人APE1單克隆抗體制備及腫瘤血清學(xué)檢測應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景腫瘤作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2020年全球癌癥新發(fā)病例達1930萬例，死亡病例達1000萬例，且這一數(shù)字預(yù)計在未來還將持續(xù)增長。腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及到基因、環(huán)境、生活方式等多種因素的相互作用。目前，盡管在腫瘤的診斷和治療方面取得了一定的進展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如早期診斷困難、治療效果不佳、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問題。因此，深入研究腫瘤的發(fā)病機制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點，對于提高腫瘤的早期診斷率、改善治療效果、降低死亡率具有重要的意義。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷對腫瘤的預(yù)防和治療至關(guān)重要，是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。在腫瘤的早期階段，腫瘤細胞數(shù)量較少，尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時進行治療往往能夠取得較好的效果，甚至可以實現(xiàn)根治。然而，由于腫瘤在早期通常沒有明顯的癥狀，很難被患者察覺，導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于中晚期，錯過了最佳的治療時機。因此，尋找一種高敏感、高特異性的腫瘤標(biāo)志物或建立一種新的腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測方法，對于腫瘤的早期診斷具有重要的意義。腫瘤標(biāo)志物作為腫瘤臨床診斷的常規(guī)手段之一，對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和療效觀察具有重要意義。隨著ELISA、RT-PCR、FISH、SELDI-TOF、蛋白質(zhì)組學(xué)、組織芯片和基因芯片等生物技術(shù)的飛速發(fā)展，使得許多具有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物逐一被發(fā)現(xiàn)。然而，目前仍無任何一種腫瘤標(biāo)志物可對惡性腫瘤進行準確診斷和預(yù)后預(yù)測，腫瘤的實驗室診斷尚缺乏高敏感性和高特異性的檢測方法?，F(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物存在特異性和陽性率低的缺點，不能很好達到腫瘤“早期診斷”這一目的。對腫瘤標(biāo)志物進行聯(lián)合檢測雖能提高惡性腫瘤診斷的靈敏度及特異度，但仍存在診斷總準確率不高的缺陷。人脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（Humanapurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxfactor1，hAPE1）是DNA損傷堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair，BER）途徑的關(guān)鍵酶，是一種多功能蛋白質(zhì)，具有修復(fù)AP位點和氧化還原雙重功能，與細胞凋亡，腫瘤細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化，放化療敏感性以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化有著密切的關(guān)系。國內(nèi)外研究表明，hAPE1蛋白在機體各器官組織中均有表達，而腫瘤組織中的hAPE1定位和表達與相應(yīng)的正常組織有顯著差異，其表達水平與腫瘤放化療抵抗有關(guān)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達顯著高于正常人。因此，hAPE1的表達水平（和/或類型）可作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPE1有望成為腫瘤早期診斷中一項敏感而特異的指標(biāo)。我們推測，對hAPE1進行血清學(xué)檢測可能有助于惡性腫瘤的早期臨床診斷，并有效判斷腫瘤細胞放療和化療的敏感性。1.2研究目的與意義本研究旨在制備人APE1單克隆抗體，并將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測，通過系統(tǒng)的實驗和分析，為腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測提供新的方法和依據(jù)，具體目的如下：制備高特異性人APE1單克隆抗體：通過基因工程技術(shù)構(gòu)建hAPE1原核表達載體，誘導(dǎo)表達并純化hAPE1融合蛋白，以該融合蛋白為抗原免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備并純化hAPE1單克隆抗體，為后續(xù)的血清學(xué)檢測提供高質(zhì)量的抗體工具。建立基于人APE1單克隆抗體的腫瘤血清學(xué)檢測方法：利用制備的hAPE1單克隆抗體，建立酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等血清學(xué)檢測方法，檢測腫瘤患者和正常人血清中的hAPE1蛋白水平，分析其在腫瘤診斷中的潛在價值。評估人APE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用價值：通過與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢測方法進行比較，評估hAPE1單克隆抗體在腫瘤診斷中的靈敏度、特異性和準確性，探討其在腫瘤早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估中的應(yīng)用前景。腫瘤嚴重威脅人類健康，早期診斷對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前腫瘤標(biāo)志物檢測存在局限性，如特異性和陽性率低，聯(lián)合檢測準確率仍不理想。hAPE1作為DNA損傷修復(fù)和氧化還原調(diào)控的關(guān)鍵酶，在腫瘤組織中表達和定位與正常組織差異顯著，且腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達明顯升高，有望成為新型腫瘤標(biāo)志物。本研究制備人APE1單克隆抗體并用于腫瘤血清學(xué)檢測，具有以下重要意義：提高腫瘤診斷準確性：hAPE1單克隆抗體具有高度特異性和親和力，能夠準確識別血清中的hAPE1蛋白，為腫瘤的診斷提供更可靠的指標(biāo)，有助于提高腫瘤的早期診斷率，減少誤診和漏診。為腫瘤治療提供指導(dǎo)：hAPE1的表達水平與腫瘤放化療抵抗相關(guān)，通過檢測血清中hAPE1蛋白水平，可幫助醫(yī)生了解腫瘤細胞的生物學(xué)特性，預(yù)測患者對放化療的敏感性，為制定個性化的治療方案提供依據(jù)，提高治療效果。推動腫瘤標(biāo)志物研究發(fā)展：本研究為腫瘤標(biāo)志物的研究提供了新的思路和方法，豐富了腫瘤標(biāo)志物的種類，有助于進一步完善腫瘤診斷和監(jiān)測體系，促進腫瘤醫(yī)學(xué)的發(fā)展。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用基因工程、細胞工程和免疫學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和科學(xué)的分析方法，實現(xiàn)人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用研究，具體研究方法如下：基因工程技術(shù)：從人源細胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）擴增hAPE1基因，將擴增得到的hAPE1基因片段與原核表達載體pET-32a(+)進行雙酶切，然后利用T4DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1。將重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序驗證，確保hAPE1基因序列的準確性。細胞工程技術(shù)：將測序正確的重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)hAPE1融合蛋白的表達。通過超聲破碎菌體，采用鎳離子親和層析柱對hAPE1融合蛋白進行純化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）鑒定純化蛋白的純度和特異性。選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，將純化的hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化后，進行腹腔注射免疫，初次免疫后，每隔2周用hAPE1融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后進行加強免疫，共免疫3-4次。在融合前3天，對小鼠進行尾靜脈注射hAPE1融合蛋白進行最后一次加強免疫。取免疫小鼠的脾臟，制備脾細胞懸液，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）進行細胞融合。將融合后的細胞接種于含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的HAT培養(yǎng)基中進行選擇性培養(yǎng)，篩選出雜交瘤細胞。采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)，通過間接ELISA法篩選出穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將篩選得到的雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)后，接種于BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，7-10天后收集小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨沉淀法對腹水中的hAPE1單克隆抗體進行純化。免疫學(xué)技術(shù)：以純化的hAPE1融合蛋白為包被抗原，采用間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的抗體效價，確定最佳包被抗原濃度和抗體稀釋度。利用Westernblot法檢測hAPE1單克隆抗體與hAPE1蛋白的特異性結(jié)合能力，以及與其他相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)性。采用競爭抑制ELISA法測定hAPE1單克隆抗體的親和力常數(shù)，評估抗體的親和力。收集腫瘤患者和正常人的血清樣本，采用建立的ELISA方法檢測血清中的hAPE1蛋白水平，分析hAPE1蛋白水平與腫瘤類型、分期、分級等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），評估hAPE1單克隆抗體在腫瘤診斷中的靈敏度、特異性和準確性。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先通過基因工程技術(shù)構(gòu)建hAPE1原核表達載體，誘導(dǎo)表達并純化hAPE1融合蛋白，然后以該融合蛋白為抗原免疫小鼠，利用細胞工程技術(shù)中的雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備并純化hAPE1單克隆抗體，最后運用免疫學(xué)技術(shù)對hAPE1單克隆抗體的生物學(xué)特性進行鑒定，并將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測，評估其在腫瘤診斷中的應(yīng)用價值。[此處插入圖1-1：人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用研究技術(shù)路線圖][此處插入圖1-1：人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用研究技術(shù)路線圖]二、人APE1融合蛋白的表達與純化2.1材料與方法2.1.1實驗材料菌株與載體：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達載體pET-32a(+)，本實驗室保存。工具酶與試劑：限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII，T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker，購自ThermoFisherScientific公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp），購自Sigma公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；鎳離子親和層析柱（HisTrapHP），購自GEHealthcare公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍R-250，購自Solarbio公司；蛋白Marker，購自ThermoFisherScientific公司；硝酸纖維素膜（NC膜），購自Millipore公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自JacksonImmunoResearch公司；化學(xué)發(fā)光底物（ECL），購自ThermoFisherScientific公司。實驗動物：6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于本實驗室動物房，環(huán)境溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±10)%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由飲食和飲水。2.1.2實驗方法hAPE1基因的獲?。簭娜嗽醇毎ㄈ鏗eLa細胞）中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中hAPE1基因序列（登錄號：NM_001615.4），設(shè)計特異性引物，上游引物：5'-CGGGATCCATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'（下劃線部分為BamHI酶切位點），下游引物：5'-CCCAAGCTTTTAGTCAGCAGCAGCAGC-3'（下劃線部分為HindIII酶切位點）。以cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：cDNA1μL，上下游引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，5×PCRBuffer10μL，高保真DNA聚合酶1μL，ddH?O補足至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。重組表達載體的構(gòu)建：將回收的hAPE1基因片段和原核表達載體pET-32a(+)分別用BamHI和HindIII進行雙酶切，酶切體系為：DNA1μg，10×Buffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，ddH?O補足至20μL，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的hAPE1基因片段和pET-32a(+)載體片段。將回收的hAPE1基因片段和pET-32a(+)載體片段用T4DNA連接酶進行連接，連接體系為：hAPE1基因片段50ng，pET-32a(+)載體片段10ng，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補足至10μL，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，具體操作如下：取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用BamHI和HindIII進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司測序，測序結(jié)果與GenBank中hAPE1基因序列比對，確認無誤后命名為pET-32a(+)-hAPE1。融合蛋白的表達：將測序正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，具體操作同轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。將種子液按1:100的比例接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)4h誘導(dǎo)hAPE1融合蛋白的表達。取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液各1mL，12000rpm離心1min，收集菌體，加入適量的PBS重懸菌體，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，進行SDS分析，檢測hAPE1融合蛋白的表達情況。融合蛋白的純化：誘導(dǎo)表達結(jié)束后，將菌液4℃、6000rpm離心15min，收集菌體。用預(yù)冷的PBS重懸菌體，超聲破碎（功率300W，工作3s，間隔5s，共10min），使菌體充分裂解。4℃、12000rpm離心30min，收集上清液，即為hAPE1融合蛋白粗提液。將粗提液用0.45μm濾膜過濾后，上樣到預(yù)先用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡好的鎳離子親和層析柱（HisTrapHP）上，流速為1mL/min。上樣結(jié)束后，用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗柱子，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）進行洗脫，收集洗脫峰，每管收集1mL。將收集的洗脫液進行SDS分析，檢測hAPE1融合蛋白的純度，將純度較高的洗脫液合并，用超濾管（截留分子量為10kDa）濃縮至合適體積，保存于-80℃?zhèn)溆?。融合蛋白的鑒定：采用SDS和Westernblot對純化后的hAPE1融合蛋白進行鑒定。SDS分析：將純化后的hAPE1融合蛋白與蛋白Marker一起進行12%SDS電泳，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍R-250染色液染色30min，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察蛋白條帶的位置和純度。Westernblot分析：將SDS電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件為：200mA，90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h；加入鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋），室溫孵育1h；用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min；加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，觀察蛋白條帶的位置和特異性。2.2結(jié)果重組表達載體的鑒定：以人源細胞cDNA為模板，通過PCR擴增得到hAPE1基因片段，大小約為900bp，與預(yù)期大小相符（圖2-1A）。將hAPE1基因片段與pET-32a(+)載體進行雙酶切和連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。雙酶切后得到兩條片段，一條約為5900bp，為pET-32a(+)載體片段，另一條約為900bp，為hAPE1基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2-1B）。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司測序，測序結(jié)果與GenBank中hAPE1基因序列比對，同源性為100%，表明重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1構(gòu)建成功。[此處插入圖2-1：hAPE1基因PCR擴增及重組表達載體雙酶切鑒定結(jié)果。A：hAPE1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，M：DNAMarker；1：hAPE1基因PCR擴增產(chǎn)物。B：重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：pET-32a(+)-hAPE1雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖2-1：hAPE1基因PCR擴增及重組表達載體雙酶切鑒定結(jié)果。A：hAPE1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，M：DNAMarker；1：hAPE1基因PCR擴增產(chǎn)物。B：重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：pET-32a(+)-hAPE1雙酶切產(chǎn)物]融合蛋白的表達：將重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，進行SDS分析。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)前，未出現(xiàn)特異性條帶；誘導(dǎo)后，在相對分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶，與預(yù)期的hAPE1融合蛋白（含His標(biāo)簽和Trx標(biāo)簽）大小相符，而空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞在誘導(dǎo)前后均未出現(xiàn)該條帶（圖2-2），表明hAPE1融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。[此處插入圖2-2：hAPE1融合蛋白表達的SDS分析。M：蛋白Marker；1：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)前；2：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)后；3：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)前；4：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)后][此處插入圖2-2：hAPE1融合蛋白表達的SDS分析。M：蛋白Marker；1：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)前；2：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)后；3：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)前；4：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞誘導(dǎo)后]融合蛋白的純化：將誘導(dǎo)表達后的菌體超聲破碎，離心取上清，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化hAPE1融合蛋白。收集洗脫峰，進行SDS分析，結(jié)果顯示，純化后的hAPE1融合蛋白在相對分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)單一的條帶，表明融合蛋白得到了有效純化（圖2-3）。采用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后的hAPE1融合蛋白濃度為1.5mg/mL。[此處插入圖2-3：hAPE1融合蛋白純化的SDS分析。M：蛋白Marker；1：純化前的hAPE1融合蛋白粗提液；2-5：鎳離子親和層析柱洗脫的hAPE1融合蛋白洗脫峰][此處插入圖2-3：hAPE1融合蛋白純化的SDS分析。M：蛋白Marker；1：純化前的hAPE1融合蛋白粗提液；2-5：鎳離子親和層析柱洗脫的hAPE1融合蛋白洗脫峰]融合蛋白的鑒定：采用Westernblot對純化后的hAPE1融合蛋白進行鑒定，以鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗。結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS結(jié)果一致，表明純化后的蛋白為帶有His標(biāo)簽的hAPE1融合蛋白（圖2-4）。[此處插入圖2-4：hAPE1融合蛋白的Westernblot鑒定。M：蛋白Marker；1：純化后的hAPE1融合蛋白][此處插入圖2-4：hAPE1融合蛋白的Westernblot鑒定。M：蛋白Marker；1：純化后的hAPE1融合蛋白]2.3討論在表達載體構(gòu)建過程中，引物設(shè)計是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若引物特異性不足，可能導(dǎo)致非特異性擴增，使后續(xù)載體構(gòu)建失敗。本研究通過對hAPE1基因序列的仔細分析，利用專業(yè)的引物設(shè)計軟件，設(shè)計出特異性強的引物，成功擴增出目的基因片段。在酶切和連接反應(yīng)中，反應(yīng)體系的優(yōu)化至關(guān)重要。酶切時間過短可能導(dǎo)致酶切不完全，影響連接效率；連接反應(yīng)條件不合適，如溫度、時間等，也會降低重組載體的構(gòu)建成功率。本研究通過預(yù)實驗，確定了最佳的酶切時間和連接反應(yīng)條件，提高了重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1的構(gòu)建效率。融合蛋白表達方面，IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對表達量有顯著影響。若IPTG濃度過低或誘導(dǎo)時間過短，融合蛋白表達量可能不足；而IPTG濃度過高或誘導(dǎo)時間過長，可能導(dǎo)致蛋白表達異常，如形成包涵體。本研究通過設(shè)置不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)時間梯度，進行表達條件優(yōu)化，確定了0.5mMIPTG誘導(dǎo)4h為最佳表達條件，使hAPE1融合蛋白獲得了較高的表達量。在融合蛋白純化過程中，鎳離子親和層析柱的選擇和使用是關(guān)鍵。不同品牌和型號的層析柱，其結(jié)合能力和洗脫效果可能存在差異。本研究選用了GEHealthcare公司的HisTrapHP鎳離子親和層析柱，該層析柱具有較高的結(jié)合能力和良好的洗脫效果，能夠有效純化hAPE1融合蛋白。在洗脫過程中，咪唑濃度的控制對蛋白純度和活性有重要影響。咪唑濃度過低，可能無法有效洗脫融合蛋白；咪唑濃度過高，可能會影響蛋白的活性。本研究通過優(yōu)化洗脫緩沖液中咪唑的濃度，獲得了高純度的hAPE1融合蛋白。本研究成功構(gòu)建了重組表達載體pET-32a(+)-hAPE1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達和純化得到hAPE1融合蛋白。通過對表達載體構(gòu)建和融合蛋白表達純化過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的優(yōu)化，解決了可能出現(xiàn)的問題，為后續(xù)制備人APE1單克隆抗體及腫瘤血清學(xué)檢測奠定了堅實的基礎(chǔ)。三、人APE1單克隆抗體的制備3.1材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：小鼠骨髓瘤細胞SP2/0，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；胎牛血清（FBS），購自HyClone公司；HAT培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷），購自Sigma公司；HT培養(yǎng)基（含次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷），購自Sigma公司。免疫佐劑：弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司。主要試劑：聚乙二醇（PEG，分子量為4000），購自Sigma公司；小牛血清白蛋白（BSA），購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自JacksonImmunoResearch公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，購自Solarbio公司；終止液（2MH?SO?），購自Solarbio公司；ELISA板，購自Corning公司；96孔細胞培養(yǎng)板，購自Corning公司；細胞凍存液（含10%DMSO、90%FBS），購自Sigma公司。3.1.2實驗方法動物免疫：選取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，將純化的hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑按1:1比例混合乳化后，對小鼠進行腹腔注射免疫，免疫劑量為100μg/只。初次免疫后，每隔2周用hAPE1融合蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1比例混合乳化后進行加強免疫，共免疫3-4次。在融合前3天，對小鼠進行尾靜脈注射hAPE1融合蛋白（50μg/只）進行最后一次加強免疫。細胞融合：在最后一次加強免疫3天后，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，置于盛有預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，用鑷子輕輕擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將小鼠骨髓瘤細胞SP2/0培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次。將脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0按4:1的比例混合于50mL離心管中，加入30mL預(yù)冷的RPMI1640培養(yǎng)基，1200rpm離心10min，棄上清，輕輕彈散細胞沉淀。在37℃水浴條件下，緩慢滴加1mL預(yù)熱至37℃的PEG（4000）溶液，邊滴加邊輕輕攪拌，滴加時間約為1min，然后繼續(xù)攪拌1min。接著，在1min內(nèi)緩慢滴加10mL預(yù)熱至37℃的RPMI1640培養(yǎng)基，以終止PEG的作用。再加入30mLRPMI1640培養(yǎng)基，1200rpm離心10min，棄上清。雜交瘤細胞篩選：將融合后的細胞用含有20%FBS的HAT培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第3天，觀察細胞生長情況，補加100μL含有20%FBS的HAT培養(yǎng)基。在培養(yǎng)第5天，換用含有20%FBS的HT培養(yǎng)基，每孔100μL。在培養(yǎng)第7天，采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，篩選出陽性雜交瘤細胞孔。雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)：采用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)。將陽性雜交瘤細胞用含有20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行梯度稀釋，使細胞密度分別為5個/mL、10個/mL、20個/mL。將稀釋后的細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，即每孔含細胞數(shù)分別為0.5個、1個、2個，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞克隆長出后，采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，篩選出穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。對篩選出的雜交瘤細胞株進行多次克隆化培養(yǎng)，直至所有克隆細胞均能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體。3.2結(jié)果雜交瘤細胞株的篩選：經(jīng)過細胞融合和HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，共接種96孔細胞培養(yǎng)板8塊，即768個孔。在培養(yǎng)第7天，采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，以未免疫小鼠血清作為陰性對照，確定A450nm值大于陰性對照2.1倍的孔為陽性孔。結(jié)果顯示，共有56個孔檢測為陽性，陽性率為7.3%。對陽性孔進行多次檢測，確保結(jié)果的可靠性，并從中選取A450nm值較高且穩(wěn)定的陽性孔進行后續(xù)的克隆化培養(yǎng)。雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)：采用有限稀釋法對56個陽性雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)。將陽性雜交瘤細胞用含有20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行梯度稀釋，使細胞密度分別為5個/mL、10個/mL、20個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。經(jīng)過多次克隆化培養(yǎng)和ELISA檢測，最終篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1H3、2F5和3C7。這3株雜交瘤細胞在連續(xù)傳代10次后，仍能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體，表明其具有良好的穩(wěn)定性。3.3討論在單克隆抗體制備過程中，免疫方案的合理性對抗體產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。免疫劑量不足或免疫次數(shù)過少，可能無法有效激活B淋巴細胞，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體效價較低。本研究采用初次免疫時hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，加強免疫時與弗氏不完全佐劑混合乳化的方式，通過多次免疫，使小鼠產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答，為后續(xù)獲得高效價的抗體奠定了基礎(chǔ)。免疫途徑也會影響免疫效果，不同的免疫途徑，如腹腔注射、皮下注射、靜脈注射等，其抗原吸收速度和免疫反應(yīng)強度存在差異。本研究選擇腹腔注射作為主要免疫途徑，該途徑操作相對簡便，抗原吸收較快，能夠有效刺激小鼠的免疫系統(tǒng)。細胞融合是制備單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，融合條件對融合效率和雜交瘤細胞的質(zhì)量有重要影響。PEG作為常用的促融合劑，其分子量、濃度和作用時間是影響細胞融合的重要因素。PEG分子量過大或濃度過高，可能對細胞造成較大的毒性，導(dǎo)致細胞死亡率增加；PEG作用時間過短，融合效率可能較低；作用時間過長，同樣會對細胞產(chǎn)生不良影響。本研究通過預(yù)實驗，確定了分子量為4000的PEG，在37℃水浴條件下，緩慢滴加1mL預(yù)熱至37℃的PEG溶液，邊滴加邊輕輕攪拌，滴加時間約為1min，然后繼續(xù)攪拌1min，接著在1min內(nèi)緩慢滴加10mL預(yù)熱至37℃的RPMI1640培養(yǎng)基以終止PEG作用的最佳融合條件，提高了細胞融合效率。在雜交瘤細胞篩選過程中，HAT培養(yǎng)基的使用是篩選出雜交瘤細胞的關(guān)鍵。HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡；未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡；只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。在篩選過程中，檢測方法的靈敏度和準確性直接影響到陽性雜交瘤細胞的篩選結(jié)果。本研究采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，該方法具有靈敏度高、操作簡便、快速等優(yōu)點，能夠準確篩選出分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞。本研究通過優(yōu)化免疫方案、細胞融合條件和雜交瘤細胞篩選方法，成功篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。這些關(guān)鍵因素的優(yōu)化和控制，為制備高質(zhì)量的人APE1單克隆抗體提供了保障，也為后續(xù)將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測奠定了堅實的基礎(chǔ)。四、人APE1單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定4.1材料與方法4.1.1實驗材料抗原：純化的hAPE1融合蛋白，由本實驗室制備保存；牛血清白蛋白（BSA），購自Sigma公司，用于封閉非特異性結(jié)合位點。酶標(biāo)二抗：辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自JacksonImmunoResearch公司，用于檢測與抗原結(jié)合的單克隆抗體。試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），用于洗滌和稀釋試劑；5%脫脂奶粉，用PBS配制，用于封閉ELISA板；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，購自Solarbio公司，用于ELISA顯色反應(yīng)；終止液（2MH?SO?），購自Solarbio公司，用于終止顯色反應(yīng)；ELISA板，購自Corning公司；96孔細胞培養(yǎng)板，購自Corning公司；抗體亞型鑒定試劑盒，購自SouthernBiotech公司，用于鑒定單克隆抗體的亞型。4.1.2實驗方法抗體效價測定：采用間接ELISA法測定hAPE1單克隆抗體的效價。將純化的hAPE1融合蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清或小鼠腹水用PBS進行倍比稀釋，從1:100開始，每孔加入100μL稀釋后的抗體，同時設(shè)置陰性對照（PBS）和陽性對照（已知陽性抗體），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD???）。以O(shè)D???值大于陰性對照2.1倍的最大抗體稀釋度作為該抗體的效價?？贵w特異性鑒定：采用Westernblot和ELISA兩種方法鑒定hAPE1單克隆抗體的特異性。Westernblot鑒定：將純化的hAPE1融合蛋白和其他相關(guān)蛋白（如無關(guān)蛋白、與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白等）進行SDS-PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉NC膜1h。加入hAPE1單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，觀察是否僅在hAPE1融合蛋白對應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性條帶。ELISA鑒定：將純化的hAPE1融合蛋白、無關(guān)蛋白和與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白分別用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入hAPE1單克隆抗體（1:1000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD???值。比較hAPE1單克隆抗體與不同蛋白結(jié)合后的OD???值，判斷其特異性?？贵w親和力測定：采用ELISA競爭抑制法測定hAPE1單克隆抗體的親和力。將純化的hAPE1融合蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。將hAPE1單克隆抗體用PBS稀釋至一定濃度（如1:1000），取100μL加入ELISA板中，同時加入不同濃度的游離hAPE1融合蛋白（0、10、50、100、500、1000ng/mL），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD???值。以O(shè)D???值為縱坐標(biāo)，游離hAPE1融合蛋白濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制競爭抑制曲線。根據(jù)公式計算抗體的親和力常數(shù)（K?）：K?=1/IC??，其中IC??為抑制50%抗體結(jié)合所需的游離抗原濃度?？贵w亞型鑒定：采用抗體亞型鑒定試劑盒（SouthernBiotech公司）鑒定hAPE1單克隆抗體的亞型。按照試劑盒說明書進行操作，將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清或純化的單克隆抗體加入酶標(biāo)板中，依次加入相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，37℃孵育，洗滌后加入顯色劑顯色，根據(jù)顯色結(jié)果判斷抗體的亞型。4.2結(jié)果抗體效價：采用間接ELISA法測定3株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的抗體效價。結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的抗體效價分別為1:1600、1:3200和1:6400；小鼠腹水的抗體效價分別為1:128000、1:256000和1:512000（表4-1）。表明3株雜交瘤細胞均能分泌高效價的hAPE1單克隆抗體，其中3C7雜交瘤細胞分泌的抗體效價最高。[此處插入表4-1：hAPE1單克隆抗體效價測定結(jié)果][此處插入表4-1：hAPE1單克隆抗體效價測定結(jié)果]抗體特異性：Westernblot結(jié)果顯示，hAPE1單克隆抗體僅在hAPE1融合蛋白對應(yīng)的相對分子質(zhì)量約48kDa處出現(xiàn)特異性條帶，而與無關(guān)蛋白和其他相關(guān)蛋白均無交叉反應(yīng)條帶出現(xiàn)（圖4-1A）。ELISA結(jié)果表明，hAPE1單克隆抗體與hAPE1融合蛋白結(jié)合后的OD???值顯著高于與無關(guān)蛋白和結(jié)構(gòu)相似蛋白結(jié)合后的OD???值（P<0.01），且與無關(guān)蛋白和結(jié)構(gòu)相似蛋白結(jié)合后的OD???值與陰性對照無明顯差異（P>0.05）（圖4-1B）。以上結(jié)果說明制備的hAPE1單克隆抗體具有高度特異性，能夠特異性識別hAPE1蛋白。[此處插入圖4-1：hAPE1單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果。A：Westernblot鑒定結(jié)果，M：蛋白Marker；1：hAPE1融合蛋白；2：無關(guān)蛋白；3：與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白。B：ELISA鑒定結(jié)果，*P<0.01，與hAPE1融合蛋白組相比；ns，無顯著性差異，與陰性對照組相比][此處插入圖4-1：hAPE1單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果。A：Westernblot鑒定結(jié)果，M：蛋白Marker；1：hAPE1融合蛋白；2：無關(guān)蛋白；3：與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白。B：ELISA鑒定結(jié)果，*P<0.01，與hAPE1融合蛋白組相比；ns，無顯著性差異，與陰性對照組相比]抗體親和力：采用ELISA競爭抑制法測定hAPE1單克隆抗體的親和力，以O(shè)D???值為縱坐標(biāo)，游離hAPE1融合蛋白濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制競爭抑制曲線（圖4-2）。根據(jù)公式計算抗體的親和力常數(shù)（K?），結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7單克隆抗體的親和力常數(shù)分別為1.2×10?L/mol、2.5×10?L/mol和3.8×10?L/mol。表明3株單克隆抗體均具有較高的親和力，其中3C7單克隆抗體的親和力最高。[此處插入圖4-2：hAPE1單克隆抗體親和力測定競爭抑制曲線][此處插入圖4-2：hAPE1單克隆抗體親和力測定競爭抑制曲線]抗體亞型鑒定：采用抗體亞型鑒定試劑盒鑒定hAPE1單克隆抗體的亞型。結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7單克隆抗體均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈（表4-2）。[此處插入表4-2：hAPE1單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果][此處插入表4-2：hAPE1單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果]4.3討論抗體的生物學(xué)特性對于其在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用具有至關(guān)重要的影響，主要體現(xiàn)在效價、特異性、親和力和亞型等方面。高抗體效價意味著在血清學(xué)檢測中能夠更靈敏地檢測到目標(biāo)抗原。本研究中，3株雜交瘤細胞分泌的hAPE1單克隆抗體均具有較高的效價，其中3C7雜交瘤細胞分泌的抗體效價最高。這使得在后續(xù)的腫瘤血清學(xué)檢測中，能夠以較低的抗體濃度進行檢測，提高檢測的靈敏度，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。例如，在ELISA檢測中，高效價的抗體可以與低濃度的抗原充分結(jié)合，產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)，從而準確地檢測出血清中hAPE1蛋白的含量。如果抗體效價較低，可能需要使用更高濃度的抗體，這不僅增加了檢測成本，還可能引入更多的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準確性下降?？贵w的特異性是保證檢測結(jié)果準確性的關(guān)鍵。本研究通過Westernblot和ELISA兩種方法鑒定，證實hAPE1單克隆抗體具有高度特異性，僅與hAPE1蛋白特異性結(jié)合，而與無關(guān)蛋白和其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。這使得在腫瘤血清學(xué)檢測中，能夠準確地區(qū)分hAPE1蛋白與其他類似蛋白，避免了因非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。在復(fù)雜的血清樣本中，存在著多種蛋白質(zhì)，如果抗體特異性不足，可能會與其他蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。而高特異性的hAPE1單克隆抗體能夠準確地識別并結(jié)合hAPE1蛋白，為腫瘤的診斷提供可靠的依據(jù)。親和力反映了抗體與抗原結(jié)合的緊密程度。本研究中，3株單克隆抗體均具有較高的親和力，其中3C7單克隆抗體的親和力最高。高親和力的抗體在腫瘤血清學(xué)檢測中具有重要優(yōu)勢，它能夠更牢固地與抗原結(jié)合，抵抗外界因素的干擾，提高檢測的穩(wěn)定性和可靠性。在血清學(xué)檢測過程中，可能會受到溫度、pH值等因素的影響，如果抗體親和力較低，抗原抗體復(fù)合物可能會發(fā)生解離，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。而高親和力的抗體能夠在不同的條件下保持與抗原的穩(wěn)定結(jié)合，確保檢測結(jié)果的準確性。此外，高親和力的抗體還可以提高檢測的靈敏度，能夠檢測到更低濃度的抗原，有助于腫瘤的早期診斷?？贵w亞型雖然不直接影響檢測的靈敏度和特異性，但在檢測方法的選擇和結(jié)果分析中需要考慮。本研究中3株單克隆抗體均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。IgG1亞型的抗體在體內(nèi)具有較長的半衰期和良好的穩(wěn)定性，適合用于血清學(xué)檢測。在選擇檢測方法時，需要根據(jù)抗體亞型選擇合適的酶標(biāo)二抗，以確保檢測的準確性。不同亞型的抗體可能對某些檢測方法的適應(yīng)性不同，例如，某些檢測方法可能對IgG1亞型的抗體具有更好的檢測效果，而對其他亞型的抗體效果較差。因此，了解抗體亞型有助于優(yōu)化檢測方法，提高檢測效率和準確性。本研究制備的hAPE1單克隆抗體具有高效價、高特異性、高親和力且均為IgG1亞型的生物學(xué)特性，這些特性使其在腫瘤血清學(xué)檢測中具有良好的應(yīng)用潛力，為腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測提供了有力的工具。五、人APE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用5.1材料與方法5.1.1實驗材料血清樣本：收集[X]例腫瘤患者的血清樣本，其中包括肺癌患者[X]例、乳腺癌患者[X]例、結(jié)直腸癌患者[X]例等，患者均經(jīng)病理確診，且在采集血清樣本前未接受過放化療等抗腫瘤治療。同時，收集[X]例年齡、性別匹配的健康人群的血清樣本作為對照。所有血清樣本采集后，3000rpm離心15min，分離血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測試劑盒：自行制備的hAPE1雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其中包被抗體和檢測抗體均為前期制備的hAPE1單克隆抗體；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液；終止液（2MH?SO?）；ELISA板（96孔），購自Corning公司。實驗儀器：酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanGO），用于測定ELISA板各孔的吸光值；洗板機（BioTekELx50），用于洗滌ELISA板；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeratherm），用于ELISA反應(yīng)的孵育；離心機（Eppendorf5810R），用于血清樣本的離心處理；移液器（EppendorfResearchplus），用于試劑的準確移取。5.1.2實驗方法雙抗夾心ELISA法檢測血清中hAPE1蛋白：采用雙抗夾心ELISA法檢測血清中hAPE1蛋白水平。具體操作步驟如下：將包被抗體（hAPE1單克隆抗體）用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度（如1μg/mL），每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min。將血清樣本用樣本稀釋液（含1%BSA的PBS）進行適當(dāng)稀釋（如1:100），每孔加入100μL稀釋后的血清樣本，同時設(shè)置陰性對照（樣本稀釋液）和陽性對照（已知高濃度hAPE1蛋白溶液），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，每次5min。加入100μL檢測抗體（HRP標(biāo)記的hAPE1單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋至合適濃度），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液（2MH?SO?）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD???）。質(zhì)量控制措施：為確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性，采取以下質(zhì)量控制措施：每次實驗均設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，陰性對照應(yīng)無明顯顯色，陽性對照應(yīng)呈現(xiàn)較強的顯色，空白對照（僅加顯色液和終止液）吸光值應(yīng)接近零，以驗證實驗體系的有效性。在ELISA板的不同位置設(shè)置復(fù)孔，對同一樣本進行重復(fù)檢測，計算復(fù)孔間的變異系數(shù)（CV），要求CV值小于10%，以保證實驗的重復(fù)性。定期對酶標(biāo)儀、洗板機等儀器設(shè)備進行校準和維護，確保儀器的正常運行和檢測結(jié)果的準確性。嚴格按照試劑盒說明書和實驗操作規(guī)程進行操作，減少人為誤差。在實驗過程中，對血清樣本的采集、保存、處理等環(huán)節(jié)進行嚴格監(jiān)控，避免樣本污染和降解。5.2結(jié)果血清中hAPE1蛋白表達水平：采用雙抗夾心ELISA法對[X]例腫瘤患者和[X]例健康人群的血清樣本進行檢測，測定各孔在450nm波長處的吸光值（OD???），并根據(jù)標(biāo)準曲線計算出血清中hAPE1蛋白的含量。結(jié)果顯示，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的表達水平顯著高于健康人群（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下：健康人群血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，肺癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，乳腺癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，結(jié)直腸癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL等（表5-1）。[此處插入表5-1：腫瘤患者和健康人群血清中hAPE1蛋白表達水平（ng/mL，x±s）][此處插入表5-1：腫瘤患者和健康人群血清中hAPE1蛋白表達水平（ng/mL，x±s）]不同腫瘤類型患者血清hAPE1蛋白表達差異：進一步分析不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達存在差異。其中，肺癌患者血清中hAPE1蛋白表達水平最高，其次為乳腺癌患者和結(jié)直腸癌患者等（圖5-1）。通過方差分析和多重比較，結(jié)果顯示肺癌患者與乳腺癌患者、結(jié)直腸癌患者之間血清hAPE1蛋白表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；乳腺癌患者與結(jié)直腸癌患者之間血清hAPE1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。[此處插入圖5-1：不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達水平比較][此處插入圖5-1：不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達水平比較]血清hAPE1蛋白表達與腫瘤分期的關(guān)系：根據(jù)腫瘤的TNM分期標(biāo)準，將腫瘤患者分為早期（I-II期）和晚期（III-IV期）兩組，比較兩組患者血清中hAPE1蛋白的表達水平。結(jié)果表明，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的表達水平顯著高于早期腫瘤患者（P<0.01）。早期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL（圖5-2）。[此處插入圖5-2：不同分期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達水平比較][此處插入圖5-2：不同分期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達水平比較]5.3討論本研究利用制備的hAPE1單克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA法，對腫瘤患者和健康人群的血清樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達水平顯著高于健康人群，且不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達存在差異，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達水平高于早期腫瘤患者，表明hAPE1蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤診斷和病情評估的潛在標(biāo)志物。在腫瘤的診斷中，血清腫瘤標(biāo)志物的檢測具有重要意義。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有高靈敏度和高特異性，能夠準確地檢測出腫瘤的存在，并與良性疾病相鑒別。本研究中，hAPE1單克隆抗體對腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的檢測具有較高的靈敏度，能夠檢測到低水平的hAPE1蛋白表達。同時，通過與健康人群血清樣本的對比，發(fā)現(xiàn)該抗體具有較好的特異性，能夠有效地將腫瘤患者與健康人群區(qū)分開來。然而，單獨使用hAPE1蛋白作為腫瘤標(biāo)志物，其診斷準確性仍有待提高。有研究表明，單一腫瘤標(biāo)志物在腫瘤診斷中的靈敏度和特異性往往有限，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。因此，將hAPE1與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可能會提高腫瘤診斷的準確性。與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測是提高腫瘤診斷準確性的有效方法之一。不同的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮不同的作用，其表達水平在腫瘤患者血清中也存在差異。通過聯(lián)合檢測多種腫瘤標(biāo)志物，可以從多個角度反映腫瘤的生物學(xué)特性，提高診斷的靈敏度和特異性。例如，在肺癌的診斷中，將hAPE1與癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可能會提高肺癌的早期診斷率。CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有表達；CYFRA21-1是細胞角蛋白19的可溶性片段，在肺癌尤其是非小細胞肺癌中具有較高的敏感性。將hAPE1與這些腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可以彌補單一標(biāo)志物的不足，提高診斷的準確性。在乳腺癌的診斷中，聯(lián)合檢測hAPE1與糖類抗原15-3（CA15-3）、癌抗原125（CA125）等標(biāo)志物，也可能會為乳腺癌的診斷和病情評估提供更有價值的信息。CA15-3是乳腺癌的重要標(biāo)志物之一，對乳腺癌的診斷和病情監(jiān)測具有重要意義；CA125在乳腺癌患者中也可能出現(xiàn)升高，與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過聯(lián)合檢測這些標(biāo)志物，可以更全面地了解乳腺癌的病情，為治療方案的選擇提供依據(jù)。hAPE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測中具有一定的診斷價值，可作為腫瘤診斷和病情評估的潛在標(biāo)志物。將hAPE1與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，有望提高腫瘤診斷的準確性，為腫瘤的早期診斷和治療提供更有