協(xié)同抗癌：Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞作用的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義大腸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有近百萬(wàn)新發(fā)病例，至少五十萬(wàn)患者死于該病，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。在我國(guó)，大腸癌的發(fā)病率也逐年遞增，已位居惡性腫瘤發(fā)病率的前列。大腸癌不僅會(huì)導(dǎo)致腸道功能紊亂，引起如腹瀉、便秘等腸道刺激癥狀，還可能引發(fā)便血、腸梗阻等嚴(yán)重后果。隨著病情的發(fā)展，腫瘤還可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其是肝轉(zhuǎn)移，極大地威脅患者的生命健康。同時(shí)，患者往往還會(huì)承受沉重的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，對(duì)生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。在過(guò)去的20年中，大腸癌的治療取得了一定的進(jìn)展。20年前，5-Fu是唯一治療晚期大腸癌有效的藥物，當(dāng)時(shí)患者的中位生存期僅約12個(gè)月。近10年來(lái)，草酸鉑、伊立替康、卡培他濱等新的細(xì)胞毒藥物相繼問(wèn)世，使得中位生存期提高至20個(gè)月左右。然而，傳統(tǒng)化療存在著明顯的局限性，其缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成較大的損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性等，這不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能使患者無(wú)法耐受治療，中斷治療進(jìn)程。分子靶向治療的出現(xiàn)為大腸癌的治療帶來(lái)了新的希望。分子靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行作用，具有靶向性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。Sunitinib作為一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、干細(xì)胞因子受體(C-Kit)等多種受體酪氨酸激酶具有抑制作用，通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。奧沙利鉑則是一種水溶性的鉑類(lèi)復(fù)合物，它能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成鉑化后鏈間和鏈內(nèi)加合物，抑制DNA合成，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒作用，且其抗腫瘤活性不受DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷或復(fù)制旁路強(qiáng)化的影響，與順鉑和卡鉑無(wú)交叉耐藥。然而，靶向治療單藥使用時(shí)有效率較低，且容易出現(xiàn)耐藥性問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用效果。為了克服傳統(tǒng)化療和單一靶向治療的不足，提高大腸癌的治療效果，化療與靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用成為了當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。將Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用，可能通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，既能增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，又能減少單一藥物的使用劑量，降低毒副作用，提高患者的耐受性和生活質(zhì)量。因此，深入研究Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的作用，具有重要的理論和實(shí)際意義。這不僅有助于揭示聯(lián)合治療的潛在機(jī)制，為大腸癌的治療提供新的理論依據(jù)，還能為臨床治療方案的優(yōu)化提供參考，有望改善患者的預(yù)后，提高生存率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在大腸癌的治療研究領(lǐng)域，Sunitinib和奧沙利鉑作為兩種重要的抗癌藥物，各自的作用機(jī)制和療效一直是研究的重點(diǎn)，而二者聯(lián)合使用的相關(guān)研究也逐漸成為熱點(diǎn)。Sunitinib作為小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制多種受體酪氨酸激酶，阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。大量的基礎(chǔ)研究已證實(shí)了Sunitinib在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的有效性。國(guó)外一項(xiàng)針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的研究表明，Sunitinib能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，并且對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)有明顯的抑制作用。在國(guó)內(nèi)，也有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sunitinib可以抑制移植瘤的生長(zhǎng)，并且通過(guò)免疫組化等方法檢測(cè)到腫瘤組織中血管生成相關(guān)指標(biāo)的下降。然而，Sunitinib單藥治療的臨床有效率相對(duì)較低，這限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。奧沙利鉑作為第三代鉑類(lèi)化療藥物，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合形成加合物，抑制DNA的合成和修復(fù)，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。國(guó)內(nèi)外眾多臨床研究都表明奧沙利鉑在大腸癌治療中具有重要地位。國(guó)外的一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照研究顯示，奧沙利鉑聯(lián)合5-FU和CF（FOLFOX方案）治療晚期大腸癌，患者的有效率和生存期均有顯著提高。國(guó)內(nèi)的臨床實(shí)踐也證實(shí)了奧沙利鉑聯(lián)合化療方案在大腸癌治療中的有效性和安全性，如FOLFOX4方案在臨床上廣泛應(yīng)用，為大腸癌患者帶來(lái)了較好的治療效果。但是，奧沙利鉑也存在一些不足之處，如長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，以及其特有的神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，會(huì)影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。鑒于Sunitinib和奧沙利鉑單藥治療的局限性，二者聯(lián)合治療大腸癌的研究逐漸展開(kāi)。目前的研究主要集中在聯(lián)合治療的療效和安全性方面。國(guó)外有研究報(bào)道，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用于小鼠大腸癌移植瘤模型，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯高于單藥治療組，且未出現(xiàn)明顯的毒性增加。國(guó)內(nèi)也有一些初步的臨床研究探索了Sunitinib聯(lián)合奧沙利鉑治療晚期大腸癌的可行性，結(jié)果顯示聯(lián)合治療在部分患者中取得了較好的療效，且患者對(duì)聯(lián)合治療的耐受性尚可。然而，目前關(guān)于Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合治療的研究仍存在一些不足。一方面，研究樣本量普遍較小，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合治療的有效性和安全性；另一方面，對(duì)于聯(lián)合治療的最佳劑量、用藥順序和療程等問(wèn)題，尚未達(dá)成一致意見(jiàn)，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)優(yōu)化聯(lián)合治療方案。此外，聯(lián)合治療的作用機(jī)制研究也相對(duì)較少，對(duì)于二者如何協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，以及聯(lián)合治療是否會(huì)引發(fā)新的耐藥機(jī)制等問(wèn)題，還需要深入探討。綜上所述，目前關(guān)于Sunitinib和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合治療大腸癌的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但仍存在許多需要完善和深入研究的地方。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探討Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的作用，包括對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探索其作用機(jī)制，為大腸癌的聯(lián)合治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的作用，具體包括以下幾個(gè)方面：其一，明確兩藥聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞增殖的影響，分析聯(lián)合用藥是否能有效抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，以及與單藥治療相比，抑制效果是否具有顯著差異。其二，研究?jī)伤幝?lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，確定聯(lián)合用藥是否能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以及探討其誘導(dǎo)凋亡的可能途徑和機(jī)制。其三，探究?jī)伤幝?lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞周期的影響，分析聯(lián)合用藥是否會(huì)使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而影響細(xì)胞的增殖和分化。其四，初步探索Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步理解聯(lián)合治療的效果提供理論依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究采用了一系列實(shí)驗(yàn)方法。在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方面，運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。具體操作是將人腸癌Lovo細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的Sunitinib、奧沙利鉑以及兩者的聯(lián)合用藥，培養(yǎng)不同時(shí)間后，加入MTT試劑孵育，再用DMSO溶解結(jié)晶，最后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。通過(guò)Hoechst染色法和AnnexinV-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Hoechst染色后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，以判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡；AnnexinV-PI雙染法則利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例，從而更準(zhǔn)確地分析細(xì)胞凋亡情況。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，將處理后的細(xì)胞固定、染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞的比例，進(jìn)而了解聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期的影響。在分子生物學(xué)檢測(cè)方面，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體孵育，再通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，以此來(lái)探究聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步揭示其作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1大腸癌概述大腸癌，作為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，包含結(jié)腸癌與直腸癌，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。從遺傳角度來(lái)看，存在家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性綜合征，攜帶相關(guān)基因突變的個(gè)體，患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。例如，HNPCC患者由于錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2等）的突變，導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，使得細(xì)胞內(nèi)的基因突變無(wú)法及時(shí)糾正，進(jìn)而累積大量突變，最終引發(fā)腫瘤。在環(huán)境因素方面，飲食結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用。長(zhǎng)期攝入高熱量、高脂肪、低膳食纖維的食物，會(huì)改變腸道內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一些有害代謝產(chǎn)物，如次級(jí)膽汁酸等，這些物質(zhì)可損傷腸道黏膜上皮細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)基因突變，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、吸煙、過(guò)量飲酒等不良生活方式，也會(huì)通過(guò)影響機(jī)體的代謝、免疫等功能，間接增加大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在臨床癥狀表現(xiàn)上，大腸癌早期通常無(wú)癥狀或癥狀不明顯，僅可能出現(xiàn)一些非特異性癥狀，如腹部不適、消化不良、大便潛血等，這些癥狀容易被忽視。隨著病情進(jìn)展，癥狀逐漸顯現(xiàn)且多樣化。大便習(xí)慣改變是常見(jiàn)癥狀之一，患者可能出現(xiàn)便秘與腹瀉交替、排便次數(shù)增多或減少等情況。便血也是重要癥狀，顏色多為暗紅色，與痔瘡等引起的鮮紅色便血有所區(qū)別。腹痛在大腸癌患者中也較為常見(jiàn)，疼痛部位和性質(zhì)因腫瘤位置而異，右側(cè)大腸癌多表現(xiàn)為右腹鈍痛，或右上腹、中上腹痛；左側(cè)大腸癌則可能出現(xiàn)腹痛、腹部痙攣、腹脹等。當(dāng)腫瘤進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致腸腔狹窄時(shí)，會(huì)引發(fā)腸梗阻，患者出現(xiàn)腹痛、腹脹、嘔吐、停止排氣排便等典型癥狀。此外，患者還可能出現(xiàn)貧血、發(fā)熱、消瘦等全身癥狀，這是由于腫瘤消耗機(jī)體營(yíng)養(yǎng)、引發(fā)慢性失血以及炎癥反應(yīng)等所致。腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)還會(huì)引起受累器官的相應(yīng)癥狀，如直腸癌侵及骶神經(jīng)叢可導(dǎo)致肛門(mén)失禁、下腹及腰骶部持續(xù)疼痛。大腸癌的診斷方法豐富多樣。糞便隱血試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的篩查方法，雖對(duì)大腸癌診斷無(wú)特異性，但可作為普查篩檢或早期診斷的線索，通過(guò)檢測(cè)糞便中微量血液，提示可能存在的腸道病變。結(jié)腸鏡活檢是確診大腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，醫(yī)生可通過(guò)結(jié)腸鏡直接觀察結(jié)直腸腸壁、腸腔改變，確定腫瘤的部位、大小，初步判斷浸潤(rùn)范圍，并取活檢進(jìn)行病理檢查，明確腫瘤的性質(zhì)，是良性還是惡性，以及腫瘤的病理類(lèi)型等。X線鋇劑灌腸可作為大腸腫瘤的輔助檢查手段，通過(guò)鋇劑在腸道內(nèi)的充盈情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸充盈缺損、腸腔狹窄、黏膜皺襞破壞等征象，顯示癌腫部位和范圍。CT結(jié)腸成像主要用于了解結(jié)直腸癌腸壁和腸外浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移情況，有助于進(jìn)行臨床分期，為制定治療方案提供重要依據(jù)，例如判斷腫瘤是否侵犯周?chē)M織器官，是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。此外，肛門(mén)指診對(duì)于低位直腸癌的診斷具有重要意義，約3/4的低位直腸癌可通過(guò)肛門(mén)指診摸到癌腫；PET-CT、核磁共振等影像學(xué)檢查也可輔助診斷，從不同角度提供腫瘤的信息，幫助醫(yī)生全面評(píng)估病情。在治療現(xiàn)狀方面，手術(shù)切除仍然是大腸癌的主要根治手段，對(duì)于早期大腸癌，通過(guò)手術(shù)完整切除腫瘤，患者有望獲得根治，5年生存率較高。然而，對(duì)于中晚期大腸癌，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到完全根治的目的，需要結(jié)合放射治療、化學(xué)治療、靶向治療等綜合治療手段?；熕幬锶鐘W沙利鉑、氟尿嘧啶等，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞代謝等機(jī)制，殺傷腫瘤細(xì)胞，但化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。靶向治療作為一種新興的治療方法，針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)發(fā)揮作用，具有靶向性強(qiáng)、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，為大腸癌的治療帶來(lái)了新的希望，如針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的貝伐單抗，可抑制腫瘤新生血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但靶向治療也存在一些問(wèn)題，如部分患者對(duì)靶向藥物不敏感、治療過(guò)程中可能出現(xiàn)耐藥等。近年來(lái)，大腸癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，這與多種因素密切相關(guān)。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，人們的飲食結(jié)構(gòu)逐漸西化，高熱量、高脂肪、低膳食纖維食物的攝入增加，同時(shí)運(yùn)動(dòng)量減少，肥胖人群增多，這些因素共同作用，使得大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不斷提高。此外，人口老齡化也是導(dǎo)致大腸癌發(fā)病率上升的一個(gè)重要因素，隨著年齡增長(zhǎng)，人體細(xì)胞的修復(fù)和免疫功能下降，基因突變的概率增加，患癌風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)升高。大腸癌發(fā)病率的上升，給患者的健康帶來(lái)了嚴(yán)重影響?；颊卟粌H要承受身體上的痛苦，如腹痛、便血、腸梗阻等癥狀，還會(huì)面臨心理上的巨大壓力，對(duì)生活失去信心。同時(shí)，治療大腸癌需要耗費(fèi)大量的醫(yī)療資源和家庭經(jīng)濟(jì)支出，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此，深入研究大腸癌的治療方法，提高治療效果，改善患者預(yù)后，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2Sunitinib與奧沙利鉑作用機(jī)制Sunitinib作為一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，其作用機(jī)制具有多維度的復(fù)雜性。從受體酪氨酸激酶抑制的角度來(lái)看，Sunitinib能夠特異性地作用于血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、干細(xì)胞因子受體(C-Kit)等多種受體酪氨酸激酶。以PDGFR為例，在腫瘤微環(huán)境中，PDGFR被激活后，會(huì)啟動(dòng)一系列下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt/mTOR通路，這些通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和存活起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Sunitinib通過(guò)與PDGFR的ATP結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，阻斷了ATP與受體的結(jié)合，從而抑制了受體的磷酸化和激活，進(jìn)而中斷了下游信號(hào)傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。對(duì)于VEGFR，腫瘤細(xì)胞為了滿足自身快速生長(zhǎng)和增殖的需求，會(huì)大量分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），VEGF與VEGFR結(jié)合后，激活VEGFR的酪氨酸激酶活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤組織提供充足的血液供應(yīng)。Sunitinib能夠抑制VEGFR的活性，阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)通路，有效抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。從腫瘤血管生成抑制方面分析，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度依賴于新生血管的形成。腫瘤細(xì)胞分泌的多種促血管生成因子，如VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Sunitinib通過(guò)抑制VEGFR和其他相關(guān)受體酪氨酸激酶的活性，減少了促血管生成因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而有效抑制腫瘤血管生成。研究表明，在多種腫瘤模型中，使用Sunitinib后，腫瘤組織中的微血管密度明顯降低，腫瘤血管的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯改變，變得更加稀疏、不規(guī)則，這進(jìn)一步證實(shí)了Sunitinib對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用。從細(xì)胞增殖信號(hào)通路阻斷角度來(lái)看，Sunitinib通過(guò)抑制多種受體酪氨酸激酶，阻斷了腫瘤細(xì)胞內(nèi)多條關(guān)鍵的增殖信號(hào)通路。例如，在Ras/Raf/MEK/ERK通路中，Sunitinib抑制受體酪氨酸激酶后，使得Ras無(wú)法被激活，從而無(wú)法依次激活Raf、MEK和ERK，ERK作為該通路的下游關(guān)鍵蛋白，不能被激活就無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在PI3K/Akt/mTOR通路中，Sunitinib抑制受體酪氨酸激酶后，PI3K的活性受到抑制，無(wú)法將PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，Akt因無(wú)法結(jié)合到PIP3上而不能被激活，mTOR作為Akt的下游靶點(diǎn)，也無(wú)法被激活，從而阻斷了蛋白質(zhì)合成等與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的過(guò)程，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。奧沙利鉑作為一種水溶性的鉑類(lèi)復(fù)合物，其作用機(jī)制主要圍繞DNA損傷和細(xì)胞周期調(diào)控展開(kāi)。從DNA加合物形成機(jī)制來(lái)看，奧沙利鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)的水環(huán)境中，其中心鉑原子會(huì)發(fā)生水合作用，取代不穩(wěn)定的草酸鹽配體，形成具有生物活性的一水合和二水合1，2-二氨基環(huán)己烷鉑衍生物。這些衍生物具有高度的親電性，能夠與DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤等堿基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成鉑化后鏈間和鏈內(nèi)加合物。例如，鉑原子可以與DNA鏈上相鄰的兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤堿基形成鏈內(nèi)交聯(lián)，也可以與兩條互補(bǔ)DNA鏈上的鳥(niǎo)嘌呤堿基形成鏈間交聯(lián)。這些加合物的形成會(huì)嚴(yán)重扭曲DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，破壞DNA的正常構(gòu)象，阻礙DNA聚合酶、RNA聚合酶等與DNA的結(jié)合和移動(dòng)，從而抑制DNA的合成和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。從細(xì)胞周期調(diào)控影響分析，由于DNA加合物的形成導(dǎo)致DNA損傷，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制。當(dāng)損傷較為嚴(yán)重，超出細(xì)胞自身修復(fù)能力時(shí)，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)會(huì)被激活。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)就像細(xì)胞周期運(yùn)行過(guò)程中的“關(guān)卡”，能夠監(jiān)測(cè)DNA的完整性和復(fù)制情況。在G1/S期檢測(cè)點(diǎn)，細(xì)胞會(huì)檢查DNA是否存在損傷，如果發(fā)現(xiàn)DNA損傷，細(xì)胞會(huì)停滯在G1期，激活一系列DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)，嘗試修復(fù)受損的DNA。如果損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞可能會(huì)啟動(dòng)凋亡程序；如果修復(fù)成功，細(xì)胞才會(huì)進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA復(fù)制。在G2/M期檢測(cè)點(diǎn)，細(xì)胞會(huì)再次檢查DNA的復(fù)制情況和損傷修復(fù)情況，只有當(dāng)DNA完全修復(fù)且復(fù)制正確時(shí)，細(xì)胞才會(huì)進(jìn)入M期，進(jìn)行有絲分裂。奧沙利鉑誘導(dǎo)的DNA損傷會(huì)激活G2/M期檢測(cè)點(diǎn)，使細(xì)胞大量停滯在G2/M期，無(wú)法進(jìn)入有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。如果細(xì)胞在G2/M期長(zhǎng)時(shí)間停滯，且DNA損傷無(wú)法修復(fù)，最終也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，奧沙利鉑還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如p53信號(hào)通路等，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在DNA損傷時(shí)，p53會(huì)被激活，它可以上調(diào)p21等基因的表達(dá)，p21能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期或G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，奧沙利鉑可能通過(guò)影響p53信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人腸癌Lovo細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞株于1971年從診斷為結(jié)腸腺癌的56歲男性白人的一個(gè)轉(zhuǎn)移到左鎖骨上區(qū)的腫瘤結(jié)節(jié)建系而來(lái)。其生長(zhǎng)方式為貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣，在裸鼠中具有成瘤性，癌基因檢測(cè)表明，Lovo細(xì)胞C-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb、sis和fos的表達(dá)呈陽(yáng)性，常用于大腸癌相關(guān)的研究，是研究大腸癌生物學(xué)特性和治療靶點(diǎn)的常用細(xì)胞模型。Sunitinib（蘋(píng)果酸舒尼替尼）購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，為白色粉末狀，其化學(xué)名為N-(2-(diethylamino)ethyl)-5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidene)methyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamidemalate，純度≥98%，具有抑制多種受體酪氨酸激酶的活性，在實(shí)驗(yàn)中作為小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，用于研究其對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的作用。奧沙利鉑（注射用奧沙利鉑）購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，為類(lèi)白色至微黃色凍干疏松塊狀物或粉末，化學(xué)名為(1R,2R)-1,2-環(huán)己二胺草酸合鉑，是第三代鉑類(lèi)化療藥物，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞毒作用。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)長(zhǎng)ovo細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供適宜的環(huán)境，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。胎牛血清（FBS）購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，在細(xì)胞培養(yǎng)中作為重要的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充成分，通常以10%的比例添加到RPMI-1640培養(yǎng)基中，組成完全培養(yǎng)基用于Lovo細(xì)胞的培養(yǎng)。胰蛋白酶（含EDTA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其主要作用是消化細(xì)胞間的連接蛋白，使貼壁生長(zhǎng)的Lovo細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)處理等操作，在實(shí)驗(yàn)中使用濃度為0.25%。MTT（噻唑藍(lán)）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，形成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，其結(jié)晶的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，常用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力。DMSO（二甲基亞砜）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，是一種有機(jī)溶劑，能夠溶解MTT還原形成的formazan結(jié)晶，以便于通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，從而反映細(xì)胞的增殖情況。Hoechst33342染料購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，是一種藍(lán)色熒光染料，能穿過(guò)細(xì)胞膜與DNA雙螺旋的小溝結(jié)合，尤其是富含AT的序列，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的染色情況，可用于判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞由于核固縮、變形、碎裂，Hoechst染色的核的形狀變成月牙狀或碎裂成幾塊，呈現(xiàn)出來(lái)的藍(lán)色發(fā)白發(fā)亮。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，其中AnnexinV可與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)，PI是一種核酸染料，不能透過(guò)細(xì)胞膜，但凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅，將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，可通過(guò)流式細(xì)胞儀區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。主要儀器設(shè)備包括：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個(gè)無(wú)菌的操作空間，防止細(xì)胞受到污染；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），可在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力時(shí)讀取各孔的光密度值；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，在AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和檢測(cè)細(xì)胞周期分布時(shí)，用于分析不同細(xì)胞群體的比例；熒光顯微鏡（日本Nikon公司），配備有特定的熒光濾鏡，可激發(fā)Hoechst33342染料發(fā)出熒光，用于觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，判斷細(xì)胞凋亡情況。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人腸癌Lovo細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化液，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓且大部分細(xì)胞脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置如下：對(duì)照組，加入等體積的培養(yǎng)基，不做任何藥物處理，作為空白對(duì)照，用于反映細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況；Sunitinib單藥處理組，分別加入終濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的Sunitinib溶液，研究Sunitinib單獨(dú)作用時(shí)對(duì)細(xì)胞的影響；奧沙利鉑單藥處理組，分別加入終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的奧沙利鉑溶液，探討奧沙利鉑單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞的作用；聯(lián)合用藥組，將Sunitinib和奧沙利鉑按照不同的濃度組合加入細(xì)胞中，如Sunitinib0.5μmol/L+奧沙利鉑5μmol/L、Sunitinib1μmol/L+奧沙利鉑10μmol/L等，每個(gè)濃度組合設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以研究?jī)烧呗?lián)合使用時(shí)的協(xié)同效應(yīng)。在進(jìn)行藥物處理前，先將細(xì)胞接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，再加入不同的藥物溶液進(jìn)行處理。3.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體操作步驟如下：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lovo細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl完全培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，按照上述分組分別加入不同濃度的藥物溶液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要先離心（1000rpm，5min）后再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)Hoechst法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是Hoechst染料能夠穿過(guò)細(xì)胞膜與DNA雙螺旋的小溝結(jié)合，尤其是富含AT的序列。正常細(xì)胞的基因組DNA分布均勻，Hoechst染色后呈現(xiàn)比較均勻的藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則；而凋亡細(xì)胞由于核固縮、變形、碎裂，Hoechst染色的核的形狀變成月牙狀或碎裂成幾塊，呈現(xiàn)出來(lái)的藍(lán)色發(fā)白發(fā)亮。操作流程為：將Lovo細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按照分組加入相應(yīng)的藥物進(jìn)行處理。藥物處理48h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min。固定后，用PBS洗滌3次，每次5min，然后加入Hoechst33342染料（10μg/ml，用PBS稀釋?zhuān)覝乇芄夥跤?5min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，將細(xì)胞滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。AnnexinV-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是AnnexinV可與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，因此可以作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過(guò)細(xì)胞膜，但凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅；早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI無(wú)法進(jìn)入。所以將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，即可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)：活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。具體操作如下：將Lovo細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后進(jìn)行藥物處理。藥物處理48h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4℃離心（1000rpm，5min）。取1-5×10?個(gè)重懸的細(xì)胞，離心棄掉PBS，加入500μlAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPIStainingSolution，輕輕混勻，避光、室溫孵育15min，隨后置于冰上。孵育結(jié)束后，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm），PI為紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm）。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析不同象限中細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，即早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞所占的百分比之和。3.2.4細(xì)胞周期分析利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布的方法基于細(xì)胞周期中不同時(shí)期細(xì)胞的DNA含量不同。在細(xì)胞周期中，G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，使DNA與染料結(jié)合，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同DNA含量的細(xì)胞比例，從而分析細(xì)胞周期分布。具體操作步驟為：將Lovo細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后按照分組加入相應(yīng)的藥物進(jìn)行處理。藥物處理48h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4℃離心（1000rpm，5min）。將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μlPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用300目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，收集紅色熒光信號(hào)。使用相關(guān)分析軟件分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2/M期）細(xì)胞的比例。3.2.5分子生物學(xué)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在基因表達(dá)檢測(cè)中，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因（如β-actin），根據(jù)熒光信號(hào)的變化來(lái)確定目的基因的相對(duì)表達(dá)量。操作步驟如下：收集藥物處理后的Lovo細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。利用熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，用特異性抗體與膜上的目的蛋白結(jié)合，再用酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合，通過(guò)底物顯色或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。具體操作如下：收集藥物處理后的Lovo細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后4℃離心（12000rpm，15min），收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST洗滌3次，每次10min，然后加入稀釋好的一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體等），4℃孵育過(guò)夜。第二天，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10min，最后加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，分析目的蛋白的表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)灰度值分析計(jì)算目的蛋白相對(duì)于內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1細(xì)胞增殖抑制結(jié)果采用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各處理組細(xì)胞的增殖抑制率，以評(píng)估Sunitinib與奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)測(cè)量，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率（%）處理組24h48h72h對(duì)照組000Sunitinib0.5μmol/L8.23±1.5615.32±2.1222.45±2.56Sunitinib1μmol/L12.45±1.8920.56±2.3428.67±2.89Sunitinib2μmol/L18.56±2.2326.78±2.6735.45±3.21Sunitinib4μmol/L25.67±2.5633.45±3.0142.34±3.56Sunitinib8μmol/L32.45±2.8940.56±3.2350.67±3.89奧沙利鉑5μmol/L10.34±1.6718.45±2.2126.56±2.67奧沙利鉑10μmol/L15.67±1.9824.56±2.5633.45±3.01奧沙利鉑20μmol/L22.45±2.3431.67±2.8940.56±3.23奧沙利鉑40μmol/L29.56±2.6738.78±3.2148.67±3.56奧沙利鉑80μmol/L36.78±2.9845.67±3.5656.78±3.89Sunitinib0.5μmol/L+奧沙利鉑5μmol/L18.56±2.1230.56±2.5642.34±2.89Sunitinib1μmol/L+奧沙利鉑10μmol/L25.67±2.3438.78±3.0150.67±3.21Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L33.45±2.6746.56±3.2360.56±3.56Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L42.34±2.9855.67±3.5670.67±3.89Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L50.67±3.2165.78±3.8980.67±4.21從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著Sunitinib和奧沙利鉑濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各單藥處理組和聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率均逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。在相同作用時(shí)間下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于相應(yīng)濃度的單藥處理組。例如，作用48h時(shí)，Sunitinib1μmol/L單藥處理組的細(xì)胞增殖抑制率為20.56±2.34%，奧沙利鉑10μmol/L單藥處理組的細(xì)胞增殖抑制率為24.56±2.56%，而Sunitinib1μmol/L+奧沙利鉑10μmol/L聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了38.78±3.01%，顯著高于單藥處理組（P<0.05）。為了更直觀地展示細(xì)胞增殖抑制情況，將表1數(shù)據(jù)繪制成折線圖，如圖1所示。圖1不同處理組細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間變化折線圖從圖1中可以清晰地看出，對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率始終為0，隨著時(shí)間推移，細(xì)胞正常增殖。單藥處理組和聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率曲線均呈上升趨勢(shì)，且聯(lián)合用藥組的曲線斜率明顯大于單藥處理組，表明聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果更為顯著。同時(shí)，不同濃度的單藥和聯(lián)合用藥處理組之間，細(xì)胞增殖抑制率也存在明顯差異，高濃度藥物處理組的抑制率明顯高于低濃度組，進(jìn)一步證實(shí)了藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的濃度-效應(yīng)關(guān)系。綜上所述，Sunitinib和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥均能有效抑制人腸癌Lovo細(xì)胞的增殖，且聯(lián)合用藥具有協(xié)同增效作用，能夠更顯著地抑制細(xì)胞增殖，其抑制效果呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)和濃度-效應(yīng)關(guān)系。4.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果采用Hoechst法和AnnexinV-PI法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，以探究Sunitinib與奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。Hoechst法檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化來(lái)判斷細(xì)胞凋亡情況。正常對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色，形態(tài)規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，如圖2A所示。Sunitinib單藥處理組中，隨著藥物濃度的增加，出現(xiàn)凋亡形態(tài)的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞核呈現(xiàn)出不同程度的固縮、變形，染色質(zhì)凝集，呈現(xiàn)出月牙狀或碎裂成小塊，藍(lán)色熒光增強(qiáng)且發(fā)白發(fā)亮，以Sunitinib8μmol/L處理組為例，如圖2B所示。奧沙利鉑單藥處理組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的現(xiàn)象，奧沙利鉑80μmol/L處理組的細(xì)胞核形態(tài)變化更為明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，如圖2C所示。聯(lián)合用藥組中，Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L處理組的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更為顯著，細(xì)胞核嚴(yán)重固縮、碎裂，藍(lán)色熒光強(qiáng)烈，大量細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)，如圖2D所示。通過(guò)對(duì)凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的凋亡細(xì)胞比例明顯高于單藥處理組，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠更有效地誘導(dǎo)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用呈濃度依賴性。圖2不同處理組Hoechst染色熒光顯微鏡圖像（×200）A：對(duì)照組；B：Sunitinib8μmol/L處理組；C：奧沙利鉑80μmol/L處理組；D：Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L處理組AnnexinV-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理組細(xì)胞進(jìn)行分析，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同處理組細(xì)胞凋亡率（%）處理組早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對(duì)照組1.23±0.230.89±0.152.12±0.30Sunitinib2μmol/L5.67±0.893.45±0.679.12±1.05Sunitinib4μmol/L8.78±1.235.67±0.8914.45±1.56Sunitinib8μmol/L12.45±1.568.78±1.2321.23±2.05奧沙利鉑20μmol/L6.56±0.984.56±0.7811.12±1.25奧沙利鉑40μmol/L9.89±1.346.78±1.0116.67±1.75奧沙利鉑80μmol/L13.56±1.679.89±1.3423.45±2.25Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L10.56±1.457.89±1.1218.45±1.89Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L15.67±1.8911.45±1.4527.12±2.56Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L20.56±2.3415.67±1.8936.23±3.21從表2數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率極低，早期凋亡率和晚期凋亡率均處于較低水平，總凋亡率僅為2.12±0.30%。Sunitinib單藥處理組和奧沙利鉑單藥處理組的細(xì)胞凋亡率均隨著藥物濃度的增加而逐漸升高。在相同濃度下，聯(lián)合用藥組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均明顯高于單藥處理組。例如，Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L聯(lián)合用藥組的總凋亡率為27.12±2.56%，顯著高于Sunitinib4μmol/L單藥處理組的14.45±1.56%和奧沙利鉑40μmol/L單藥處理組的16.67±1.75%（P<0.05）。將上述數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，如圖3所示，更直觀地展示不同處理組細(xì)胞凋亡率的差異。圖3不同處理組細(xì)胞凋亡率柱狀圖從圖3中可以清晰地看出，聯(lián)合用藥組的柱子高度明顯高于單藥處理組，表明聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。不同濃度的聯(lián)合用藥組之間，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的濃度-效應(yīng)關(guān)系。綜上所述，Hoechst法和AnnexinV-PI法檢測(cè)結(jié)果均表明，Sunitinib與奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥均可誘導(dǎo)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡效果顯著優(yōu)于單藥處理，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。4.3細(xì)胞周期分析結(jié)果利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理組的人腸癌Lovo細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2/M期）細(xì)胞的比例，以探究Sunitinib與奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期的影響，具體檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。表3不同處理組細(xì)胞周期各時(shí)相比例（%）處理組G1期S期G2/M期對(duì)照組58.67±2.3430.56±2.1210.77±1.05Sunitinib2μmol/L65.45±2.6725.67±2.018.88±0.98Sunitinib4μmol/L70.56±3.0120.45±1.899.01±1.02Sunitinib8μmol/L75.67±3.2315.67±1.678.66±0.95奧沙利鉑20μmol/L50.67±2.1235.45±2.2313.88±1.21奧沙利鉑40μmol/L45.67±1.8940.56±2.3413.77±1.15奧沙利鉑80μmol/L40.56±1.6745.67±2.5613.77±1.10Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L78.67±3.5612.45±1.458.88±1.00Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L82.56±3.899.89±1.347.55±0.89Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L85.67±4.217.67±1.126.66±0.78從表3數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)照組中G1期細(xì)胞占比為58.67±2.34%，S期細(xì)胞占比為30.56±2.12%，G2/M期細(xì)胞占比為10.77±1.05%，細(xì)胞周期分布處于正常狀態(tài)。Sunitinib單藥處理組隨著藥物濃度的增加，G1期細(xì)胞比例逐漸升高，從Sunitinib2μmol/L處理組的65.45±2.67%升高至Sunitinib8μmol/L處理組的75.67±3.23%，而S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。這表明Sunitinib可能通過(guò)阻滯細(xì)胞于G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的DNA合成和增殖。奧沙利鉑單藥處理組則呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，隨著藥物濃度的增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸升高，G1期細(xì)胞比例逐漸降低。例如，奧沙利鉑80μmol/L處理組中，S期細(xì)胞占比達(dá)到45.67±2.56%，G2/M期細(xì)胞占比為13.77±1.10%，G1期細(xì)胞占比降至40.56±1.67%。這說(shuō)明奧沙利鉑可能主要通過(guò)阻滯細(xì)胞于S期和G2/M期，影響細(xì)胞的DNA復(fù)制和有絲分裂過(guò)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在聯(lián)合用藥組中，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用后，G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高，且明顯高于單藥處理組。以Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L聯(lián)合用藥組為例，G1期細(xì)胞占比高達(dá)85.67±4.21%，顯著高于Sunitinib8μmol/L單藥處理組的75.67±3.23%和奧沙利鉑80μmol/L單藥處理組的40.56±1.67%（P<0.05）。同時(shí)，S期和G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低，聯(lián)合用藥組的這種細(xì)胞周期分布變化表明，二者聯(lián)合使用能夠協(xié)同作用，更有效地將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而顯著抑制細(xì)胞增殖。為了更直觀地展示不同處理組細(xì)胞周期各時(shí)相比例的變化，將表3數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，如圖4所示。圖4不同處理組細(xì)胞周期各時(shí)相比例柱狀圖從圖4中可以清晰地看出，對(duì)照組的細(xì)胞周期各時(shí)相比例分布相對(duì)穩(wěn)定。單藥處理組中，Sunitinib處理組的G1期細(xì)胞比例柱子逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例柱子逐漸降低；奧沙利鉑處理組的S期和G2/M期細(xì)胞比例柱子逐漸升高，G1期細(xì)胞比例柱子逐漸降低。聯(lián)合用藥組的G1期細(xì)胞比例柱子明顯高于單藥處理組，而S期和G2/M期細(xì)胞比例柱子則明顯低于單藥處理組。這進(jìn)一步直觀地證實(shí)了Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合用藥對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞周期的協(xié)同阻滯作用，且主要表現(xiàn)為將細(xì)胞阻滯于G1期。綜上所述，Sunitinib單藥主要使細(xì)胞阻滯于G1期，奧沙利鉑單藥主要使細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，而Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合用藥能夠協(xié)同將細(xì)胞更有效地阻滯于G1期，抑制細(xì)胞的增殖，這可能是聯(lián)合用藥發(fā)揮更強(qiáng)抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。4.4分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為了深入探究Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用影響人腸癌Lovo細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測(cè)了相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。在凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)方面，Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控中一對(duì)關(guān)鍵的蛋白。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而阻止Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)ax是一種促凋亡蛋白，它可以形成同源二聚體，插入線粒體膜，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4不同處理組Bcl-2和Bax基因相對(duì)表達(dá)量處理組Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量Bax基因相對(duì)表達(dá)量Bax/Bcl-2比值對(duì)照組1.00±0.051.00±0.051.00±0.05Sunitinib2μmol/L0.78±0.061.35±0.081.73±0.10Sunitinib4μmol/L0.65±0.051.67±0.102.57±0.12Sunitinib8μmol/L0.52±0.041.98±0.123.81±0.15奧沙利鉑20μmol/L0.82±0.061.45±0.091.77±0.11奧沙利鉑40μmol/L0.70±0.051.78±0.112.54±0.13奧沙利鉑80μmol/L0.58±0.042.12±0.133.66±0.16Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L0.45±0.042.05±0.124.56±0.18Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L0.32±0.032.56±0.158.00±0.20Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L0.25±0.033.05±0.1812.20±0.25從表4數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)照組中Bcl-2和Bax基因相對(duì)表達(dá)量均設(shè)為1.00。Sunitinib單藥處理組和奧沙利鉑單藥處理組隨著藥物濃度的增加，Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，Bax基因相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，Bax/Bcl-2比值逐漸增大。在相同濃度下，聯(lián)合用藥組的Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量明顯低于單藥處理組，Bax基因相對(duì)表達(dá)量和Bax/Bcl-2比值明顯高于單藥處理組。例如，Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L聯(lián)合用藥組的Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.03，顯著低于Sunitinib4μmol/L單藥處理組的0.65±0.05和奧沙利鉑40μmol/L單藥處理組的0.70±0.05（P<0.05）；Bax基因相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.15，顯著高于單藥處理組（P<0.05）；Bax/Bcl-2比值達(dá)到8.00±0.20，遠(yuǎn)高于單藥處理組。將上述數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，如圖5所示，更直觀地展示不同處理組Bcl-2和Bax基因相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值的差異。圖5不同處理組Bcl-2和Bax基因相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值柱狀圖通過(guò)Westernblot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白條帶的灰度值，計(jì)算Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)于內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。從圖中可以清晰地看出，聯(lián)合用藥組的Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯低于單藥處理組，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于單藥處理組，與基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果一致。這表明Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因和蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2的抗凋亡作用，增強(qiáng)Bax的促凋亡作用，使Bax/Bcl-2比值升高，從而誘導(dǎo)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡。圖6不同處理組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的Westernblot結(jié)果1：對(duì)照組；2：Sunitinib2μmol/L處理組；3：Sunitinib4μmol/L處理組；4：Sunitinib8μmol/L處理組；5：奧沙利鉑20μmol/L處理組；6：奧沙利鉑40μmol/L處理組；7：奧沙利鉑80μmol/L處理組；8：Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L處理組；9：Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L處理組；10：Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L處理組在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)方面，CyclinD1和p21是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要蛋白。CyclinD1是G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4的激酶活性，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程；p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使Rb不能磷酸化，E2F無(wú)法釋放，從而將細(xì)胞阻滯于G1期。通過(guò)Westernblot檢測(cè)不同處理組中CyclinD1和p21蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。同樣以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白條帶的灰度值，計(jì)算CyclinD1和p21蛋白相對(duì)于內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。圖7不同處理組CyclinD1和p21蛋白表達(dá)的Westernblot結(jié)果1：對(duì)照組；2：Sunitinib2μmol/L處理組；3：Sunitinib4μmol/L處理組；4：Sunitinib8μmol/L處理組；5：奧沙利鉑20μmol/L處理組；6：奧沙利鉑40μmol/L處理組；7：奧沙利鉑80μmol/L處理組；8：Sunitinib2μmol/L+奧沙利鉑20μmol/L處理組；9：Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L處理組；10：Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L處理組從圖7可以看出，對(duì)照組中CyclinD1蛋白表達(dá)水平較高，p21蛋白表達(dá)水平較低。Sunitinib單藥處理組隨著藥物濃度的增加，CyclinD1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，p21蛋白表達(dá)水平逐漸升高。奧沙利鉑單藥處理組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的趨勢(shì)，但變化幅度相對(duì)較小。在聯(lián)合用藥組中，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用后，CyclinD1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p21蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，且明顯高于單藥處理組。例如，Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L聯(lián)合用藥組的CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著低于Sunitinib8μmol/L單藥處理組和奧沙利鉑80μmol/L單藥處理組（P<0.05），p21蛋白表達(dá)量顯著高于單藥處理組（P<0.05）。這表明Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合用藥能夠通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1和p21蛋白的表達(dá)，抑制CyclinD1-CDK4復(fù)合物的活性，增強(qiáng)p21對(duì)Cyclin-CDK復(fù)合物的抑制作用，從而將細(xì)胞更有效地阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，進(jìn)而抑制人腸癌Lovo細(xì)胞的增殖。綜上所述，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用能夠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白（如Bcl-2、Bax）以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21）的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，從而發(fā)揮協(xié)同抑制人腸癌Lovo細(xì)胞增殖的作用。五、討論5.1聯(lián)合用藥對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞作用效果分析在本研究中，通過(guò)MTT法、細(xì)胞凋亡檢測(cè)以及細(xì)胞周期分析等實(shí)驗(yàn)方法，系統(tǒng)地探究了Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的作用效果。結(jié)果顯示，無(wú)論是Sunitinib單藥、奧沙利鉑單藥還是二者聯(lián)合用藥，均能對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，但聯(lián)合用藥在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)控細(xì)胞周期等方面展現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在細(xì)胞增殖抑制方面，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的細(xì)胞增殖抑制率均逐漸升高，呈現(xiàn)出典型的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。Sunitinib單藥處理時(shí)，其抑制作用主要通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)。奧沙利鉑單藥則主要通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成鉑化后鏈間和鏈內(nèi)加合物，抑制DNA合成，從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用，抑制細(xì)胞增殖。而當(dāng)Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合使用時(shí)，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和濃度下均明顯高于相應(yīng)的單藥處理組。這表明二者聯(lián)合使用能夠從多個(gè)層面協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效果。例如，在作用48h時(shí)，Sunitinib1μmol/L單藥處理組的細(xì)胞增殖抑制率為20.56±2.34%，奧沙利鉑10μmol/L單藥處理組的細(xì)胞增殖抑制率為24.56±2.56%，而Sunitinib1μmol/L+奧沙利鉑10μmol/L聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了38.78±3.01%，顯著高于單藥處理組（P<0.05）。這種協(xié)同效應(yīng)可能是由于Sunitinib抑制腫瘤血管生成，減少了腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的細(xì)胞毒作用更加敏感；同時(shí)，奧沙利鉑抑制DNA合成，干擾了腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程，也增強(qiáng)了Sunitinib對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的阻斷效果。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方面，Hoechst法和AnnexinV-PI法檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，Sunitinib與奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥均可誘導(dǎo)人腸癌Lovo細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡效果顯著優(yōu)于單藥處理，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。正常細(xì)胞的凋亡受到嚴(yán)格的調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞往往具有抗凋亡的特性。Sunitinib單藥可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。奧沙利鉑單藥則可能通過(guò)損傷DNA，激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制，當(dāng)損傷無(wú)法修復(fù)時(shí)，激活細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。聯(lián)合用藥時(shí)，二者的協(xié)同作用使得細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控機(jī)制發(fā)生更顯著的變化。從基因和蛋白表達(dá)水平來(lái)看，聯(lián)合用藥組的Bcl-2基因和蛋白表達(dá)量明顯低于單藥處理組，Bax基因和蛋白表達(dá)量明顯高于單藥處理組，Bax/Bcl-2比值顯著增大。這表明聯(lián)合用藥能夠更有效地打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，增強(qiáng)促凋亡作用，從而誘導(dǎo)更多的腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，Sunitinib4μmol/L+奧沙利鉑40μmol/L聯(lián)合用藥組的總凋亡率為27.12±2.56%，顯著高于Sunitinib4μmol/L單藥處理組的14.45±1.56%和奧沙利鉑40μmol/L單藥處理組的16.67±1.75%（P<0.05）。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，Sunitinib單藥主要使細(xì)胞阻滯于G1期，奧沙利鉑單藥主要使細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，而Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合用藥能夠協(xié)同將細(xì)胞更有效地阻滯于G1期，抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而腫瘤細(xì)胞往往具有異常的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。Sunitinib單藥可能通過(guò)抑制CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。奧沙利鉑單藥則可能通過(guò)抑制DNA復(fù)制相關(guān)的酶活性，如DNA聚合酶等，使細(xì)胞阻滯于S期；同時(shí)，通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）的活性，使細(xì)胞周期蛋白B1（Cdc2）磷酸化受阻，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G2/M期。聯(lián)合用藥時(shí)，二者共同作用于細(xì)胞周期調(diào)控的多個(gè)環(huán)節(jié)，使得G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低。以Sunitinib8μmol/L+奧沙利鉑80μmol/L聯(lián)合用藥組為例，G1期細(xì)胞占比高達(dá)85.67±4.21%，顯著高于Sunitinib8μmol/L單藥處理組的75.67±3.23%和奧沙利鉑80μmol/L單藥處理組的40.56±1.67%（P<0.05）。這表明聯(lián)合用藥能夠更有效地干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用在抑制人腸癌Lovo細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期方面具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，相較于單藥治療，聯(lián)合用藥能夠從多個(gè)角度對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊，更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，為大腸癌的臨床治療提供了更有前景的治療策略。5.2聯(lián)合用藥作用機(jī)制探討從分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制主要涉及多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路和基因表達(dá)調(diào)控層面。在凋亡相關(guān)信號(hào)通路中，Bcl-2和Bax基因及蛋白的表達(dá)調(diào)控起到了核心作用。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，通過(guò)抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，阻止Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，從而維持細(xì)胞的存活。Bax則是促凋亡蛋白，它能夠形成同源二聚體并插入線粒體膜，促使細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究中，聯(lián)合用藥組Bcl-2基因和蛋白表達(dá)顯著降低，Bax基因和蛋白表達(dá)顯著升高，Bax/Bcl-2比值大幅增大。這表明聯(lián)合用藥能夠通過(guò)調(diào)控這兩個(gè)關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，增強(qiáng)促凋亡信號(hào)。Sunitinib可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，降低Akt的磷酸化水平，進(jìn)而減少對(duì)Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄的激活，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。奧沙利鉑則可能通過(guò)損傷DNA，激活DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路，如ATM/ATR-Chk1/Chk2信號(hào)通路，誘導(dǎo)p53蛋白的表達(dá)和活化，p53作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠上調(diào)Bax基因的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2基因的表達(dá)。二者聯(lián)合使用時(shí)，這種協(xié)同的基因表達(dá)調(diào)控作用更為顯著，從而更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路方面，CyclinD1和p21蛋白的表達(dá)調(diào)控對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響至關(guān)重要。CyclinD1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)CyclinD1-CDK4復(fù)合物形成后，CDK4被激活，使Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白釋放與它結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列與DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。p21作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使Rb蛋白不能被磷酸化，E2F無(wú)法釋放，從而將細(xì)胞阻滯于G1期。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高。Sunitinib可能通過(guò)抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，減少ERK對(duì)CyclinD1基因轉(zhuǎn)錄的激活，降低CyclinD1蛋白的表達(dá)。奧沙利鉑可能通過(guò)激活p53信號(hào)通路，p53上調(diào)p21基因的表達(dá)，使p21蛋白表達(dá)增加。聯(lián)合用藥時(shí)，這種對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的協(xié)同調(diào)控作用增強(qiáng)，更有效地抑制了CyclinD1-CDK4復(fù)合物的活性，增強(qiáng)了p21對(duì)Cyclin-CDK復(fù)合物的抑制作用，將細(xì)胞更顯著地阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，Sunitinib對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路的抑制作用，與奧沙利鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞周期阻滯的作用，也可能在聯(lián)合用藥中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。Sunitinib抑制VEGFR和PDGFR等受體酪氨酸激酶，阻斷腫瘤血管生成信號(hào)通路，減少腫瘤組織的血液供應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞處于相對(duì)缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏的微環(huán)境中。這種微環(huán)境可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，奧沙利鉑在這種微環(huán)境下更易與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成鉑化加合物，導(dǎo)致DNA損傷，激活細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，使細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，奧沙利鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，也可能減少腫瘤細(xì)胞分泌的促血管生成因子，如VEGF等，間接增強(qiáng)Sunitinib對(duì)腫瘤血管生成的抑制效果。綜上所述，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用通過(guò)多層面、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路，以及腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮顯著的協(xié)同抗腫瘤作用，為大腸癌的聯(lián)合治療提供了重要的理論依據(jù)。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明，Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用在抑制人腸癌Lovo細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞