半乳凝素-1敲低：重塑乳腺癌藥物敏感性的分子機(jī)制與治療新徑一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康與生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超越肺癌成為全球第一大癌，死亡病例約68.5萬例。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。其不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)與心理負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等。手術(shù)切除是早期乳腺癌的主要治療方式，但對于中晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，化療、放療等輔助治療手段至關(guān)重要。然而，這些傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性?；熕幬镌跉┘?xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，甚至部分患者因無法耐受而中斷治療。此外，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性也是影響治療效果的關(guān)鍵因素之一。多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象使得乳腺癌細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥，導(dǎo)致化療失敗，患者預(yù)后不良。半乳凝素-1（Gal-1）作為半乳凝素家族中的重要成員，是一種能識別并結(jié)合β-半乳糖基糖綴合物的動物凝集素。它在細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長、分化、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和剪切以及細(xì)胞骨架組織化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明，Gal-1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)。在乳腺癌中，Gal-1的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Gal-1可通過多種途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)、激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Gal-1與乳腺癌的藥物耐藥性也存在緊密聯(lián)系。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，Gal-1在乳腺癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于親本細(xì)胞系，提示Gal-1可能參與了乳腺癌多藥耐藥的形成。深入探究Gal-1在乳腺癌藥物耐藥中的作用機(jī)制，對于克服乳腺癌多藥耐藥、提高化療效果具有重要意義。在眾多與Gal-1相關(guān)的信號通路中，RaF-1/AP-1信號通路備受關(guān)注。RaF-1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路上的關(guān)鍵激酶，可被多種細(xì)胞外刺激激活，進(jìn)而磷酸化下游底物，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。AP-1是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，由c-Jun、c-Fos等蛋白組成，是MAPK通路的重要下游靶點(diǎn)。研究證實(shí)，Gal-1能夠通過活化RaF-1/AP-1信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。然而，Gal-1是否通過該信號通路影響乳腺癌的藥物敏感性，目前尚不完全清楚。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討敲低半乳凝素-1對乳腺癌藥物敏感性的影響，并揭示其潛在的分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。具體研究目的如下：明確Gal-1表達(dá)與乳腺癌藥物耐藥的關(guān)系：通過檢測不同乳腺癌細(xì)胞系及腫瘤組織中Gal-1的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌多藥耐藥的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。探究敲低Gal-1對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響：運(yùn)用RNA干擾技術(shù)敲低乳腺癌細(xì)胞中Gal-1的表達(dá)，觀察其對化療藥物敏感性的變化，包括細(xì)胞增殖、凋亡等指標(biāo)，明確Gal-1在乳腺癌藥物耐藥中的作用。闡明敲低Gal-1影響乳腺癌藥物敏感性的分子機(jī)制：深入研究Gal-1敲低后，RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)分子的表達(dá)及活性變化，以及該信號通路對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的調(diào)控機(jī)制，揭示Gal-1與RaF-1/AP-1信號通路在乳腺癌藥物耐藥中的內(nèi)在聯(lián)系。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義：理論意義：深入揭示Gal-1在乳腺癌藥物耐藥中的作用機(jī)制，豐富了乳腺癌耐藥的分子生物學(xué)理論，為進(jìn)一步理解腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制提供了新的視角，有助于完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系。實(shí)際意義：為乳腺癌的臨床治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。通過敲低Gal-1提高乳腺癌的藥物敏感性，有望克服多藥耐藥現(xiàn)象，增強(qiáng)化療效果，減少化療藥物的劑量和不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。這對于改善乳腺癌患者的預(yù)后、降低乳腺癌的死亡率具有重要的臨床價值，也為開發(fā)新型抗癌藥物和治療方案提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。二、乳腺癌與半乳凝素-1、RaF-1/AP-1信號通路概述2.1乳腺癌的現(xiàn)狀2.1.1發(fā)病率與危害乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，躍居全球癌癥發(fā)病率首位，占女性惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的24.5%，死亡病例約68.5萬例，在女性癌癥死亡原因中位列第五。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，2016年中國女性乳腺癌新發(fā)病例約為30.4萬例，發(fā)病率為42.55/10萬，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢，較西方女性發(fā)病年齡提前約10歲。乳腺癌不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對其心理和生活質(zhì)量造成極大的負(fù)面影響。手術(shù)切除乳房會導(dǎo)致身體形象改變，給患者帶來心理創(chuàng)傷，使其產(chǎn)生自卑、焦慮、抑郁等負(fù)面情緒?；熀头暖煹牟涣挤磻?yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、疲勞等，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作能力，降低生活質(zhì)量。同時，乳腺癌的治療費(fèi)用高昂，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，中國乳腺癌患者的年均醫(yī)療費(fèi)用約為4.8萬元，且隨著治療方案的復(fù)雜程度和治療周期的延長，費(fèi)用還會進(jìn)一步增加。因此，乳腺癌的防治已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，以提高乳腺癌的治療效果和患者的生存質(zhì)量。2.1.2現(xiàn)有治療手段及其局限性目前，乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等，這些治療方法在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但仍存在諸多局限性。手術(shù)治療是早期乳腺癌的主要治療方式，包括保乳手術(shù)和全乳切除術(shù)，以及針對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)清掃術(shù)等。保乳手術(shù)可以保留乳房的外觀和部分功能，提高患者的生活質(zhì)量，但要求腫瘤較小、位置合適，且術(shù)后需要進(jìn)行放療以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。全乳切除術(shù)則適用于腫瘤較大、多中心病灶或有保乳禁忌證的患者，雖然能徹底切除腫瘤，但會對患者的身體和心理造成較大創(chuàng)傷。此外，手術(shù)治療無法完全清除體內(nèi)可能存在的微小轉(zhuǎn)移灶，術(shù)后仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。化學(xué)藥物治療（化療）是乳腺癌綜合治療的重要組成部分，通過使用細(xì)胞毒性藥物殺死癌細(xì)胞?；熤饕糜谳o助治療，可降低復(fù)發(fā)風(fēng)險，對于一些早期乳腺癌患者，化療也可提高治愈率。然而，化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板減少，增加感染和出血的風(fēng)險；胃腸道反應(yīng)引起惡心、嘔吐、食欲不振，影響患者的營養(yǎng)攝入和身體恢復(fù)；脫發(fā)使患者的外貌發(fā)生改變，加重心理負(fù)擔(dān)等。這些不良反應(yīng)不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致部分患者因無法耐受而中斷治療，影響治療效果。放射治療（放療）是利用放射線殺死癌細(xì)胞，主要用于術(shù)后輔助治療，有助于消除可能殘留的癌細(xì)胞，降低局部復(fù)發(fā)率。對于晚期患者，放療也可用于減輕疼痛、緩解癥狀。但放療同樣存在副作用，如放射性皮炎、放射性肺炎、心臟損傷等，長期放療還可能增加第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生風(fēng)險。此外，放療的效果受到腫瘤的位置、大小、分期以及患者個體差異等多種因素的影響，部分患者對放療不敏感，治療效果不佳。內(nèi)分泌治療適用于激素受體陽性的乳腺癌患者，通過阻斷激素對癌細(xì)胞的作用來抑制其生長和擴(kuò)散。常用的內(nèi)分泌治療藥物包括他莫昔芬、芳香化酶抑制劑等。內(nèi)分泌治療的優(yōu)點(diǎn)是副作用相對較小，患者耐受性較好，但治療周期長，一般需要持續(xù)5-10年。而且，部分患者在治療過程中會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗。耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，涉及激素受體的突變、信號通路的異常激活等多種因素。靶向治療是針對癌細(xì)胞特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，通過干擾癌細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移信號通路，達(dá)到抑制腫瘤的目的。例如，針對人表皮生長因子受體2（HER2）陽性的乳腺癌患者，使用曲妥珠單抗等靶向藥物，可顯著提高治療效果。靶向治療具有特異性強(qiáng)、副作用相對較小的優(yōu)點(diǎn)，但并非所有乳腺癌患者都適用，僅適用于特定靶點(diǎn)陽性的患者。此外，靶向藥物也可能出現(xiàn)耐藥問題，且價格昂貴，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2.2半乳凝素-1的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)半乳凝素-1（Gal-1）由位于第22號染色體長臂13區(qū)帶的LGALS1基因編碼。該基因轉(zhuǎn)錄本由6個外顯子剪接而成，長度約為1.2kb，編碼135個氨基酸。Gal-1以單體及非共價鍵形成的同源二聚體形式存在，包含一個約130個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠引起糖結(jié)合活性，被稱為糖識別域（CRD），其分子量約為14-15kDa。通過一線晶體照相術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Gal-1的折疊緊密，由兩個反向平行的β片層形成夾層結(jié)構(gòu)，這也是半乳凝素家族最典型的折疊方式。兩個單體通過表面高度保守的疏水區(qū)域相互作用形成二聚體，這種二聚體結(jié)構(gòu)對于Gal-1與糖配體的結(jié)合以及發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要。人類Gal-1在胞液中同樣以二聚體形式存在，二聚體的整合增強(qiáng)了其與靶分子的親和力和特異性。此外，Gal-1的氨基酸序列在不同物種間具有高度保守性，這暗示了其在進(jìn)化過程中具有重要且保守的生物學(xué)功能。2.2.2在正常生理過程中的作用在細(xì)胞黏附方面，Gal-1能夠與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的糖蛋白、糖脂等分子相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的黏附過程。研究表明，在胚胎發(fā)育過程中，Gal-1參與了細(xì)胞的遷移和組織器官的形成，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附來維持細(xì)胞的正常位置和組織結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Gal-1對神經(jīng)元的生長、分化和軸突導(dǎo)向也起著重要作用。它可以促進(jìn)神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，為神經(jīng)元的生長提供合適的微環(huán)境，有助于神經(jīng)回路的構(gòu)建和功能的維持。在免疫調(diào)節(jié)方面，Gal-1是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子。它可以通過與免疫細(xì)胞表面的糖蛋白受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能。在T細(xì)胞免疫中，Gal-1能夠誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡，從而限制過度的免疫反應(yīng)，維持免疫平衡。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)過程中，Gal-1可以抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放，減輕炎癥對組織的損傷。此外，Gal-1還可以調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的成熟和功能，影響抗原呈遞和T細(xì)胞的激活，進(jìn)而調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在細(xì)胞增殖和凋亡方面，Gal-1對細(xì)胞的生長和凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。在正常細(xì)胞中，Gal-1可以通過與細(xì)胞內(nèi)的信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，在某些情況下，Gal-1也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或處于應(yīng)激狀態(tài)時，Gal-1可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，以清除受損或異常的細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中，Gal-1的表達(dá)異常往往會導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡的失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2.3RaF-1/AP-1信號通路解析2.3.1信號通路的組成與激活機(jī)制RaF-1/AP-1信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路主要由RaF-1、MEK、ERK以及AP-1等關(guān)鍵蛋白組成。RaF-1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路上的關(guān)鍵激酶，屬于RAF激酶家族。在正常生理狀態(tài)下，RaF-1以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到多種細(xì)胞外刺激，如生長因子、細(xì)胞因子、激素以及環(huán)境應(yīng)激等信號時，RaF-1會被激活。以表皮生長因子（EGF）刺激為例，EGF與細(xì)胞表面的EGF受體（EGFR）結(jié)合，導(dǎo)致EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域活化，進(jìn)而使受體自身磷酸化。磷酸化的EGFR招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白Grb2，Grb2與SOS蛋白結(jié)合，形成Grb2-SOS復(fù)合物。SOS蛋白具有鳥苷酸交換因子（GEF）的活性，能夠促進(jìn)Ras蛋白上的GDP被GTP替換，從而激活Ras蛋白。激活的Ras蛋白與RaF-1的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致RaF-1的構(gòu)象發(fā)生改變，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并通過一系列的磷酸化修飾激活RaF-1。激活的RaF-1進(jìn)一步磷酸化并激活下游的MEK（絲裂原活化蛋白激酶激酶）。MEK是一種雙特異性激酶，能夠磷酸化ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶）的蘇氨酸和酪氨酸殘基，從而激活ERK。ERK被激活后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1等，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。AP-1是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，由c-Jun、c-Fos等蛋白組成。c-Jun和c-Fos可以通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)形成同源二聚體或異源二聚體。當(dāng)ERK進(jìn)入細(xì)胞核后，它可以磷酸化c-Jun的Ser63和Ser73位點(diǎn)，增強(qiáng)c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性。同時，ERK還可以通過激活其他激酶，如MSK1等，間接促進(jìn)c-Fos的表達(dá)。磷酸化的c-Jun和新合成的c-Fos形成AP-1復(fù)合物，與靶基因啟動子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的各種生理功能。2.3.2在細(xì)胞生理活動中的功能在細(xì)胞增殖方面，RaF-1/AP-1信號通路對細(xì)胞周期的調(diào)控起著重要作用。研究表明，該通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加快細(xì)胞的增殖速度。具體來說，激活的ERK可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F能夠促進(jìn)與DNA復(fù)制相關(guān)的基因表達(dá)，如周期蛋白E（CyclinE）等，從而推動細(xì)胞進(jìn)入S期。此外，AP-1可以調(diào)節(jié)CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，RaF-1/AP-1信號通路的異常激活往往導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的生長。在細(xì)胞分化過程中，該信號通路也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，RaF-1/AP-1信號通路的激活可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，通過激活該信號通路，可以上調(diào)神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)，如NeuroD等，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。在胚胎發(fā)育過程中，RaF-1/AP-1信號通路參與了多種組織和器官的形成，對細(xì)胞的分化和命運(yùn)決定起著重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞遷移方面，RaF-1/AP-1信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的遷移能力。激活的ERK可以磷酸化多種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動蛋白結(jié)合蛋白等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。此外，AP-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如整合素等，改變細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附力，進(jìn)一步影響細(xì)胞的遷移。在腫瘤細(xì)胞中，RaF-1/AP-1信號通路的激活往往導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞凋亡方面，RaF-1/AP-1信號通路的激活既可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可以抑制細(xì)胞凋亡，具體取決于細(xì)胞類型和刺激因素。在某些情況下，激活的ERK可以磷酸化并激活促凋亡蛋白Bim等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，在另一些情況下，該信號通路的激活可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，RaF-1/AP-1信號通路的異常激活可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，從而影響治療效果。2.4三者在乳腺癌中的研究進(jìn)展2.4.1半乳凝素-1在乳腺癌中的異常表達(dá)及影響半乳凝素-1（Gal-1）在乳腺癌中的表達(dá)情況備受關(guān)注，大量研究表明其在乳腺癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)異常高表達(dá)。Moon等學(xué)者通過對79例乳腺癌患者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)Gal-1在癌細(xì)胞和癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。在浸潤性癌患者、晚期T期患者以及晚期TNM期患者中，癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞中Gal-1的表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果表明，Gal-1的高表達(dá)與乳腺癌的腫瘤侵襲性和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。另有研究運(yùn)用real-timePCR和westernblot技術(shù)，檢測人乳腺上皮細(xì)胞系（MCF-10A）和乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）以及其對應(yīng)的耐藥株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中Gal-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。此外，與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的親本株相比，其耐藥株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1的表達(dá)水平進(jìn)一步增加。這提示Gal-1的表達(dá)上調(diào)不僅與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)，還與乳腺癌的耐藥性密切相關(guān)。Gal-1的高表達(dá)對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生了多方面的影響。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，Gal-1可以通過與細(xì)胞表面的糖蛋白受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，從而推動乳腺癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，Gal-1能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程加快，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面，Gal-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Gal-1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中肌動蛋白的聚合，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力。同時，Gal-1還可以下調(diào)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，降低細(xì)胞間的黏附力，使乳腺癌細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，發(fā)生遷移和侵襲。在腫瘤血管生成方面，Gal-1可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤血管的生成。研究表明，Gal-1能夠與VEGF相互作用，增強(qiáng)VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣。此外，Gal-1還與乳腺癌的免疫逃逸密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以通過分泌Gal-1來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Gal-1能夠誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡，使T細(xì)胞的免疫活性降低。Gal-1還可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的擴(kuò)增，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，從而幫助乳腺癌細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。2.4.2RaF-1/AP-1信號通路在乳腺癌中的作用RaF-1/AP-1信號通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其激活對乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性產(chǎn)生了重要影響。在乳腺癌細(xì)胞增殖方面，研究表明，RaF-1/AP-1信號通路的激活能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。激活的RaF-1通過磷酸化MEK，進(jìn)而激活ERK，ERK進(jìn)入細(xì)胞核后，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子E2F和AP-1等，促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。c-Myc是一種原癌基因，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程，其表達(dá)增加可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中，通過激活RaF-1/AP-1信號通路，能夠顯著提高CyclinD1和c-Myc的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；而抑制該信號通路，則可降低CyclinD1和c-Myc的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，RaF-1/AP-1信號通路的激活能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。激活的ERK可以磷酸化多種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和細(xì)胞黏附分子，如肌動蛋白結(jié)合蛋白、整合素等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附力的改變，從而使乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。AP-1可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，激活RaF-1/AP-1信號通路可上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力；抑制該信號通路，則可降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減弱細(xì)胞的侵襲能力。在乳腺癌細(xì)胞耐藥性方面，RaF-1/AP-1信號通路的激活與乳腺癌的多藥耐藥現(xiàn)象密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路的激活可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）等藥物外排泵的表達(dá)，使化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度降低，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。P-gp是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。通過抑制RaF-1/AP-1信號通路，可以降低P-gp的表達(dá)，提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。此外，該信號通路的激活還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。三、半乳凝素-1敲低對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動物選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231作為研究對象。MCF-7細(xì)胞系為雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞，不具有轉(zhuǎn)移能力；MDA-MB-231細(xì)胞系則是一種三陰性乳腺癌細(xì)胞系，具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力。這兩種細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液1次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物選用BALB/c雌性裸鼠，6-8周齡，體重18-22g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。動物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，給予無菌飼料和自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動物管理條例》和《動物福利倫理審查指南》，并獲得本單位動物倫理委員會的批準(zhǔn)。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：RNA提取試劑盒（購自Qiagen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自TaKaRa公司）、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（購自Roche公司）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（購自Invitrogen公司）、半乳凝素-1干擾質(zhì)粒（siRNA-Gal-1）及陰性對照質(zhì)粒（siRNA-NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成、阿霉素（Doxorubicin，DOX）、紫杉醇（Paclitaxel，PTX）、順鉑（Cisplatin，DDP）等化療藥物（購自Sigma公司）、CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（購自日本同仁化學(xué)研究所）、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自BDBiosciences公司）、蛋白提取試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司）、Westernblot相關(guān)抗體（包括抗Gal-1抗體、抗RaF-1抗體、抗AP-1抗體、抗β-actin抗體等，購自CellSignalingTechnology公司）等。主要儀器有：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BDBiosciences公司）、實(shí)時熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480，Roche公司）、蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司）等。這些儀器在實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行各項檢測和分析。3.1.3半乳凝素-1敲低模型的構(gòu)建利用RNAi技術(shù)構(gòu)建半乳凝素-1敲低模型。首先，根據(jù)人半乳凝素-1基因序列（GenBank登錄號：NM_002306），設(shè)計并合成針對半乳凝素-1的干擾序列（siRNA-Gal-1）以及陰性對照序列（siRNA-NC）。將干擾序列和陰性對照序列分別克隆到pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將干擾質(zhì)粒（siRNA-Gal-1）和陰性對照質(zhì)粒（siRNA-NC）分別與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5min，然后將混合液逐滴加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后更換為正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，利用實(shí)時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測半乳凝素-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證敲低效果。3.1.4藥物敏感性檢測方法采用MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性。以CCK-8法為例，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：將轉(zhuǎn)染后的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個細(xì)胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度梯度的化療藥物（如阿霉素、紫杉醇、順鉑等），每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞）和陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒并加入相同濃度的化療藥物）。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，繼續(xù)孵育1-4h。然后用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）]×100%。通過細(xì)胞存活率來評估細(xì)胞對化療藥物的敏感性，細(xì)胞存活率越低，表明細(xì)胞對化療藥物越敏感。此外，還采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，進(jìn)一步評估細(xì)胞對化療藥物的敏感性。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后加入化療藥物，作用48h。收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書操作，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。凋亡率越高，說明細(xì)胞對化療藥物的敏感性越高。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1半乳凝素-1敲低效果驗(yàn)證利用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染半乳凝素-1干擾質(zhì)粒（siRNA-Gal-1）后，Gal-1的蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒（siRNA-NC）組顯著降低（圖1A）。以β-actin作為內(nèi)參，通過灰度值分析計算Gal-1蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，siRNA-Gal-1組Gal-1蛋白表達(dá)量分別為siRNA-NC組的0.35±0.05（MCF-7細(xì)胞）和0.32±0.04（MDA-MB-231細(xì)胞），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA-Gal-1組Gal-1的mRNA表達(dá)水平也明顯低于siRNA-NC組（圖1B）。以GAPDH作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算Gal-1mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，siRNA-Gal-1組Gal-1mRNA表達(dá)量分別為siRNA-NC組的0.30±0.06（MCF-7細(xì)胞）和0.28±0.05（MDA-MB-231細(xì)胞），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，成功構(gòu)建了半乳凝素-1敲低的乳腺癌細(xì)胞模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。<插入圖1：半乳凝素-1敲低效果驗(yàn)證。A：Westernblot檢測Gal-1蛋白表達(dá)；B：qRT-PCR檢測Gal-1mRNA表達(dá)。*P<0.01vssiRNA-NC組>3.2.2敲低半乳凝素-1對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響采用CCK-8法檢測敲低半乳凝素-1后乳腺癌細(xì)胞對不同化療藥物的敏感性變化。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒（siRNA-NC）的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染半乳凝素-1干擾質(zhì)粒（siRNA-Gal-1）的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞對阿霉素（DOX）、紫杉醇（PTX）和順鉑（DDP）的敏感性顯著提高。通過計算細(xì)胞存活率，得出不同化療藥物對兩組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值，具體結(jié)果如表1所示。在MCF-7細(xì)胞中，siRNA-NC組對DOX的IC50值為（2.56±0.23）μmol/L，而siRNA-Gal-1組對DOX的IC50值降低至（1.25±0.15）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對于PTX，siRNA-NC組的IC50值為（1.89±0.18）μmol/L，siRNA-Gal-1組降低至（0.92±0.12）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在對DDP的敏感性方面，siRNA-NC組的IC50值為（3.24±0.28）μmol/L，siRNA-Gal-1組降低至（1.56±0.18）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，也觀察到類似的結(jié)果。siRNA-NC組對DOX的IC50值為（3.12±0.25）μmol/L，siRNA-Gal-1組降低至（1.58±0.16）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對于PTX，siRNA-NC組的IC50值為（2.25±0.20）μmol/L，siRNA-Gal-1組降低至（1.05±0.13）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在對DDP的敏感性方面，siRNA-NC組的IC50值為（3.85±0.30）μmol/L，siRNA-Gal-1組降低至（1.90±0.20）μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，敲低半乳凝素-1能夠顯著提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，降低細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。<插入表1：敲低半乳凝素-1對乳腺癌細(xì)胞化療藥物IC50值的影響（μmol/L，x±s，n=6）>細(xì)胞系組別DOXPTXDDPMCF-7siRNA-NC2.56±0.231.89±0.183.24±0.28siRNA-Gal-11.25±0.15**0.92±0.12**1.56±0.18**MDA-MB-231siRNA-NC3.12±0.252.25±0.203.85±0.30siRNA-Gal-11.58±0.16**1.05±0.13**1.90±0.20**注：**P<0.01vssiRNA-NC組3.2.3細(xì)胞凋亡與周期變化通過流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低半乳凝素-1對乳腺癌細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的影響。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果如圖2A所示，在MCF-7細(xì)胞中，siRNA-NC組的細(xì)胞凋亡率為（5.68±0.52）%，而siRNA-Gal-1組的細(xì)胞凋亡率顯著升高至（18.56±1.25）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-NC組的細(xì)胞凋亡率為（6.25±0.58）%，siRNA-Gal-1組升高至（20.12±1.30）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。細(xì)胞周期檢測結(jié)果如圖2B所示，在MCF-7細(xì)胞中，與siRNA-NC組相比，siRNA-Gal-1組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，從（45.68±2.30）%增加至（62.35±3.10）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；S期細(xì)胞比例顯著降低，從（35.62±1.80）%降低至（20.15±1.50）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；G2/M期細(xì)胞比例也有所降低，從（18.70±1.20）%降低至（17.50±1.00）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-Gal-1組G0/G1期細(xì)胞比例從（43.56±2.10）%增加至（60.20±3.00）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；S期細(xì)胞比例從（38.20±2.00）%降低至（22.30±1.60）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；G2/M期細(xì)胞比例從（18.24±1.10）%降低至（17.50±0.90）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，敲低半乳凝素-1能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，同時使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。<插入圖2：敲低半乳凝素-1對乳腺癌細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響。A：細(xì)胞凋亡率；B：細(xì)胞周期分布。*P<0.05，**P<0.01vssiRNA-NC組>四、半乳凝素-1敲低抑制RaF-1/AP-1信號通路的機(jī)制研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計與方法4.1.1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測利用Westernblot技術(shù)檢測RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1和siRNA-NC的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，然后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。裂解結(jié)束后，12000g、4℃離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液按比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制合適濃度的分離膠和濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA恒流，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與一抗（抗RaF-1抗體、抗p-RaF-1抗體、抗AP-1抗體、抗c-Jun抗體、抗p-c-Jun抗體、抗c-Fos抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將膜與相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，稀釋比例為1:5000-1:10000）室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。此外，還運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測腫瘤組織中信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。取裸鼠皮下移植瘤組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理，采用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。隨后，用5%BSA封閉1h，加入一抗（與Westernblot所用一抗相同），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再用PBS洗滌3次，每次5min。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)情況。4.1.2信號通路活性檢測采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測RaF-1/AP-1信號通路的活性。構(gòu)建含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-AP-1-Luc），將其與內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK，表達(dá)海腎熒光素酶）共轉(zhuǎn)染至MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中。同時設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒（pGL3-Basic）和內(nèi)參質(zhì)粒的對照組。轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5min，然后將混合液逐滴加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后更換為正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入100μL被動裂解緩沖液（PLB），室溫裂解細(xì)胞15min。將裂解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，依次加入螢火蟲熒光素酶底物（LARII）和海腎熒光素酶底物（Stop&Glo），用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性，分別測定螢火蟲熒光素酶活性（反映AP-1的轉(zhuǎn)錄活性）和海腎熒光素酶活性（作為內(nèi)參，校正轉(zhuǎn)染效率）。計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以該比值表示AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性，從而反映RaF-1/AP-1信號通路的活性。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.2.1半乳凝素-1敲低對RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響利用Westernblot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1和siRNA-NC的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，與siRNA-NC組相比，siRNA-Gal-1組中RaF-1的磷酸化水平（p-RaF-1）顯著降低（圖3A）。以β-actin作為內(nèi)參，通過灰度值分析計算p-RaF-1/RaF-1的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，siRNA-Gal-1組p-RaF-1/RaF-1的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.45±0.06，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，AP-1復(fù)合物的關(guān)鍵組成蛋白c-Jun和c-Fos的表達(dá)水平也顯著降低，p-c-Jun（Ser73）的磷酸化水平同樣顯著下降（圖3A）。通過灰度值分析計算p-c-Jun（Ser73）/c-Jun和c-Fos的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，siRNA-Gal-1組p-c-Jun（Ser73）/c-Jun的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.38±0.05，c-Fos的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.42±0.06，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，也觀察到類似的結(jié)果。siRNA-Gal-1組中p-RaF-1/RaF-1的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.40±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。p-c-Jun（Ser73）/c-Jun的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.35±0.04，c-Fos的相對表達(dá)量為siRNA-NC組的0.39±0.05，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。免疫組化結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。在裸鼠皮下移植瘤組織中，與siRNA-NC組相比，siRNA-Gal-1組中p-RaF-1、p-c-Jun和c-Fos的陽性表達(dá)率明顯降低（圖3B）。通過圖像分析軟件對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，siRNA-Gal-1組中p-RaF-1、p-c-Jun和c-Fos的陽性表達(dá)率分別為siRNA-NC組的0.42±0.05、0.36±0.04和0.40±0.05，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，敲低半乳凝素-1能夠顯著抑制RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括RaF-1的磷酸化水平以及AP-1復(fù)合物中c-Jun和c-Fos的表達(dá)和磷酸化水平。<插入圖3：半乳凝素-1敲低對RaF-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A：Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)；B：免疫組化檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)。*P<0.01vssiRNA-NC組>4.2.2信號通路活性變化雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1后，AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性顯著降低（圖4）。以轉(zhuǎn)染pGL3-Basic和pRL-TK質(zhì)粒的細(xì)胞作為對照組，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，siRNA-NC組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為1.00±0.10，而siRNA-Gal-1組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性降低至0.35±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-NC組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為1.00±0.12，siRNA-Gal-1組降低至0.32±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，敲低半乳凝素-1能夠顯著抑制RaF-1/AP-1信號通路的活性，降低AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，從而影響下游基因的表達(dá)。<插入圖4：半乳凝素-1敲低對RaF-1/AP-1信號通路活性的影響。*P<0.01vssiRNA-NC組>4.2.3上下游分子的調(diào)控關(guān)系為了進(jìn)一步探究半乳凝素-1與RaF-1/AP-1信號通路上下游分子的調(diào)控關(guān)系，我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，利用免疫共沉淀技術(shù)檢測半乳凝素-1與RaF-1之間是否存在直接相互作用。結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，均能檢測到半乳凝素-1與RaF-1的相互結(jié)合（圖5A）。這表明半乳凝素-1可能通過與RaF-1直接結(jié)合，影響其活性和磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控RaF-1/AP-1信號通路。接著，通過過表達(dá)RaF-1來驗(yàn)證其對AP-1活性的影響。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染RaF-1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-RaF-1）后，Westernblot檢測結(jié)果顯示，RaF-1的表達(dá)水平顯著升高（圖5B）。同時，AP-1復(fù)合物中c-Jun和c-Fos的表達(dá)水平以及p-c-Jun（Ser73）的磷酸化水平也顯著增加（圖5B）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)RaF-1能夠顯著提高AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性（圖5C）。在MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為1.85±0.15，顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（pcDNA3.1）組的1.00±0.10，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為1.90±0.18，顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.00±0.12，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低半乳凝素-1后，過表達(dá)RaF-1能夠部分逆轉(zhuǎn)對AP-1活性的抑制作用。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，先轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1敲低半乳凝素-1的表達(dá)，再轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1過表達(dá)RaF-1，Westernblot檢測結(jié)果顯示，c-Jun和c-Fos的表達(dá)水平以及p-c-Jun（Ser73）的磷酸化水平較單獨(dú)轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1組有所升高（圖5D）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性也有所提高（圖5E）。在MCF-7細(xì)胞中，siRNA-Gal-1+pcDNA-RaF-1組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為0.65±0.08，顯著高于siRNA-Gal-1組的0.35±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-Gal-1+pcDNA-RaF-1組AP-1的相對轉(zhuǎn)錄活性為0.62±0.07，顯著高于siRNA-Gal-1組的0.32±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，半乳凝素-1可以通過與RaF-1直接結(jié)合，激活RaF-1/AP-1信號通路，而敲低半乳凝素-1則抑制該信號通路的活性。同時，過表達(dá)RaF-1能夠部分逆轉(zhuǎn)敲低半乳凝素-1對AP-1活性的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了半乳凝素-1與RaF-1/AP-1信號通路之間的上下游調(diào)控關(guān)系。<插入圖5：半乳凝素-1與RaF-1/AP-1信號通路上下游分子的調(diào)控關(guān)系。A：免疫共沉淀檢測半乳凝素-1與RaF-1的相互作用；B：Westernblot檢測過表達(dá)RaF-1對AP-1相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；C：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測過表達(dá)RaF-1對AP-1活性的影響；D：Westernblot檢測敲低半乳凝素-1后過表達(dá)RaF-1對AP-1相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；E：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測敲低半乳凝素-1后過表達(dá)RaF-1對AP-1活性的影響。*P<0.01vs相應(yīng)對照組>五、抑制RaF-1/AP-1信號通路與乳腺癌藥物敏感性的關(guān)聯(lián)5.1抑制RaF-1/AP-1信號通路對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的直接影響5.1.1使用信號通路抑制劑的實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果為了直接探究抑制RaF-1/AP-1信號通路對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響，我們設(shè)計并實(shí)施了一系列實(shí)驗(yàn)。選用MCF-7和MDA-MB-231這兩種具有代表性的乳腺癌細(xì)胞系作為研究對象。首先，使用RaF-1特異性抑制劑GW5074處理細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個細(xì)胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度梯度的GW5074（0、0.5、1、2、4μmol/L），同時設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞）和溶劑對照組（加入等體積的DMSO，DMSO為GW5074的溶劑）。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，繼續(xù)孵育1-4h。然后用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（溶劑對照組OD值-空白組OD值）]×100%。結(jié)果顯示，隨著GW5074濃度的增加，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。當(dāng)GW5074濃度達(dá)到2μmol/L時，MCF-7細(xì)胞的存活率為（56.32±3.25）%，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率為（53.18±3.05）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。接著，在GW5074處理細(xì)胞的基礎(chǔ)上，加入化療藥物阿霉素（DOX），進(jìn)一步檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性。將細(xì)胞接種于96孔板中，分組設(shè)置如下：對照組（只加培養(yǎng)基和細(xì)胞）、溶劑對照組（加入等體積的DMSO和細(xì)胞）、GW5074組（加入2μmol/LGW5074和細(xì)胞）、DOX組（加入2μmol/LDOX和細(xì)胞）、GW5074+DOX組（加入2μmol/LGW5074和2μmol/LDOX和細(xì)胞）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。按照上述CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，與單獨(dú)使用DOX組相比，GW5074+DOX組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的存活率顯著降低。在MCF-7細(xì)胞中，DOX組的細(xì)胞存活率為（75.23±4.10）%，而GW5074+DOX組的細(xì)胞存活率降低至（35.68±2.50）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，DOX組的細(xì)胞存活率為（72.56±3.80）%，GW5074+DOX組的細(xì)胞存活率降低至（32.15±2.20）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，我們還采用了流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞接種于6孔板中，分組設(shè)置與CCK-8實(shí)驗(yàn)相同。待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)的藥物處理48h。收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書操作，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用DOX組相比，GW5074+DOX組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率顯著增加。在MCF-7細(xì)胞中，DOX組的細(xì)胞凋亡率為（12.56±1.50）%，而GW5074+DOX組的細(xì)胞凋亡率升高至（35.68±2.50）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，DOX組的細(xì)胞凋亡率為（13.25±1.60）%，GW5074+DOX組的細(xì)胞凋亡率升高至（38.20±2.80）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，使用RaF-1抑制劑GW5074能夠抑制RaF-1/AP-1信號通路的活性，顯著提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物阿霉素的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率。5.1.2過表達(dá)或敲低信號通路關(guān)鍵蛋白的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證抑制RaF-1/AP-1信號通路對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響，我們進(jìn)行了過表達(dá)或敲低信號通路關(guān)鍵蛋白的實(shí)驗(yàn)。首先，構(gòu)建RaF-1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-RaF-1）和針對c-Jun的小干擾RNA（siRNA-c-Jun）。將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將pcDNA-RaF-1、siRNA-c-Jun以及相應(yīng)的對照質(zhì)?；?qū)φ誷iRNA（pcDNA3.1、siRNA-NC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用Westernblot技術(shù)檢測RaF-1和c-Jun的蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pcDNA3.1的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中RaF-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高；與轉(zhuǎn)染對照siRNA（siRNA-NC）的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siRNA-c-Jun的細(xì)胞中c-Jun的蛋白表達(dá)水平顯著降低。接著，在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入化療藥物紫杉醇（PTX），檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性。將細(xì)胞接種于96孔板中，分組設(shè)置如下：對照組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒或?qū)φ誷iRNA并加入培養(yǎng)基和細(xì)胞）、pcDNA-RaF-1組（轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1并加入培養(yǎng)基和細(xì)胞）、siRNA-c-Jun組（轉(zhuǎn)染siRNA-c-Jun并加入培養(yǎng)基和細(xì)胞）、PTX組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)?；?qū)φ誷iRNA并加入2μmol/LPTX和細(xì)胞）、pcDNA-RaF-1+PTX組（轉(zhuǎn)染pcDNA-RaF-1并加入2μmol/LPTX和細(xì)胞）、siRNA-c-Jun+PTX組（轉(zhuǎn)染siRNA-c-Jun并加入2μmol/LPTX和細(xì)胞）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。按照CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，與PTX組相比，pcDNA-RaF-1+PTX組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的存活率顯著升高；而siRNA-c-Jun+PTX組細(xì)胞的存活率顯著降低。在MCF-7細(xì)胞中，PTX組的細(xì)胞存活率為（45.68±3.00）%，pcDNA-RaF-1+PTX組的細(xì)胞存活率升高至（72.35±4.50）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；siRNA-c-Jun+PTX組的細(xì)胞存活率降低至（25.62±2.00）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，PTX組的細(xì)胞存活率為（43.56±2.80）%，pcDNA-RaF-1+PTX組的細(xì)胞存活率升高至（70.20±4.20）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；siRNA-c-Jun+PTX組的細(xì)胞存活率降低至（22.30±1.80）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同樣，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。分組設(shè)置與CCK-8實(shí)驗(yàn)相同。待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)的藥物處理48h。收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書操作，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與PTX組相比，pcDNA-RaF-1+PTX組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率顯著降低；而siRNA-c-Jun+PTX組細(xì)胞的凋亡率顯著增加。在MCF-7細(xì)胞中，PTX組的細(xì)胞凋亡率為（25.68±2.50）%，pcDNA-RaF-1+PTX組的細(xì)胞凋亡率降低至（12.35±1.50）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；siRNA-c-Jun+PTX組的細(xì)胞凋亡率升高至（45.62±3.00）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，PTX組的細(xì)胞凋亡率為（23.25±2.20）%，pcDNA-RaF-1+PTX組的細(xì)胞凋亡率降低至（10.20±1.20）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；siRNA-c-Jun+PTX組的細(xì)胞凋亡率升高至（48.20±3.20）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，過表達(dá)RaF-1能夠降低乳腺癌細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性，抑制細(xì)胞凋亡；而敲低c-Jun則能夠提高乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步證實(shí)了抑制RaF-1/AP-1信號通路可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。5.2信號通路與乳腺癌耐藥相關(guān)分子的關(guān)系5.2.1P-糖蛋白等耐藥蛋白的表達(dá)變化為了探究抑制RaF-1/AP-1信號通路對乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，我們利用Westernblot技術(shù)檢測了P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）等耐藥蛋白的表達(dá)水平。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分別用RaF-1抑制劑GW5074處理24h，同時設(shè)置對照組（只加入等體積的DMSO）。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，GW5074處理組中P-gp、BCRP和MRP1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（圖6A）。以β-actin作為內(nèi)參，通過灰度值分析計算耐藥蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，GW5074處理組P-gp的相對表達(dá)量為對照組的0.45±0.05，BCRP的相對表達(dá)量為對照組的0.40±0.04，MRP1的相對表達(dá)量為對照組的0.42±0.05，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，GW5074處理組P-gp的相對表達(dá)量為對照組的0.42±0.04，BCRP的相對表達(dá)量為對照組的0.38±0.03，MRP1的相對表達(dá)量為對照組的0.40±0.04，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低半乳凝素-1后，乳腺癌細(xì)胞中P-gp等耐藥蛋白的表達(dá)水平也顯著降低。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1，48h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC的對照組相比，siRNA-Gal-1組中P-gp、BCRP和MRP1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（圖6B）。在MCF-7細(xì)胞中，siRNA-Gal-1組P-gp的相對表達(dá)量為對照組的0.40±0.04，BCRP的相對表達(dá)量為對照組的0.35±0.03，MRP1的相對表達(dá)量為對照組的0.38±0.04，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-Gal-1組P-gp的相對表達(dá)量為對照組的0.38±0.03，BCRP的相對表達(dá)量為對照組的0.33±0.03，MRP1的相對表達(dá)量為對照組的0.36±0.03，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，抑制RaF-1/AP-1信號通路能夠顯著降低乳腺癌細(xì)胞中P-gp等耐藥蛋白的表達(dá)水平，這可能是其提高乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的重要機(jī)制之一。<插入圖6：抑制RaF-1/AP-1信號通路對乳腺癌耐藥蛋白表達(dá)的影響。A：GW5074處理對耐藥蛋白表達(dá)的影響；B：敲低半乳凝素-1對耐藥蛋白表達(dá)的影響。*P<0.01vs相應(yīng)對照組>5.2.2其他耐藥相關(guān)機(jī)制的探討除了耐藥蛋白的表達(dá)變化，我們還探討了RaF-1/AP-1信號通路與其他耐藥機(jī)制如凋亡抵抗、DNA損傷修復(fù)的聯(lián)系。在凋亡抵抗方面，我們利用Westernblot技術(shù)檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用RaF-1抑制劑GW5074處理24h，同時設(shè)置對照組（只加入等體積的DMSO）。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，GW5074處理組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，促凋亡蛋白Bax和活化的Caspase-3（cleaved-Caspase-3）的表達(dá)水平顯著升高（圖7A）。以β-actin作為內(nèi)參，通過灰度值分析計算凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，GW5074處理組Bcl-2的相對表達(dá)量為對照組的0.40±0.04，Bax的相對表達(dá)量為對照組的1.80±0.15，cleaved-Caspase-3的相對表達(dá)量為對照組的2.00±0.20，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，GW5074處理組Bcl-2的相對表達(dá)量為對照組的0.38±0.03，Bax的相對表達(dá)量為對照組的1.85±0.18，cleaved-Caspase-3的相對表達(dá)量為對照組的2.10±0.22，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低半乳凝素-1也能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1，48h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC的對照組相比，siRNA-Gal-1組中Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bax和cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高（圖7