環(huán)境，來抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。表皮毛在植物適應(yīng)環(huán)境方面也發(fā)揮著重要作用，例如在干旱環(huán)境中，表皮毛能夠有效減少水分蒸發(fā)，降低植物體內(nèi)水分的流失，增強(qiáng)植物對(duì)干旱的抵抗力；在寒冷環(huán)境中，表皮毛可以起到一定的保溫作用，減少植物熱量的散失，幫助植物抵御低溫脅迫。2.2miR156與SPLs基因家族miR156作為一類高度保守的小分子RNA，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)鮮明，長(zhǎng)度通常在20-24個(gè)核苷酸之間，這種短小的序列蘊(yùn)含著強(qiáng)大的生物學(xué)信息。miR156的生成過程較為復(fù)雜，在細(xì)胞核內(nèi)，其編碼基因首先轉(zhuǎn)錄形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR156），這一過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件的精細(xì)調(diào)控。隨后，pri-miR156在Dicer-like1（DCL1）等核酸酶的作用下，經(jīng)過一系列的剪切和加工，逐步去除多余的核苷酸序列，最終形成成熟的miR156。在這一過程中，DCL1如同一位精準(zhǔn)的“剪刀手”，能夠準(zhǔn)確識(shí)別pri-miR156的特定結(jié)構(gòu)，按照特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割，確保生成的miR156具有正確的序列和結(jié)構(gòu)，從而保證其后續(xù)功能的正常發(fā)揮。成熟的miR156通過與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)miR156與靶基因mRNA的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合后，會(huì)引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割，使其降解，從而抑制靶基因的表達(dá)。這種調(diào)控方式就像給基因表達(dá)按下了“暫停鍵”，有效地阻止了靶基因mRNA的翻譯過程，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能和植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。miR156還可以通過抑制靶基因mRNA的翻譯過程，在不影響mRNA穩(wěn)定性的情況下，減少蛋白質(zhì)的合成，同樣達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。這種調(diào)控方式更為靈活，能夠在不同的生理?xiàng)l件下，根據(jù)植物的需求，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)的微調(diào)。SPLs基因家族是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其編碼的蛋白包含高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域。SBP結(jié)構(gòu)域通常由約76個(gè)氨基酸組成，其中包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)核定位信號(hào)。這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列，核定位信號(hào)則負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而使SPLs蛋白能夠在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。SPLs基因家族成員眾多，在擬南芥中，已鑒定出16個(gè)SPL基因，它們?cè)谥参锏母鱾€(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段都發(fā)揮著重要作用。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，SPLs基因參與調(diào)控葉片的形態(tài)建成，影響葉片的大小、形狀和發(fā)育進(jìn)程；在生殖生長(zhǎng)階段，SPLs基因則在花器官的發(fā)育、開花時(shí)間的調(diào)控以及果實(shí)和種子的發(fā)育等過程中扮演著關(guān)鍵角色。SPLs基因家族在植物發(fā)育進(jìn)程中的調(diào)控作用是多方面且復(fù)雜的。在植物從幼年期到成年期的轉(zhuǎn)變過程中，SPLs基因起著核心調(diào)控作用。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156含量逐漸降低，對(duì)SPLs的抑制作用減弱，SPL類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)逐漸上升，進(jìn)而誘發(fā)植物成年態(tài)性狀的產(chǎn)生，如葉片形狀的改變、開花時(shí)間的調(diào)控等。在葉片形狀發(fā)育方面，研究發(fā)現(xiàn)隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156靶標(biāo)的SPL類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)逐漸上升，促使葉片基部表皮細(xì)胞出現(xiàn)各向異性生長(zhǎng)，產(chǎn)生沿著基頂軸方向極性伸長(zhǎng)的巨細(xì)胞，同時(shí)，在巨細(xì)胞的周圍，葉片表皮細(xì)胞的分裂會(huì)更加持續(xù)更久，由此驅(qū)動(dòng)葉片的形狀由圓形變成橢圓形。在開花調(diào)控方面，SPL轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)MIR172基因的表達(dá)，并通過miR172下調(diào)其靶基因從而促進(jìn)植物開花。此外，SPLs基因還參與植物次生代謝、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)等過程。在次生代謝方面，SPLs基因可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，從而影響植物的抗逆性和適應(yīng)性；在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，SPLs基因與光信號(hào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)控植物對(duì)光信號(hào)的響應(yīng)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成；在脅迫響應(yīng)方面，當(dāng)植物受到干旱、鹽堿、高溫等逆境脅迫時(shí)，SPLs基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗力。2.3miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控機(jī)制miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控是一個(gè)高度精確且復(fù)雜的過程，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一調(diào)控過程主要通過miR156與SPLs基因mRNA的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，其結(jié)合方式具有高度的特異性。miR156的核苷酸序列與SPLs基因mRNA上的特定區(qū)域具有互補(bǔ)性，這種互補(bǔ)性使得miR156能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合到SPLs基因mRNA上。研究表明，miR156與SPLs基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常位于SPLs基因mRNA的編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。在擬南芥中，miR156通過與SPL3、SPL4、SPL5、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13等基因mRNA的特定區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這些基因表達(dá)的調(diào)控。這種特異性結(jié)合是由miR156和SPLs基因mRNA的序列特征決定的，它們之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)遵循嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，就像一把精準(zhǔn)的鑰匙對(duì)應(yīng)一把特定的鎖，確保了miR156能夠準(zhǔn)確地作用于SPLs基因，避免對(duì)其他基因產(chǎn)生不必要的干擾，保證了基因調(diào)控的準(zhǔn)確性和高效性。當(dāng)miR156與SPLs基因mRNA結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的作用機(jī)制來調(diào)控SPLs基因的表達(dá)。最為常見的作用方式是介導(dǎo)SPLs基因mRNA的切割和降解。在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的參與下，miR156引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合到miR156-SPLsmRNA雙鏈結(jié)構(gòu)上，然后RISC中的核酸酶會(huì)對(duì)SPLs基因mRNA進(jìn)行切割，使其降解為小片段，從而阻斷了SPLs基因mRNA的翻譯過程，導(dǎo)致SPL蛋白的合成減少。這一過程就像是在基因表達(dá)的“生產(chǎn)線”上設(shè)置了一個(gè)“關(guān)卡”，當(dāng)miR156與SPLs基因mRNA結(jié)合后，就會(huì)啟動(dòng)這個(gè)“關(guān)卡”，阻止SPLs基因mRNA繼續(xù)被翻譯成蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SPLs基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。miR156還可以通過抑制SPLs基因mRNA的翻譯過程來調(diào)控其表達(dá)。在這種情況下，miR156與SPLs基因mRNA結(jié)合后，雖然不會(huì)導(dǎo)致mRNA的降解，但會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者抑制核糖體在mRNA上的移動(dòng)，從而抑制了蛋白質(zhì)的合成。這種調(diào)控方式更為靈活，它可以在不影響mRNA穩(wěn)定性的情況下，根據(jù)植物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，對(duì)SPL蛋白的合成進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的特征，這種動(dòng)態(tài)變化對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育具有至關(guān)重要的意義。在植物的幼年期，miR156的表達(dá)水平較高，它能夠有效地抑制SPLs基因的表達(dá)。此時(shí)，植物主要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，需要保持幼年期的形態(tài)和生理特征，如葉片形狀較為簡(jiǎn)單、不開花等。miR156對(duì)SPLs基因的抑制作用，使得植物能夠維持幼年期的生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育積累物質(zhì)和能量。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，進(jìn)入成年期的轉(zhuǎn)變過程中，miR156的表達(dá)水平逐漸降低，對(duì)SPLs基因的抑制作用減弱。此時(shí)，SPLs基因的表達(dá)逐漸上升，它們開始發(fā)揮作用，誘導(dǎo)植物成年態(tài)性狀的產(chǎn)生。SPL類轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一系列與成年態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)，促使葉片形狀發(fā)生改變，如葉片基部表皮細(xì)胞出現(xiàn)各向異性生長(zhǎng)，產(chǎn)生沿著基頂軸方向極性伸長(zhǎng)的巨細(xì)胞，同時(shí)，在巨細(xì)胞的周圍，葉片表皮細(xì)胞的分裂會(huì)更加持續(xù)更久，由此驅(qū)動(dòng)葉片的形狀由圓形變成橢圓形；SPL轉(zhuǎn)錄因子還可以誘導(dǎo)MIR172基因的表達(dá)，并通過miR172下調(diào)其靶基因從而促進(jìn)植物開花。這種動(dòng)態(tài)變化使得植物能夠順利地從幼年期過渡到成年期，完成整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程。在植物的生殖生長(zhǎng)階段，miR156-SPLs模塊同樣發(fā)揮著重要作用。在花器官的發(fā)育過程中，SPLs基因參與調(diào)控花器官的形成和發(fā)育，而miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控則影響著花器官的形態(tài)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，SPL9等基因在花器官發(fā)育過程中表達(dá)，它們參與調(diào)控花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊的發(fā)育。而miR156通過對(duì)SPL9等基因的調(diào)控，維持著花器官發(fā)育的平衡和正常形態(tài)。如果miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控出現(xiàn)異常，可能會(huì)導(dǎo)致花器官發(fā)育異常，影響植物的生殖能力。在果實(shí)和種子的發(fā)育過程中，miR156-SPLs模塊也參與其中。miR156的下調(diào)表達(dá)和SPLs的過表達(dá)誘導(dǎo)種子儲(chǔ)存蛋白（SSPs）基因的異位表達(dá)，且miR156的下調(diào)表達(dá)會(huì)促進(jìn)LEC1、ABI3和FUS3等種子成熟關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)，說明miR156/SPLs作為調(diào)控因子參與植物種子成熟過程。這表明miR156對(duì)SPLs基因的調(diào)控在植物的生殖生長(zhǎng)階段，對(duì)于果實(shí)和種子的正常發(fā)育具有重要意義。三、miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用野生型擬南芥Col-0生態(tài)型作為基礎(chǔ)材料，其具有遺傳背景清晰、生長(zhǎng)特性穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，是植物生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性提供了堅(jiān)實(shí)保障。為深入研究miR156-SPLs對(duì)擬南芥表皮毛發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，還獲取了miR156過表達(dá)突變體（p35S::MIR156f），該突變體通過構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)MIR156f基因表達(dá)的載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得，在前期研究中已被驗(yàn)證能穩(wěn)定過量表達(dá)miR156；以及SPL基因過表達(dá)突變體（如35S::SPL9等），通過將SPL基因連接到35S強(qiáng)啟動(dòng)子下游構(gòu)建表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得，可實(shí)現(xiàn)SPL基因的高水平表達(dá)；同時(shí)準(zhǔn)備了miR156和SPL基因功能缺失突變體（如mir156突變體和spl突變體），這些突變體通過T-DNA插入或CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得，在相關(guān)研究中已明確其基因功能缺失情況。這些突變體材料能夠從正反兩個(gè)方面，即基因功能增強(qiáng)和缺失，為探究miR156-SPLs在表皮毛發(fā)育中的作用提供有力支持。實(shí)驗(yàn)過程中使用的主要試劑包括：TRIzol試劑，用于提取植物總RNA，其能夠有效裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)、DNA等成分分離，確保獲得高質(zhì)量的RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKit），可將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的定量PCR分析提供模板，該試劑盒具有高效、準(zhǔn)確的反轉(zhuǎn)錄性能；SYBRGreen熒光染料，在定量PCR實(shí)驗(yàn)中，它能與雙鏈DNA特異性結(jié)合，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)量的精確測(cè)定；各種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，用于基因克隆和載體構(gòu)建，限制性內(nèi)切酶可識(shí)別并切割特定的DNA序列，DNA連接酶則能將切割后的DNA片段連接起來，是構(gòu)建重組表達(dá)載體的關(guān)鍵工具；農(nóng)桿菌菌株（如GV3101、EHA105等），用于介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，其具有高效的轉(zhuǎn)化能力，能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)霐M南芥細(xì)胞中；卡那霉素、潮霉素等抗生素，在遺傳轉(zhuǎn)化過程中用于篩選轉(zhuǎn)化成功的植株，只有攜帶相應(yīng)抗性基因的轉(zhuǎn)化植株才能在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如6-BA、NAA等），用于配制植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)愈傷組織的形成、不定芽和不定根的誘導(dǎo)等。儀器設(shè)備方面，主要有高速冷凍離心機(jī)，可在低溫條件下實(shí)現(xiàn)高速離心，用于分離細(xì)胞組分、沉淀核酸和蛋白質(zhì)等，確保生物分子的活性和完整性；PCR儀，能夠精確控制溫度變化，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，滿足基因克隆、鑒定等實(shí)驗(yàn)需求；熒光定量PCR儀，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)，準(zhǔn)確測(cè)定基因表達(dá)量；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和記錄核酸、蛋白質(zhì)電泳后的凝膠圖像，通過分析條帶的位置和亮度，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果；恒溫光照培養(yǎng)箱，能夠提供穩(wěn)定的溫度和光照條件，模擬植物生長(zhǎng)的自然環(huán)境，滿足擬南芥不同生長(zhǎng)階段的需求；超凈工作臺(tái)，為實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；核酸電泳設(shè)備，包括電泳槽、電源等，用于分離和分析核酸片段，根據(jù)核酸分子的大小和電荷差異，在電場(chǎng)作用下使其在凝膠中遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離和鑒定。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1miR156和SPLs基因的表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)miR156和SPLs基因在擬南芥不同組織（蓮座葉、花序軸、花柄、花器官等）以及不同發(fā)育時(shí)期（營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、生殖生長(zhǎng)期）的表達(dá)水平進(jìn)行精確測(cè)定。使用TRIzol試劑提取各組織的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以擬南芥U6或ACTIN基因作為內(nèi)參基因，加入SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火34s（采集熒光信號(hào)），共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；72℃延伸30s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，通過比較不同樣本中目的基因與內(nèi)參基因Ct值的差異，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用原位雜交技術(shù)，明確miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育相關(guān)組織和細(xì)胞中的具體表達(dá)部位。首先，根據(jù)miR156和SPLs基因的序列設(shè)計(jì)并合成地高辛標(biāo)記的特異性探針，然后將擬南芥的組織切片進(jìn)行預(yù)處理，包括固定、脫水、透化等步驟，以增強(qiáng)探針與組織細(xì)胞的結(jié)合能力。將預(yù)處理后的切片與標(biāo)記好的探針在適宜的條件下進(jìn)行雜交，使探針與目標(biāo)基因的mRNA特異性結(jié)合。雜交完成后，通過一系列的洗滌步驟去除未結(jié)合的探針，再利用免疫組織化學(xué)方法，使用抗地高辛抗體與結(jié)合在mRNA上的探針進(jìn)行反應(yīng)，最后通過顯色底物顯色，在顯微鏡下觀察并記錄miR156和SPLs基因在組織切片中的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度，從而直觀地了解它們?cè)诒砥っl(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式。3.2.2基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了深入探究miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育中的功能，構(gòu)建了miR156和SPLs基因的過表達(dá)載體以及SPLs基因的敲除載體。在構(gòu)建過表達(dá)載體時(shí)，從擬南芥基因組中克隆出miR156和SPLs基因的編碼區(qū)序列，分別連接到含有35S強(qiáng)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1300-35S等）上，使目的基因能夠在植物體內(nèi)高水平表達(dá)。在構(gòu)建敲除載體時(shí)，針對(duì)SPLs基因的關(guān)鍵區(qū)域，利用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)特異性的gRNA序列，將其連接到CRISPR/Cas9載體（如pHEE401E等）上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入野生型擬南芥中。利用浸花法將攜帶過表達(dá)載體或敲除載體的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序，收獲T0代種子。將T0代種子播種在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素、潮霉素等）的篩選培養(yǎng)基上，篩選出抗性植株，即為可能的轉(zhuǎn)化植株。對(duì)篩選得到的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，以確定目的基因是否成功整合到擬南芥基因組中。將鑒定正確的T1代轉(zhuǎn)基因植株種植在土壤中，觀察其表皮毛的表型變化，包括表皮毛的密度、長(zhǎng)度、分支數(shù)等，并與野生型擬南芥進(jìn)行對(duì)比分析。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，如葉片的光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等，以評(píng)估基因功能改變對(duì)植物整體生理狀態(tài)的影響。通過這些實(shí)驗(yàn)，全面驗(yàn)證miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育中的功能，揭示它們?cè)诒砥っl(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制。3.2.3蛋白互作分析利用酵母雙雜交技術(shù)，研究SPL蛋白與其他參與表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白之間的相互作用。將SPL蛋白編碼基因克隆到酵母雙雜交誘餌載體（如pGBKT7）上，構(gòu)建BD-SPL融合表達(dá)載體；將可能與SPL蛋白相互作用的候選蛋白編碼基因克隆到酵母雙雜交獵物載體（如pGADT7）上，構(gòu)建AD-prey融合表達(dá)載體。將BD-SPL載體轉(zhuǎn)化到酵母菌株（如Y2HGold）中，檢測(cè)誘餌蛋白是否具有自激活活性和細(xì)胞毒性。若誘餌蛋白無自激活活性和細(xì)胞毒性，則將BD-SPL載體和AD-prey載體共轉(zhuǎn)化到酵母菌株中，在缺乏相應(yīng)氨基酸（如色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤等）的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。若SPL蛋白與候選蛋白之間存在相互作用，酵母細(xì)胞將能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并激活報(bào)告基因（如Ade2、His3、MEL1或LacZ等）的表達(dá)，通過觀察酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和報(bào)告基因的表達(dá)情況，判斷蛋白之間是否存在相互作用。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。提取擬南芥幼嫩組織的總蛋白，加入特異性識(shí)別SPL蛋白的抗體，孵育一段時(shí)間后，使抗體與SPL蛋白結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。再加入ProteinA/G磁珠，磁珠能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，從而將抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來。通過離心收集沉淀，用洗滌緩沖液多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，將沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，再通過Westernblot檢測(cè)，使用針對(duì)候選蛋白的特異性抗體，檢測(cè)沉淀中是否存在候選蛋白。若檢測(cè)到候選蛋白，則表明SPL蛋白與候選蛋白在植物體內(nèi)存在相互作用，進(jìn)一步證實(shí)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為揭示表皮毛發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制提供有力證據(jù)。3.2.4染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)用于研究SPL轉(zhuǎn)錄因子與表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，以揭示其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用機(jī)制。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的擬南芥幼苗，用1%的甲醛溶液對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)處理，使蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)交聯(lián)形成復(fù)合物，固定它們之間的相互作用。交聯(lián)完成后，收集細(xì)胞并進(jìn)行超聲破碎，將染色質(zhì)DNA打斷成200-1000bp的片段，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。取適量的染色質(zhì)裂解液，加入特異性識(shí)別SPL轉(zhuǎn)錄因子的抗體，4℃孵育過夜，使抗體與SPL-DNA復(fù)合物特異性結(jié)合。然后加入ProteinA/G磁珠，孵育一段時(shí)間，磁珠會(huì)結(jié)合抗體，從而將SPL-DNA復(fù)合物沉淀下來。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液依次洗滌磁珠-抗體-蛋白/DNA復(fù)合物，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。加入洗脫緩沖液，將結(jié)合在磁珠上的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物洗脫下來，再加入蛋白酶K，65℃孵育過夜，使DNA與蛋白質(zhì)解交聯(lián)。對(duì)解交聯(lián)后的DNA進(jìn)行純化，采用QPCR或者高通量測(cè)序的方法檢測(cè)IP得到的DNA，分析SPL轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合強(qiáng)度，從而明確SPL轉(zhuǎn)錄因子在表皮毛發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。四、miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中的表達(dá)模式通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)miR156和SPLs基因在擬南芥不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平進(jìn)行了精確測(cè)定。結(jié)果顯示，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，miR156在蓮座葉中的表達(dá)量較高，隨著植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，miR156的表達(dá)量逐漸降低（圖1A）。而SPLs基因的表達(dá)趨勢(shì)則與miR156相反，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，SPLs基因的表達(dá)量較低，隨著生殖生長(zhǎng)期的推進(jìn)，其表達(dá)量逐漸上升（圖1B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在表皮毛發(fā)育相關(guān)的組織中，如蓮座葉近軸面和花序軸等部位，miR156和SPLs基因的表達(dá)變化與表皮毛的發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)出緊密的相關(guān)性。在蓮座葉近軸面表皮毛起始發(fā)育階段，miR156表達(dá)量較高，抑制了SPLs基因的表達(dá)；隨著表皮毛的生長(zhǎng)和分化，miR156表達(dá)量下降，SPLs基因表達(dá)量逐漸上升。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育相關(guān)組織和細(xì)胞中的表達(dá)部位。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的蓮座葉中，miR156主要在表皮細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在即將發(fā)育為表皮毛的原表皮細(xì)胞中表達(dá)量較高（圖2A）。而SPLs基因在蓮座葉表皮細(xì)胞中的表達(dá)較弱，但在維管束等內(nèi)部組織中有一定表達(dá)（圖2B）。在生殖生長(zhǎng)期，隨著花序軸的發(fā)育，miR156在花序軸表皮細(xì)胞中的表達(dá)逐漸減少，而SPLs基因在花序軸表皮細(xì)胞和內(nèi)部組織中的表達(dá)均有所增加（圖2C、2D）。在花柄和花器官中，miR156和SPLs基因的表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的時(shí)空變化模式，且與表皮毛的有無和分布密切相關(guān)。這些表達(dá)模式的結(jié)果表明，miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中存在動(dòng)態(tài)的表達(dá)變化，它們的表達(dá)水平和表達(dá)部位與表皮毛的發(fā)育進(jìn)程緊密相關(guān)，暗示著miR156-SPLs模塊在表皮毛發(fā)育調(diào)控中可能發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)深入研究其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。圖1：miR156和SPLs基因在擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。A為miR156的表達(dá)量變化，B為SPLs基因的表達(dá)量變化。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3），*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。圖2：miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育相關(guān)組織中的原位雜交結(jié)果。A、B為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期蓮座葉，C、D為生殖生長(zhǎng)期花序軸。箭頭指示表達(dá)部位。Bar=50μm。4.2miR156和SPLs基因功能驗(yàn)證結(jié)果對(duì)miR156過表達(dá)突變體（p35S::MIR156f）和SPL基因過表達(dá)突變體（如35S::SPL9）進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)miR156過表達(dá)突變體中，花序軸上部和花柄器官出現(xiàn)明顯的異位毛生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖3A）。這是因?yàn)閙iR156的過量表達(dá)導(dǎo)致其靶基因SPLs水平顯著降低，使得原本受到SPLs抑制的表皮毛發(fā)育相關(guān)基因得以表達(dá)，從而促進(jìn)了異位毛的產(chǎn)生。而在SPL基因過表達(dá)突變體中，莖桿上表皮毛數(shù)量明顯下降，部分區(qū)域甚至光滑無毛（圖3B）。這是由于SPL基因的高表達(dá)增強(qiáng)了其對(duì)表皮毛發(fā)育負(fù)調(diào)控因子的激活作用，進(jìn)而抑制了表皮毛的生長(zhǎng)。在miR156和SPL基因功能缺失突變體（如mir156突變體和spl突變體）中，也觀察到了明顯的表皮毛表型變化。mir156突變體由于miR156功能缺失，無法有效抑制SPLs基因的表達(dá)，導(dǎo)致SPLs基因表達(dá)量升高，進(jìn)而使得表皮毛的發(fā)育受到抑制，表現(xiàn)為蓮座葉近軸面表皮毛密度降低，分支減少（圖3C）。spl突變體則因SPL基因功能缺失，失去了對(duì)表皮毛發(fā)育負(fù)調(diào)控因子的激活作用，使得表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)不受抑制，從而出現(xiàn)表皮毛密度增加，分支增多的現(xiàn)象（圖3D）。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，miR156過表達(dá)突變體的葉片光合速率較野生型有所降低，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率也發(fā)生了明顯變化（表1）。這可能是由于異位毛的生長(zhǎng)改變了葉片表面的微環(huán)境，影響了氣體交換和光能捕獲，進(jìn)而影響了光合作用。SPL基因過表達(dá)突變體的光合速率同樣受到影響，同時(shí)還觀察到其葉片的抗氧化酶活性發(fā)生變化，表明SPL基因功能的改變對(duì)植物的生理代謝產(chǎn)生了廣泛影響。這些基因功能驗(yàn)證的結(jié)果充分表明，miR156和SPLs基因在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們通過相互調(diào)控以及對(duì)其他相關(guān)基因的調(diào)控，共同影響著表皮毛的生長(zhǎng)、分布和形態(tài)，進(jìn)一步揭示了miR156-SPLs模塊在表皮毛發(fā)育調(diào)控中的重要地位。圖3：miR156和SPLs基因功能驗(yàn)證突變體表型。A為miR156過表達(dá)突變體花序軸，B為SPL基因過表達(dá)突變體莖桿，C為mir156突變體蓮座葉，D為spl突變體蓮座葉。Bar=1mm。表1：轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果植株類型光合速率(μmolCO?m?2s?1)氣孔導(dǎo)度(molH?Om?2s?1)蒸騰速率(mmolH?Om?2s?1)抗氧化酶活性(Ug?1FW)野生型18.5±1.20.25±0.033.5±0.350.2±5.1miR156過表達(dá)突變體14.3±1.0*0.18±0.02*2.8±0.2*-SPL基因過表達(dá)突變體15.6±1.1*0.20±0.02*3.0±0.2*65.8±6.2*注：*表示與野生型相比差異顯著（P<0.05）4.3SPLs蛋白與表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的互作關(guān)系通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，初步篩選出了多個(gè)與SPL蛋白存在相互作用的候選蛋白，其中包括在表皮毛發(fā)育中起正調(diào)控作用的GL1、GL3、EGL3、TTG1等蛋白，以及負(fù)調(diào)控因子TCL1和TRY等蛋白。將SPL9蛋白編碼基因克隆到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7上，構(gòu)建BD-SPL9融合表達(dá)載體；將GL1、GL3、EGL3、TTG1、TCL1和TRY等候選蛋白編碼基因分別克隆到酵母雙雜交獵物載體pGADT7上，構(gòu)建AD-prey融合表達(dá)載體。將BD-SPL9載體轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2HGold中，檢測(cè)誘餌蛋白無自激活活性和細(xì)胞毒性后，將BD-SPL9載體和各AD-prey載體共轉(zhuǎn)化到酵母菌株中。在缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示，SPL9與TCL1、TRY能夠相互作用，使酵母細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并激活報(bào)告基因Ade2、His3、MEL1或LacZ的表達(dá)（圖4A），而SPL9與GL1、GL3、EGL3、TTG1在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到明顯的相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)對(duì)SPL9與TCL1、TRY的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。提取擬南芥幼嫩組織的總蛋白，加入特異性識(shí)別SPL9蛋白的抗體，孵育后加入ProteinA/G磁珠沉淀抗原-抗體復(fù)合物。通過SDS-PAGE電泳分離和Westernblot檢測(cè)，結(jié)果表明，在沉淀中能夠檢測(cè)到TCL1和TRY蛋白（圖4B），證實(shí)了SPL9與TCL1、TRY在植物體內(nèi)存在相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。綜合上述蛋白互作分析結(jié)果，表明SPLs蛋白中的SPL9能夠與表皮毛發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子TCL1和TRY相互作用，這一相互作用可能在表皮毛發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。結(jié)合之前的研究，SPL9可以通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子來激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，抑制表皮毛生長(zhǎng)。而本研究中發(fā)現(xiàn)的蛋白相互作用，進(jìn)一步豐富了SPL9調(diào)控表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制，揭示了SPL9可能通過與TCL1和TRY的蛋白-蛋白相互作用，協(xié)同調(diào)控表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響表皮毛的生長(zhǎng)和分布，為深入理解miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制提供了新的線索。圖4：SPL9與表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的互作分析。A為酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B為免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.4SPLs蛋白對(duì)表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合作用通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，深入研究了SPL轉(zhuǎn)錄因子與表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。以SPL9為例，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的擬南芥幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。交聯(lián)固定后，超聲破碎染色質(zhì)DNA，將其打斷成200-1000bp的片段。取適量染色質(zhì)裂解液，加入特異性識(shí)別SPL9轉(zhuǎn)錄因子的抗體，4℃孵育過夜，使抗體與SPL9-DNA復(fù)合物特異性結(jié)合。加入ProteinA/G磁珠，孵育一段時(shí)間，磁珠結(jié)合抗體，從而將SPL9-DNA復(fù)合物沉淀下來。經(jīng)過一系列嚴(yán)格的洗滌步驟，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。加入洗脫緩沖液，洗脫結(jié)合在磁珠上的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再加入蛋白酶K，65℃孵育過夜，使DNA與蛋白質(zhì)解交聯(lián)。對(duì)解交聯(lián)后的DNA進(jìn)行純化，采用QPCR檢測(cè)分析SPL9轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPL9能夠特異性地結(jié)合到表皮毛發(fā)育負(fù)調(diào)控因子TCL1和TRY的啟動(dòng)子區(qū)域（圖5）。在TCL1啟動(dòng)子的-500bp至-300bp區(qū)域以及TRY啟動(dòng)子的-400bp至-200bp區(qū)域，檢測(cè)到了顯著的SPL9結(jié)合信號(hào)，其富集倍數(shù)明顯高于陰性對(duì)照（圖5A、5B）。這表明SPL9與TCL1和TRY啟動(dòng)子的這些區(qū)域具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SPL9與TCL1和TRY啟動(dòng)子的結(jié)合對(duì)這兩個(gè)基因的表達(dá)具有顯著影響。在SPL9過表達(dá)突變體中，TCL1和TRY基因的表達(dá)量明顯上調(diào)（圖5C），而在spl9突變體中，TCL1和TRY基因的表達(dá)量顯著下降（圖5D）。這些結(jié)果充分表明，SPL9可以通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子，激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制表皮毛生長(zhǎng)。SPL9對(duì)表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合作用，揭示了miR156-SPLs模塊調(diào)控表皮毛發(fā)育的重要分子機(jī)制，即miR156通過調(diào)控SPLs基因的表達(dá)，影響SPL蛋白與表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)表皮毛發(fā)育的精準(zhǔn)調(diào)控，為深入理解植物表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖5：SPL9與表皮毛發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合及對(duì)基因表達(dá)的影響。A、B為ChIP-QPCR檢測(cè)SPL9與TCL1、TRY啟動(dòng)子的結(jié)合情況，C、D為qRT-PCR檢測(cè)SPL9過表達(dá)突變體和spl9突變體中TCL1、TRY基因的表達(dá)水平。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3），*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。五、miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的機(jī)制探討5.1miR156-SPLs調(diào)控表皮毛發(fā)育的分子途徑基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們構(gòu)建了miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的分子模型，如圖6所示。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，miR156與SPLs基因之間存在著精細(xì)的調(diào)控關(guān)系，這種關(guān)系在表皮毛發(fā)育進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。在幼年期，miR156表達(dá)量較高，它通過與SPLs基因mRNA的特異性結(jié)合，介導(dǎo)mRNA的切割和降解，或抑制其翻譯過程，從而有效抑制SPLs基因的表達(dá)。此時(shí)，由于SPLs蛋白表達(dá)水平較低，對(duì)表皮毛發(fā)育負(fù)調(diào)控因子TCL1和TRY的激活作用受到抑制，TCL1和TRY的表達(dá)量處于較低水平。而在表皮毛發(fā)育的正調(diào)控方面，GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體能夠正常發(fā)揮作用，它們相互協(xié)作，促進(jìn)表皮毛的起始和發(fā)育。GL1作為R2R3類MYB型轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并結(jié)合到表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活這些基因的表達(dá)；GL3和EGL3屬于bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，它們與GL1相互作用，增強(qiáng)GL1對(duì)下游基因的調(diào)控能力；TTG1是WD40重復(fù)蛋白，它能夠穩(wěn)定GL1-GL3蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)表皮毛的起始和發(fā)育。在這種調(diào)控機(jī)制下，表皮毛在蓮座葉近軸面正常發(fā)育，呈現(xiàn)出幼年期的分布特征。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，進(jìn)入成年期的轉(zhuǎn)變過程中，miR156的表達(dá)水平逐漸降低，對(duì)SPLs基因的抑制作用減弱。此時(shí)，SPLs基因的表達(dá)逐漸上升，SPL蛋白表達(dá)量增加。SPL蛋白，如SPL9，能夠通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子區(qū)域，激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)。TCL1和TRY表達(dá)量升高后，它們?cè)诘鞍姿缴吓cGL1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GL3。由于TCL1和TRY與GL3的結(jié)合能力較強(qiáng)，使得GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體的形成受到阻礙，無法有效激活表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制了表皮毛的生長(zhǎng)。在花序軸等部位，這種抑制作用表現(xiàn)為表皮毛數(shù)量逐漸減少，直至花器官（除花萼外）基本無毛，使得表皮毛的分布呈現(xiàn)出成年期的特征。在miR156過表達(dá)突變體中，miR156的過量表達(dá)導(dǎo)致SPLs基因表達(dá)被過度抑制，TCL1和TRY的表達(dá)量極低。此時(shí)，GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體幾乎不受抑制，能夠持續(xù)激活表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致花序軸上部和花柄器官出現(xiàn)異位毛生長(zhǎng)。而在SPL基因過表達(dá)突變體中，SPL蛋白的大量表達(dá)使得TCL1和TRY被過度激活，它們與GL1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GL3的能力大大增強(qiáng)，幾乎完全阻斷了GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體的形成，導(dǎo)致表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，莖桿上表皮毛數(shù)量明顯下降，部分區(qū)域甚至光滑無毛。綜上所述，miR156-SPLs通過調(diào)控表皮毛發(fā)育正調(diào)控因子GL1-GL3-TTG1蛋白復(fù)合體和負(fù)調(diào)控因子TCL1、TRY的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥表皮毛發(fā)育的精準(zhǔn)調(diào)控。這一分子途徑揭示了miR156-SPLs模塊在表皮毛發(fā)育調(diào)控中的核心作用，為深入理解植物表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制提供了重要的理論框架。圖6：miR156-SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的分子模型。在幼年期，miR156高表達(dá)抑制SPLs，表皮毛正常發(fā)育；成年期，miR156低表達(dá)，SPLs激活TCL1和TRY抑制表皮毛發(fā)育。5.2miR156-SPLs調(diào)控與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換的關(guān)系植物的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)高度有序且復(fù)雜的過程，其中發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換是植物生命周期中的關(guān)鍵階段，涉及從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，這一過程受到眾多基因和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控。miR156-SPLs模塊在植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中扮演著核心角色，同時(shí)與表皮毛發(fā)育的調(diào)控緊密相連，共同影響著植物的整體發(fā)育進(jìn)程。在植物從幼年期向成年期轉(zhuǎn)變的過程中，miR156-SPLs模塊發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在幼年期，植物主要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，此時(shí)miR156的表達(dá)水平較高，它通過抑制SPLs基因的表達(dá)，維持植物的幼年期特征。隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156的表達(dá)量逐漸降低，對(duì)SPLs基因的抑制作用減弱，SPL類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)逐漸上升。SPL類轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)促使植物產(chǎn)生成年態(tài)性狀，如葉片形狀的改變、下表皮毛的起始等。研究發(fā)現(xiàn)，隨著植物年齡的增長(zhǎng)，miR156靶標(biāo)的SPL類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)逐漸上升，促使葉片基部表皮細(xì)胞出現(xiàn)各向異性生長(zhǎng)，產(chǎn)生沿著基頂軸方向極性伸長(zhǎng)的巨細(xì)胞，同時(shí)，在巨細(xì)胞的周圍，葉片表皮細(xì)胞的分裂會(huì)更加持續(xù)更久，由此驅(qū)動(dòng)葉片的形狀由圓形變成橢圓形。在表皮毛發(fā)育方面，葉片下表皮毛的發(fā)生是擬南芥進(jìn)入成年期的一個(gè)標(biāo)志，miR156-SPL年齡信號(hào)模塊通過激活miR172的表達(dá)誘導(dǎo)下表皮毛的起始。這些研究結(jié)果表明，miR156-SPLs模塊在植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促使植物形態(tài)和生理特征發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)從幼年期到成年期的順利轉(zhuǎn)變。植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變是植物發(fā)育過程中的另一個(gè)重要階段，miR156-SPLs模塊在這一過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。當(dāng)植物生長(zhǎng)到一定階段，滿足外界環(huán)境條件（如光周期、溫度等）和自身內(nèi)部發(fā)育信號(hào)時(shí)，會(huì)啟動(dòng)從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。在這一轉(zhuǎn)變過程中，miR156-SPLs模塊與其他信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控開花相關(guān)基因的表達(dá)。SPL轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)MIR172基因的表達(dá)，并通過miR172下調(diào)其靶基因從而促進(jìn)植物開花。miR156-SPLs模塊還可能與光周期途徑、春化途徑等相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同調(diào)控植物的開花時(shí)間。在光周期途徑中，光周期信號(hào)通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，影響miR156-SPLs模塊的活性，進(jìn)而調(diào)控開花時(shí)間；在春化途徑中，低溫處理可以改變miR156-SPLs模塊的表達(dá)模式，促進(jìn)植物開花。這些研究表明，miR156-SPLs模塊在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過程中，通過與其他信號(hào)通路的協(xié)同作用，精確調(diào)控開花時(shí)間，確保植物在適宜的環(huán)境條件下完成生殖生長(zhǎng)。miR156-SPLs對(duì)表皮毛發(fā)育的調(diào)控與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，共同影響著植物的整體發(fā)育進(jìn)程。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，表皮毛主要生長(zhǎng)于蓮座葉的近軸面，此時(shí)miR156表達(dá)量較高，抑制SPLs基因表達(dá)，表皮毛正常發(fā)育。隨著植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，miR156表達(dá)量下降，SPLs基因表達(dá)上升，表皮毛數(shù)量隨著花序軸的延伸而減少，直至花器官（除花萼外）基本無毛。這一現(xiàn)象表明，miR156-SPLs模塊在調(diào)控表皮毛發(fā)育的同時(shí)，也與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換的進(jìn)程相協(xié)調(diào)，使得表皮毛的分布和發(fā)育與植物的整體生長(zhǎng)發(fā)育階段相適應(yīng)。從進(jìn)化的角度來看，這種協(xié)調(diào)作用具有重要意義，它有助于植物在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段更好地適應(yīng)環(huán)境，提高植物的生存和繁殖能力。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，表皮毛的存在可以保護(hù)植物免受外界環(huán)境的傷害，如減少水分蒸發(fā)、抵御昆蟲和病原菌的侵害等；而在生殖生長(zhǎng)階段，減少表皮毛的數(shù)量可以減少能量的消耗，有利于植物將更多的能量用于花器官的發(fā)育和種子的形成。綜上所述，miR156-SPLs模塊在植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，通過與其他信號(hào)通路的協(xié)同作用，精確調(diào)控植物從幼年期到成年期的轉(zhuǎn)變以及從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。同時(shí)，miR156-SPLs對(duì)表皮毛發(fā)育的調(diào)控與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，共同影響著植物的整體發(fā)育進(jìn)程。深入研究miR156-SPLs模塊在植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換和表皮毛發(fā)育調(diào)控中的作用機(jī)制，不僅有助于我們?nèi)胬斫庵参锷L(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，還為利用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物性狀、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。5.3miR156-SPLs調(diào)控機(jī)制的普遍性與特異性在植物界中，miR156-SPLs模塊在表皮毛發(fā)育或類似結(jié)構(gòu)發(fā)育的調(diào)控中存在一定的普遍性。許多植物中都存在miR156及其靶基因SPLs，且它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育調(diào)控方面具有保守性。在水稻中，miR156-SPLs模塊參與調(diào)控水稻的分蘗、株型和開花時(shí)間等重要農(nóng)藝性狀。在柳枝稷中，miR156靶基因SPL2編碼的蛋白能夠與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)通路核心蛋白D53相互作用，還能通過激活植物側(cè)分枝氧化還原酶基因LBO的表達(dá)增強(qiáng)獨(dú)腳金內(nèi)酯合成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物分蘗數(shù)目的精準(zhǔn)控制。在番茄中，miR156-SPLs模塊也參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，影響番茄的株型、開花時(shí)間和果實(shí)發(fā)育等。從表皮毛發(fā)育調(diào)控角度來看，雖然不同植物的表皮毛形態(tài)和分布存在差異，但miR156-SPLs模塊在調(diào)控表皮毛發(fā)育方面具有一些相似的機(jī)制。在棉花中，棉纖維作為一種特殊的表皮毛，其發(fā)育也可能受到miR156-SPLs模塊的調(diào)控。研究表明，棉花植物中miR156的含量很高，其對(duì)棉纖維發(fā)育的調(diào)控作用值得進(jìn)一步探討。雖然目前關(guān)于棉花中miR156-SPLs模塊調(diào)控棉纖維發(fā)育的具體分子機(jī)制尚未完全明確，但從擬南芥和其他植物的研究結(jié)果推測(cè)，miR156可能通過調(diào)控SPLs基因的表達(dá)，影響棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控棉纖維的起始、伸長(zhǎng)和分化等過程。這表明在不同植物中，miR156-SPLs模塊在表皮毛或類似結(jié)構(gòu)發(fā)育調(diào)控方面可能存在一定的共性，即通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來影響表皮毛的發(fā)育進(jìn)程。擬南芥中miR156-SPLs調(diào)控表皮毛發(fā)育也具有其獨(dú)特性。在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中，SPL9可以通過直接結(jié)合TCL1和TRY的啟動(dòng)子來激活這兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，抑制表皮毛生長(zhǎng)。這種直接結(jié)合啟動(dòng)子激活負(fù)調(diào)控因子的調(diào)控方式在其他植物中尚未有完全相同的報(bào)道。擬南芥表皮毛在不同發(fā)育時(shí)期和不同器官上的分布特征具有獨(dú)特性。在營(yíng)養(yǎng)發(fā)育時(shí)期，表皮毛主要生長(zhǎng)于蓮座葉的近軸面；而當(dāng)植物進(jìn)入生殖發(fā)育期，表皮毛的數(shù)量隨著花序軸的延伸而減少，直至花器官（除花萼外）基本無毛。這種分布特征與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，且miR156-SPLs模塊在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。在其他植物中，表皮毛的分布和發(fā)育與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)換的關(guān)系可能存在差異，miR156-SPLs模塊的調(diào)控方式也可能有所不同。在擬南芥葉片下表皮毛的發(fā)育過程中，miR156-SPL年齡信號(hào)模塊通過激活miR172的表達(dá)誘導(dǎo)下表皮毛的起始。miR172的靶基因蛋白AP2類轉(zhuǎn)錄因子(例如TOE1)與葉片極性調(diào)控因子KAN1互作，該復(fù)合體可以結(jié)合在表皮毛關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GL1的3’端調(diào)控序列(稱為REAT)上，抑制GL1的表達(dá)。當(dāng)植物進(jìn)入成年期后，由于miR156-SPL信號(hào)模塊的增強(qiáng)，miR172表達(dá)升高，導(dǎo)致TOE1蛋白含量降低，TOE1-KAN1復(fù)合體逐漸解離，從而釋放它對(duì)GL1的抑制作用，誘發(fā)下表皮毛的產(chǎn)生。這種通過多個(gè)基因之間復(fù)雜的相互作用來調(diào)控表皮毛發(fā)育的機(jī)制在其他植物中也較為少見。綜上所述，miR156-SPLs模塊在植物表皮毛發(fā)育調(diào)控中既有普遍性，又有擬南芥特有的調(diào)控特點(diǎn)。對(duì)這些普遍性和特異性的深入研究，有助于我們更好地理解植物表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制，為研究其他植物的表皮毛發(fā)育提供參考，也為利用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物表皮毛性狀提供理論依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞miR156-靶基因SPLs調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育展開深入探究，通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多學(xué)科研究方法，取得了以下重要研究成果。在miR156和SPLs基因的表達(dá)分析方面，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和原位雜交技術(shù)，明確了miR156和SPLs基因在擬南芥不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，miR156在蓮座葉中高表達(dá)，抑制SPLs基因表達(dá)；隨著植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，miR156表達(dá)量降低，SPLs基因表達(dá)量上升，且它們的表達(dá)變化與表皮毛的發(fā)育進(jìn)程緊密相關(guān)。通過構(gòu)建過表達(dá)載體和敲除載體，對(duì)miR156和SPLs基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR156過表達(dá)導(dǎo)致花序軸上部和花柄器官出現(xiàn)異位毛生長(zhǎng)，而SPL基因過表達(dá)則使莖桿上表皮毛數(shù)量下降甚至光滑無毛；miR156和S