演講人：日期:細胞實驗檢測方法CATALOGUE目錄01細胞培養(yǎng)基礎02細胞活性檢測03細胞增殖檢測04細胞凋亡分析05細胞遷移與侵襲檢測06分子水平檢測01細胞培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基選擇與制備基礎培養(yǎng)基類型根據細胞類型選擇合適的基礎培養(yǎng)基，如DMEM適用于貼壁細胞培養(yǎng)，RPMI-1640適用于懸浮細胞培養(yǎng)，需考慮營養(yǎng)成分和滲透壓的匹配性。01血清添加比例胎牛血清（FBS）是常用補充物，添加比例通常為10%-20%，需通過預實驗驗證血清批次對細胞生長的影響，避免細胞毒性或生長抑制。抗生素與添加劑常規(guī)添加青霉素-鏈霉素雙抗（100U/mL）防止污染，特殊細胞需補充L-谷氨酰胺、非必需氨基酸或生長因子（如EGF、bFGF）以維持細胞功能。pH與緩沖系統(tǒng)采用HEPES或碳酸氫鈉緩沖體系維持pH7.2-7.4，CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下需確保碳酸氫鈉濃度與CO2分壓（通常5%）匹配。020304細胞傳代技術消化酶選擇與濃度貼壁細胞傳代需使用胰蛋白酶（0.05%-0.25%）或膠原酶，消化時間控制在室溫下2-5分鐘，通過顯微鏡觀察細胞回縮變圓后立即終止反應。細胞計數與接種密度采用血球計數板或自動計數儀測定活細胞數，常規(guī)接種密度為1×10^4至5×10^4cells/cm2，原代細胞需適當提高密度促進貼壁。傳代比例優(yōu)化快速增殖細胞（如HEK293）可按1:3至1:6傳代，原代細胞或生長緩慢細胞（如神經元）建議1:1至1:2傳代，避免過度稀釋導致生長停滯。凍存與復蘇要點傳代后多余細胞用含10%DMSO的凍存液梯度降溫保存，復蘇時采用37℃水浴快速融化，離心去除凍存液后重懸于新鮮培養(yǎng)基。無菌操作規(guī)范金屬器械需高壓蒸汽滅菌（121℃,15psi,20分鐘），塑料耗材選用γ射線輻照滅菌，液體試劑通過0.22μm濾膜過濾除菌。器材滅菌管理

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操作者需穿戴無菌手套、口罩及實驗服，接觸細胞前用乙醇消毒手套，不同細胞系操作間更換手套并消毒工作臺面。人員防護措施使用前紫外線消毒30分鐘，工作區(qū)表面用75%乙醇擦拭，操作時保持前窗在安全高度（通常18-20cm），避免快速移動造成氣流紊亂。生物安全柜操作定期顯微鏡檢查培養(yǎng)液渾濁度、pH異常變化及細胞形態(tài)變異，采用革蘭氏染色或PCR檢測支原體污染，污染樣本需立即隔離并滅菌處理。細胞污染監(jiān)測02細胞活性檢測MTT/CCK-8法檢測原理通過線粒體脫氫酶還原MTT或CCK-8試劑生成水溶性甲瓚，其吸光度值與活細胞數量成正比，適用于高通量篩選和藥物毒性評估。操作流程細胞接種于96孔板，加入MTT/CCK-8孵育后，用酶標儀測定450-490nm吸光度值，需注意避光孵育以避免背景干擾。應用場景廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖抑制率計算及細胞代謝活性分析，但需排除酚紅培養(yǎng)基對結果的干擾。局限性無法區(qū)分凋亡與壞死細胞，且檢測時間過長可能導致甲瓚結晶沉淀影響準確性。乳酸脫氫酶釋放試驗需設置最大LDH釋放對照組（裂解細胞）和背景對照組，計算細胞毒性百分比時需扣除自發(fā)釋放值。關鍵步驟優(yōu)勢干擾因素細胞膜損傷后釋放乳酸脫氫酶（LDH）至培養(yǎng)液，催化底物生成紅色甲瓚，通過吸光度值量化細胞毒性程度。適用于懸浮細胞和貼壁細胞，能快速反映細胞膜完整性破壞，常用于免疫治療和納米材料安全性評估。血清中含LDH可能干擾結果，建議采用無血清培養(yǎng)基或離心去除血清后再檢測。檢測原理臺盼藍染色排除法基本原理適用領域操作要點注意事項活細胞膜完整拒染臺盼藍，死細胞膜通透性增加被染成藍色，通過顯微鏡或細胞計數儀統(tǒng)計活細胞比例。染色時間需控制在3分鐘內，避免假陽性；細胞懸液濃度應調整至200-500個/視野以保證計數準確性。原代細胞培養(yǎng)質量監(jiān)控、細胞凍存復蘇后存活率評估及流式細胞術前樣本篩選。無法檢測早期凋亡細胞，且高濃度臺盼藍可能抑制某些細胞活性，建議染色終濃度不超過0.4%。03細胞增殖檢測BrdU標記法原理與應用BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶類似物，可整合到增殖細胞的DNA中，通過特異性抗體檢測標記細胞，適用于體外和體內細胞增殖研究。實驗步驟需先孵育細胞與BrdU，固定后通過酸或酶處理暴露DNA，再使用抗BrdU抗體和熒光/酶標二抗進行可視化分析。優(yōu)勢與局限靈敏度高且兼容多種樣本，但需DNA變性處理，可能影響細胞形態(tài)完整性。CFSE染色法熒光標記機制CFSE（羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯）通過酯酶活性水解后與胞內蛋白共價結合，隨細胞分裂熒光信號均分，可追蹤多代增殖。數據分析流式細胞術檢測熒光強度衰減，通過峰群分布計算增殖指數和分裂代數，適用于免疫細胞功能研究。注意事項需優(yōu)化染色濃度以避免毒性，長時間培養(yǎng)可能導致熒光淬滅。EdU檢測法點擊化學反應EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）含乙炔基團，可與熒光標記的疊氮化合物通過點擊化學高效偶聯，無需DNA變性，保留細胞結構。01高通量兼容性適用于微孔板檢測和自動化成像系統(tǒng)，比BrdU法操作更簡便，尤其適合大規(guī)模藥物篩選實驗。02多色標記擴展可與其他熒光探針聯用，實現增殖與細胞周期、凋亡等多參數同步分析。0304細胞凋亡分析利用AnnexinV與凋亡細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合，同時結合碘化丙啶（PI）區(qū)分早期凋亡（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（AnnexinV+/PI+）。檢測原理適用于懸浮細胞和貼壁細胞，可定量分析藥物誘導或基因調控下的凋亡水平，廣泛用于腫瘤治療研究。應用范圍細胞懸液經離心后重懸于緩沖液，加入AnnexinV-FITC和PI避光孵育，流式細胞儀檢測熒光信號并分析凋亡比例。實驗步驟010302AnnexinV/PI雙染法需嚴格控制孵育時間（避免過度染色）和細胞處理條件（避免機械損傷導致假陽性）。注意事項04Caspase活性檢測檢測原理通過熒光底物（如DEVD-pNA）被Caspase家族蛋白酶切割后釋放顯色或熒光信號，反映Caspase-3/7等關鍵凋亡執(zhí)行酶的活性。實驗方法裂解細胞后加入底物孵育，分光光度計或熒光酶標儀測定吸光度/熒光值，活性單位以標準曲線換算。優(yōu)勢與局限靈敏度高且可動態(tài)監(jiān)測酶活變化，但需注意樣本處理速度（Caspase活性易降解）和底物特異性（避免其他蛋白酶干擾）。擴展應用結合抑制劑或激活劑可研究凋亡通路調控機制，如線粒體途徑與死亡受體途徑的交叉作用。DNA片段化分析經典方法瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細胞DNA斷裂形成的“梯狀條帶”（180-200bp倍數片段），需提取基因組DNA后電泳并EB染色觀察。01高通量替代TUNEL法（末端脫氧核苷酸轉移酶標記）通過熒光標記斷裂DNA，流式或熒光顯微鏡定量凋亡細胞比例。技術要點樣本固定需避免過度交聯（影響DNA提?。琓UNEL實驗需設置陽性和陰性對照以排除假信號。研究意義直接證明凋亡特征性DNA損傷，適用于體內外模型評估組織或細胞群的凋亡程度。02030405細胞遷移與侵襲檢測劃痕愈合試驗原理與應用通過物理劃痕模擬細胞遷移過程，觀察劃痕區(qū)域細胞隨時間推移的遷移覆蓋能力，常用于評估細胞集體遷移能力、藥物對遷移的抑制效果或生長因子對遷移的促進作用。局限性僅適用于貼壁細胞，無法模擬三維微環(huán)境；劃痕邊緣細胞可能因機械損傷影響遷移行為，需設置重復實驗以減少誤差。操作要點需使用無菌槍頭或劃痕器在單層細胞上制造均一劃痕，定期顯微鏡拍照記錄，通過圖像分析軟件（如ImageJ）量化劃痕閉合率。注意控制細胞密度和培養(yǎng)條件的一致性。Transwell遷移試驗核心機制利用帶有微孔濾膜的Transwell小室，將細胞接種于上室，下室添加趨化因子（如血清或特定細胞因子），通過計數穿過微孔到達下室的細胞數評估遷移能力。濾膜孔徑通常為8-12μm（遷移）或5-8μm（侵襲）。關鍵步驟優(yōu)勢與擴展細胞需饑餓處理以降低基礎遷移率；遷移結束后用棉簽擦除上室未遷移細胞，下室細胞需固定（如甲醇）和染色（如結晶紫）后顯微鏡計數。侵襲試驗需預先在膜上鋪Matrigel模擬基底膜屏障?？蓞^(qū)分趨化性遷移與隨機運動，結合熒光標記或流式細胞術可提高檢測靈敏度；適用于高通量藥物篩選或基因功能研究。123基質侵襲試驗三維環(huán)境模擬在Transwell小室濾膜上覆蓋層粘連蛋白或膠原基質（如Matrigel），模擬體內細胞穿越基底膜侵襲的過程，常用于腫瘤細胞侵襲能力評估或抗轉移藥物開發(fā)。實驗優(yōu)化基質濃度和固化時間需標準化，避免批次差異；可聯合熒光標記細胞或基質降解酶（如MMP）活性檢測，多維度分析侵襲機制。數據解讀侵襲率需與遷移試驗對照，排除單純遷移的影響；需考慮基質成分（如纖維連接蛋白、透明質酸）對細胞行為的特異性調控作用。06分子水平檢測PCR技術應用通過實時定量PCR（qPCR）檢測特定基因的mRNA表達水平，用于研究細胞分化、疾病機制或藥物作用靶點，具有高靈敏度和特異性?；虮磉_分析利用多重PCR技術同時篩查多種病毒或細菌核酸，適用于臨床診斷和流行病學調查，如新冠病毒、HPV分型檢測等。病原體檢測通過PCR擴增靶向區(qū)域并結合測序，驗證CRISPR-Cas9等基因編輯工具的敲除或插入效率，確保實驗準確性?；蚓庉嬺炞C采用甲基化特異性PCR（MSP）或亞硫酸鹽測序PCR（BSP），研究表觀遺傳修飾與癌癥、衰老等過程的關聯。甲基化分析Westernblot分析蛋白定量與定性通過SDS分離蛋白，利用抗體檢測目標蛋白的表達量及分子量，廣泛應用于信號通路研究（如MAPK、PI3K/AKT通路）。翻譯后修飾檢測使用磷酸化、泛素化等特異性抗體，分析蛋白的磷酸化、乙酰化等修飾狀態(tài)，揭示細胞調控機制。疾病標志物篩查在腫瘤研究中，檢測HER2、p53等標志蛋白的表達水平，輔助臨床診斷和治療方案制定。實驗條件優(yōu)化需注意抗體特異性驗證、封閉劑選擇（如BSA或脫脂奶粉）及曝光時間控制，以減少假陽性或背景噪聲。免疫熒光染色通過共聚焦顯微鏡觀察目標蛋白在細胞核、線粒體等細胞